Name: stepwise dosing protocol for increased throughput in label-free impedance-based gpcr assays
Uploaded: 2020-02-21T13:00:00
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Agradecemos a Barbara Goricnick y Nadja Hinterreiter por su ayuda con el cultivo celular y la preparación de soluciones experimentales. Los autores agradecen el apoyo financiero del Research Training Group 1910 "Medicina química de ligandos GPCR selectivos" financiado por la Fundación Alemana de Investigación (DFG) bajo el número de subvención 222125149. JAS está particularmente agradecido por una beca otorgada por el Programa Bávaro de Igualdad de Género.

1. Sembrado celular en matrices de electrodos
NOTA: La selección del diseño del electrodo es un equilibrio entre la sensibilidad y el número de células en estudio. Cuanto más pequeño es el electrodo, más sensible es la medida, pero cuanto menor es el número de células en estudio. Para las células que muestran fuertes fluctuaciones de impedancia a lo largo del tiempo en condiciones basales, son preferibles electrodