Name: stepwise dosing protocol for increased throughput in label-free impedance-based gpcr assays
Uploaded: 2020-02-21T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Stepwise Dosing Protocol for Increased Throughput in Label-Free Impedance-Based GPCR Assays at JoVE.com

Мы благодарим Барбару Горицник и Надю Хинтеррайтер за помощь в культивированиеклето клеток и подготовку экспериментальных решений. Авторы с благодарностью признают финансовую поддержку исследовательской учебной группы 1910 "Лекарственная химия селективных лигандов GPCR", финансируемой Немецким исследовательским фондом (DFG) под грантом No 222125149. JAS особенно признательна за стипендию, предоставленную Баварской программой гендерного равенства.

1. Посев клеток на электродных массивах
ПРИМЕЧАНИЕ: Выбор макета электрода является компромиссом между чувствительностью и количеством исследуемых ячеек. Чем меньше электрод, тем более чувствительным является измерение, но чем меньше количество исследуемых ячеек. Для кл...

<ol>
	<li>Rosenbaum, D. M., Rasmussen, S. G., Kobilka, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+and+function+of+G-protein-coupled+receptors.">The structure and function of G-protein-coupled receptors.</a> Nature. 459, 356-363 (2009).</li><li>Sriram, K., Insel, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G+Protein-Coupled+Receptors+as+Targets+for+Approved+Drugs:+How+Many+Targets+and+How+Many+Drugs.">G Protein-Coupled Receptors as Targets for Approved Drugs: How Many Targets and How Many Drugs.</a> Molecular Pharmacology. 93, 251-258 (2018).</li><li>Kaitin, K. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deconstructing+the+drug+development+process:+The+new+face+of+innovation.">Deconstructing the drug development process: The new face of innovation.</a> Clinical Pharmacoly and Therapeutics. 87, 6 (2010).</li><li>Kenakin, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+assays+as+portals+to+seven-transmembrane+receptor-based+drug+discovery.">Cellular assays as portals to seven-transmembrane receptor-based drug discovery.</a> Nature reviews. Drug discovery. 8, 617-626 (2009).</li><li>Zhang, R., Xie, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tools+for+GPCR+drug+discovery.">Tools for GPCR drug discovery.</a> Acta Pharmacologica Sinica. 33, 372-384 (2012).</li><li>Scott, C. W., Peters, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+whole-cell+assays:+expanding+the+scope+of+GPCR+screening.">Label-free whole-cell assays: expanding the scope of GPCR screening.</a> Drug Discovery Today. 15, 704-716 (2010).</li><li>Giaever, I., Keese, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+fibroblast+behavior+in+tissue+culture+with+an+applied+electric+field.">Monitoring fibroblast behavior in tissue culture with an applied electric field.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 81, 3761-3764 (1984).</li><li>Giaever, I., Keese, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+morphological+biosensor+for+mammalian+cells.">A morphological biosensor for mammalian cells.</a> Nature. 366, 591-592 (1993).</li><li>Fang, Y., Ferrie, A. M., Fontaine, N. H., Mauro, J., Balakrishnan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resonant+waveguide+grating+biosensor+for+living+cell+sensing.">Resonant waveguide grating biosensor for living cell sensing.</a> Biophysical Journal. 91, 16 (2006).</li><li>Stolwijk, J. A., Matrougui, K., Renken, C. W., Trebak, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impedance+analysis+of+GPCR-mediated+changes+in+endothelial+barrier+function:+overview+and+fundamental+considerations+for+stable+and+reproducible+measurements.">Impedance analysis of GPCR-mediated changes in endothelial barrier function: overview and fundamental considerations for stable and reproducible measurements.</a> Pflugers Archiv : European Journal of Physiology. 467, 2193-2218 (2015).</li><li>Lieb, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+versus+conventional+cellular+assays:+Functional+investigations+on+the+human+histamine+H1+receptor.">Label-free versus conventional cellular assays: Functional investigations on the human histamine H1 receptor.</a> Pharmacological Research. 114, 13-26 (2016).</li><li>Stolwijk, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increasing+the+throughput+of+label-free+cell+assays+to+study+the+activation+of+G-protein-coupled+receptors+by+using+a+serial+agonist+exposure+protocol.">Increasing the throughput of label-free cell assays to study the activation of G-protein-coupled receptors by using a serial agonist exposure protocol.</a> Integrative Biology. 11, 10 (2019).</li></ol>

Этот протокол описывает метод для измерения импеданса без этикетки для определения отношения доза-реакции активации гЦКр в отсутствие или наличии конкретных антагонистов для одного и того же рецептора. Доказательство концепции этого метода было представлено в недавней публикации<sup ...

В этом отчете представлено подробное описание серийного протокола добавления, разработанного для количественной оценки активации рецептора белка, индуцированного Г-жа (GPCR) в правильно выращенных клетках по измерениям без этикетки импеданса. G белковые рецепторы (GPCRs) участвуют во множестве физиологических функций и заболеваний человека1. Из-за этого и их хорошей доступности на поверхности клетки, GPCRs являются одной из наиболее важных целей наркотиков. Эта оценка находит свое отражение в, по оценкам, число 700 утвержденных препаратов, ориентированных на GPCRs, что эквивалентно 35%-ной доле на всех продаваемых препаратах2.
Разработка новых препаратов включает в себя два центральных процесса: i) идентификацию и функциональную характеристику биологических молекул-мишеней и ii) обнаружение новых свинцовых веществ и их развитие в управляемые препараты. В обоих процессах необходимы эффективные методы количественной оценки взаимодействий с целевыми препаратами и последующего биологического реагирования. Различные этапы доклинического процесса разработки препарата используют различные методы анализа, начиная от исследований биомолекулярного взаимодействия между препаратом и мишенями, по сравнению с функциональными исследованиями клеток в культуре, экспериментами на вырезанном органном материале или целых животных. И физиологическая значимость, и биологическая сложность увеличиваются с первого до последнего3. Хотя это общая цель, чтобы свести к минимуму эксперименты на животных, фармакологические исследования с использованием изолированных органов из лабораторных животных или даже целых животных считаются неизбежными, чтобы всесторонне охарактеризовать новых кандидатов наркотиков. С точки зрения аналитического чтения, орган фармакологии исследования обеспечивают дистальный, интегративный "целостный" функциональный ответ высокой физиологической значимости. Недостатком таких экспериментов является то, что они не совместимы с высокой пропускной способностью скрининга по техническим, а также этические причины и были в значительной степени заменены исследования, основанные на культуре клеток in vitro4.
Методы количественной оценки активации GPCR в клеточных культурах включают различные химические анализы на основе этикеток, которые конкретно обнаруживают вторых посланников, состояние фосфорилирования вниз по течению сигнальных белков, транскрипционную активацию через определенные транскрипционные факторы или торговлю внутриклеточными рецепторами на основе лигандов4,5. Недостатком таких анализов на этикетке является необходимость обозначения клеток потенциально вредными красителями или радиоактивными маркерами. Это часто требует выполнения ассеа в качестве конечного определения для времени экспозиции, которое должно быть определено априори. Использование этикетки на основе конечных анализов страдает от этого очень ограниченное и предвзятое время эксперимента и риск того, что химические этикетки и зонды могут вмешиваться в регулярной физиологии клеток - потенциально незамеченным экспериментатором.
В последние годы появились анализы без этикеток для мониторинга активации GPCR, такие как методы на основе импедеданса или оптические методы, применяющие резонансные волноводы, решетки5,6. Маркировка клеток экспериментально не требуется с этими подходами. Поскольку эти физические считыватели работают на сигналах низкой амплитуды, такие методы считаются неинвазивными, они позволяют осуществлять непрерывный мониторинг клеток потенциально в режиме реального времени, а время наблюдения ограничивается только клеточной культурой, а не считывателем. Подобно считываниям из целых органов, подходы, свободные от этике, обычно сообщают о целостных реакциях клеток, далеко вниз по течению активации рецепторов, когда интеграция по всей сигнальной сети приводит к зависящим от времени, но скорее неспецифическим изменениям в морфологии клеток или перераспределению массы. В то время как impedance основе анализов измерения диэлектрической подписи изменений в форме ячейки7,8, измерения с помощью резонансных волнообразных решеток чувствительны к изменениям в рефракционном индексе на ячейке субстрата интерфейса, вытекающих из динамического перераспределения массы (DMR)9. Интегративный характер делает методы без этикетки чрезвычайно чувствительными к событиям, опосредованным рецепторами, независимо от типа (ы) белка G (Gq,Gi/0, Gs,G12/13) или q-arrestin, участвующих в сигнальном каскаде6 и хорошо подходящих для эндогенных уровней экспрессии рецептора.
В стандартном без этикетке impedance основе анализ клетки adherently выращены в нескольких колодцев с копланарной пленки электродов, отложенных на дне каждого колодца10. Эти электродные массивы соединены с анализатором импеданса, и реакции клеток на экспериментальный стимул регистрируются из отдельных скважин с помощью временных показаний импеданса. В типичном асссе GPCR лиганд добавляется в индивидуально различных концентрациях к каждому отдельному человеку. Лиганд-индуцированные изменения в курсе времени impedance после этого проанализированы по отношению к характерным характеристикам кривой such as максимальная изменение сигнала, зона под кривой, изменение сигнала в пределах, котор дали интервал времени или наклон кривой на затем указанном пункте времени, для того чтобы количественно количественно потенции ligand и эффективности11.
Стоимость электродных массивов может ограничить применение этого метода в кампаниях скрининга высокой пропускной силы (HTS). Кроме того, с увеличением числа образцов, которые должны следовать параллельно, количество индивидуальных измерений увеличивается и тем самым уменьшает разрешение времени для каждого колодца постепенно - даже для современных многоканальных записей. В таких условиях быстрая и переходная реакция клеток может избежать измерения. Кроме того, обычный хорошо - один подход концентрации налагает значительное время и фактор затрат на perfused орган-на-чипе или тело-на-чип события в отношении их пригодности в ligand-GPCR анализа взаимодействия.
По этой причине мы разработали пошаговый протокол дозирования, который позволяет записывать полную кривую реакции на дозу активации гЦКр в культурных клеточных монослойах, постоянно отслеживая препятствие одной скважины, в то время как концентрация агониста увеличивается поэтапно. Протокол последовательного агониста значительно увеличивает пропускную стоимость в скважине от одной концентрации до 10 или более концентраций, как показано на текущем примере клеток U-373 MG человека, которые эндогенно выражают рецептор гистамина 1 (H1R). Таким образом, метод имеет потенциал для значительного улучшения пропускной связи в безэтикетки доза-ответ исследований, в то время как разрешение времени сохраняется на инструментальной максимум.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>B&#252;rker counting chamber</td>
			<td>Marienfeld (Lauda-K&#246;nigshofen, Germany)</td>
			<td>640210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cell culture flasks 25 cm2</td>
			<td>Greiner bio-one (Frickenhausen, Germany)</td>
			<td>690175</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell incubator (Heraeus Function Line BB15)</td>
			<td>Thermo Scientific (Darmstadt, Germany)</td>
			<td>\</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge (Heraeus 1S-R)</td>
			<td>Thermo Scientific (Darmstadt, Germany)</td>
			<td>\</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diphenhydramine hydrochloride</td>
			<td>Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany)</td>
			<td>D3630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eagle&#39;s Minimum Essential Medium with 4.5 g/L D-Glucose and 2.2 g/L NaHCO3</td>
			<td>Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany)</td>
			<td>D5671</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Impedance Instrument (ECIS Z&#952;)</td>
			<td>Applied BioPhysics Inc. (Troy, NY, USA)</td>
			<td>\</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-well electrode Arrays (8W1E PET)</td>
			<td>Applied BioPhysics Inc. (Troy, NY, USA)</td>
			<td>\</td>
			<td>PET base with 0.049 mm2 working electrode and ~50 mm2 counter electrode (gold)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well electrode arrays (96W1E+ PET)</td>
			<td>Applied BioPhysics Inc. (Troy, NY, USA)</td>
			<td>\</td>
			<td>PET base with two electrodes (gold) with 0.256 mm2 total electrode area</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal calf serum (FCS)</td>
			<td>Biochrom (Berlin, Germany)</td>
			<td>S0615</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histamine dihydrochloride</td>
			<td>Carl Roth (Karlsruhe, Germany)</td>
			<td>4017.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar flow hood (Herasafe, KS 12)</td>
			<td>Thermo Scientific (Darmstadt, Germany)</td>
			<td>51022515</td>
			<td>class II safety cabinet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz&#39; L-15 medium</td>
			<td>Thermo Scientific (Darmstadt, Germany)</td>
			<td>21083-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany)</td>
			<td>G7513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette large (100 - 1000 &#181;L)</td>
			<td>Brandt (Wertheim, Germany)</td>
			<td>704780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette large (20 - 200 &#181;L)</td>
			<td>Brandt (Wertheim, Germany)</td>
			<td>704778</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope (phase contrast, Nikon Diaphot)</td>
			<td>Nikon (D&#252;sseldorf, Germany)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin</td>
			<td>Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany)</td>
			<td>P0781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany)</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette, serological</td>
			<td>Greiner bio-one (Frickenhausen, Germany)</td>
			<td>607 180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettor (accu-jet pro)</td>
			<td>Brandt (Wertheim, Germany)</td>
			<td>26300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany)</td>
			<td>T4174</td>
			<td>in PBS with 1 mM EDTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube, 15 mL</td>
			<td>Greiner bio-one (Frickenhausen, Germany)</td>
			<td>188 271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube, 50 mL</td>
			<td>Greiner bio-one (Frickenhausen, Germany)</td>
			<td>210 261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U-373 MG cells</td>
			<td>ATCC (Rockville, MD, USA)</td>
			<td>ATCC HTB-17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>water bath (TW21)</td>
			<td>Julabo (Seelbach, Germany)</td>
			<td>\</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

stepwise dosing protocol for increased throughput in label-free impedance-based gpcr assays

Без этикетки impedance основе анализы все чаще используются для неинвазивного изучения лиганд-индуцированной активации GPCR в экспериментах клеточной культуры. Этот подход обеспечивает мониторинг клеток в режиме реального времени с разрешением времени, зависящим от устройства, до нескольких десятков миллисекунд, и он полностью автоматизирован. Однако, когда число образцов становится высоким (например, доза-ответ исследований для различных лигандов), стоимость одноразовых электродов массивов, а также доступное разрешение времени для последовательных хорошо хорошо записи могут стать ограниченными. Таким образом, мы представляем серийный протокол дополнения агониста, который имеет потенциал для значительного увеличения выпуска без этикетки GPCR анализов. Используя протокол последовательного добавления агониста, агонист GPCR добавляется последовательно в увеличении концентраций к одноклеточному слою при постоянном мониторинге импеданса образца (агонистовый режим). С помощью этого последовательного подхода теперь можно установить полную кривую реакции дозы для агониста GPCR только из одного слоя клеток. Протокол последовательного агониста применяется к различным типам соединения GPCR, Gq Gi/0 или Gs и совместим с рекомбинантными и эндогенными уровнями экспрессии исследуемого рецептора. Блокирование рецепторов антагонистами GPCR также оценивается (антагонистский режим).

Типичная схема для подготовки различных агонистовых решений показана для эксперимента с использованием 8-колодных электродных массивов с гистамином в качестве агониста в таблицах 1-4. Таблица 1 и таблица 2 представляют объемы и концентрации для эксперимента ?...

Watch this Scientific Journal Video about Stepwise Dosing Protocol for Increased Throughput in Label-Free Impedance-Based GPCR Assays at JoVE.com

Stepwise Dosing Protocol for Increased Throughput in Label-Free Impedance-Based GPCR Assays

Этот протокол демонстрирует в режиме реального времени запись полной дозы-реакции отношений для агониста индуцированной активации GPCR из одного слоя клеток, выращенных на одном микроэлектроде с использованием без этикетки импеданса измерений. Новая схема дозирования значительно увеличивает пропускную схему без потери во времени разрешения.

Протокол поэтапного дозирования для увеличения пропускной записи в label-Free Impedance основе GPCR анализы

Label-free impedance-based assays are increasingly used to non-invasively study ligand-induced GPCR activation in cell culture experiments. The approach ...

Этот протокол позволяет записывать полную функциональную реакцию на концентрацию агониста GPCR из одной популяции клеток и предоставляет подробную агонистную характеристику даже для низких номеров выборки клеток. Основным преимуществом серийного досирования является увеличение пропускной способности, поскольку одной колодец достаточно для полного анализа реакции на концентрацию. Этот метод хорошо подходит для изучения одной трансдукции в редких и сложных биологических моделях, таких как форматы орган-на-чипе в закрытых микрофлюидных контейнерах.Протокол выполнения не трудно выполнить, при условии наличия соответствующего оборудования. Подготовка различных решений GPCR ligand при правильной концентрации является ключом к успеху. Майкл Скиба, аспирант, и Энн Милднер, студентка нашей лаборатории, продемонстрируют процедуру.Для посева клеток на электродных массивах добавьте соответствующую концентрацию клеток в колодцы каждого электродного массива и позвольте клеткам однородно осесть на днища скважины в течение 10-15 минут при комнатной температуре. После по крайней мере 36 часов в стандартном инкубаторе культуры клеток при 37 градусах по Цельсию и 5%углекислом газе, осмотрите слои клеток с помощью фазово-контрастной микроскопии, чтобы обеспечить полное покрытие каждого электрода клетками. Затем замените среду клеточной культуры в каждом хорошо с соответствующим объемом предварительно разогретой, без сыворотки среды.Чтобы начать запись о неуступерии, поместите электродный массив в держатель соединительной решетки анализатора неустумности и подтвердите надлежащий низкий контакт между электродами и анализатором. Выберите тип электрода и/или формат мульти-хорошо в пользовательском интерфейсе программного обеспечения. Если доступны режимы получения одночастотных данных и количество проанализированных скважин является низким или разрешение времени не является критическим, выберите несколько частотных записей.Для обеспечения максимального разрешения времени выберите единую частоту мониторинга. Затем начните сбор данных о времени и выберите папку данных для сохранения данных. Показания неуступаемого числа частот будут записаны на каждом колодец Чтобы инициировать протокол серийного добавления в агонистном режиме для восьми-хорошо массива, добавьте 30 микролитров наименьшей концентрации агониста интереса к клеткам.Затем позвольте клеткам реагировать и равноденствия в течение предопределенного периода времени, прежде чем добавить 30 микролитров следующей самой высокой концентрации, пока не будет добавлено каждое последовательное разбавление агониста. Чтобы проанализировать данные, вычесть извечок последней точки данных перед первым добавлением агонистного решения и установить время добавления нуля для нормализации значений неуступаемности. Участок время курс нормализованного impedance, и построить отдельные курсы времени для выявления maxima в impedance после каждого шага добавления.Составьте лист данных с этими значениями и сшипите значения изменения максимального импульса как функцию агонистической концентрации. Затем используйте режим установки данных для определения полу максимальных эффективных концентраций и максимальной реакции с помощью четырех параметров логистической модели. В этом репрезентативном эксперименте, 10 решений с увеличением концентрации гистамина были последовательно добавлены в клетки каждые 15 минут, и изменение в impedance измеряется в каждый момент времени.Затем изменения в неуступляемом режиме можно было бы рассматривать как функцию концентрации гистамина и функцию переноса четырех параметров логистической модели, установленной на экспериментальные точки данных из семи скважин. Для учета возможных рецепторов гистамина downregulation, десенсибилизации клеток, или чрезмерной стимуляции, диапазон данных для анализа может быть уменьшена, как показано для этого одного серийного досирования эксперимента. Затем к данным можно применить трехка параметрами, обеспечивая полу максима эффективную концентрацию 0,75 плюс-минус 0,12 микромолара для этого анализа.Добавление антагониста рецепторов гистамина димедрол за 20 минут до первого гистамина приводит к задержке увеличения неуступаемности в схеме серийного досирования, что соответствует необходимости более высокого агониста, чтобы вызвать реакцию клеток. В отношении реакции дозы эффект антагониста выражается как правый сдвиг кривых, соответствующий увеличению полу максимаальной эффективной концентрации, при условии, что антагонист является конкурентоспособным лигандом по отношению к агонисту. Успешное применение схемы серийного досирования технически просто, но требует продуманного планирования, так как выполнить все этапы с правильным временем сложно.Серийная досирование проложила путь для проведения исследований реакции на концентрацию с другими системами считывания, которые ограничены в отношении числа образцов, контролируемых параллельно. Особые преимущества серийного дозирования позволяют изучать опосредованную рецепторами трансдукцию сигнала с совершенно новыми считываниями, чувствительными к другим фенотипическим изменениям, таким как цитомеханика. Пожалуйста, носите перчатки и очки при подготовке фондовых растворов агониста рецепторов, так как они могут быть опасны при вдыхании или проглатывании.

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Pharmacology

Biochemistry

Unit 1

Pharmacodynamics

SCIENTISTS IN ACTION

Automated Acoustic Dispensing for the Serial Dilution of Peptide Agonists in Potency Determination Assays

Автоматизированная Акустическая дозирования для серийного разведения пептидные агонисты в Potency Определение Assays

As with small molecule drug discovery, screening for peptide agonists requires the serial dilution of peptides to produce concentration-response curves. ...

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

Простой метод для высокой пропускной способности химического скрининга в Caenorhabditis Elegans

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

In Vitro Ubiquitination and Deubiquitination Assays of Nucleosomal Histones

В Vitro Увселицивание и Deubiquitination Анализы Нуклеосомальных Хистонов

Ubiquitination is a post-translational modification that plays important roles in various signaling pathways and is notably involved in the coordination ...

Monitoring GPCR-&#946;-arrestin1/2 Interactions in Real Time Living Systems to Accelerate Drug Discovery

Monitoring GPCR-ÃƒÅ½Ã‚Â²-arrestin1/2 Interactions in Real Time Living Systems to Accelerate Drug Discovery

Мониторинг GPCR-я-arrestin1/2 Взаимодействия в режиме реального времени живых систем для ускорения обнаружения наркотиков

Interactions between G-protein coupled receptors (GPCRs) and &#946;-arrestins are vital processes with physiological implications of great importance. ...

Label-Free Immunoprecipitation Mass Spectrometry Workflow for Large-scale Nuclear Interactome Profiling

Без этикетки Иммунопрецитис Масса Спектромтертрия Рабочий процесс для крупномасштабного ядерного взаимодействия Профилирование

Immunoaffinity purification mass spectrometry (IP-MS) has emerged as a robust quantitative method of identifying protein-protein interactions. This ...

A Rapidly Incremented Tethered-Swimming Maximal Protocol for Cardiorespiratory Assessment of Swimmers

Быстро приращенный привязной плавания Максимальный протокол для кардиореспираторной оценки пловцов

Incremental exercise testing is the standard means of assessing cardiorespiratory capacity of endurance athletes. While the maximal rate of oxygen ...

Creating Highly Specific Chemically Induced Protein Dimerization Systems by Stepwise Phage Selection of a Combinatorial Single-Domain Antibody Library

Создание высокоспецифических химически индуцированных систем димеризации белка по шагу Phage Выбор комбинаторных однодоменных антител библиотеки

Protein dimerization events that occur only in the presence of a small-molecule ligand enable the development of small-molecule biosensors for the ...

Strategic Screening and Characterization of the Visual GPCR-mini-G Protein Signaling Complex for Successful Crystallization

Стратегический скрининг и характеристика визуального GPCR-мини-G Белковый сигнальный комплекс для успешной кристаллизации

The key to determining crystal structures of membrane protein complexes is the quality of the sample prior to crystallization. In particular, the choice ...

Parallel Interrogation of &#946;-Arrestin2 Recruitment for Ligand Screening on a GPCR-Wide Scale using PRESTO-Tango Assay

Parallel Interrogation of ÃƒÅ½Ã‚Â²-Arrestin2 Recruitment for Ligand Screening on a GPCR-Wide Scale using PRESTO-Tango Assay

Параллельный допрос по набору в лигунд-2 для скрининга в Лиганде по шкале GPCR с использованием PRESTO-Tango Assay

As the largest and most versatile gene superfamily and mediators of a gamut of cellular signaling pathways, G-protein-coupled receptors (GPCRs) represent ...

In Vitro Characterization of Histone Chaperones using Analytical, Pull-Down and Chaperoning Assays

In Vitro Characterization of Histone Chaperones using Analytical, Pull-Down and Chaperoning Assays

В пробирке Характеристика гистоновых шаперонов с использованием аналитических, вытягивающих и шаперонных анализов

Histone proteins associate with DNA to form the eukaryotic chromatin. The basic unit of chromatin is a nucleosome, made up of a histone octamer consisting ...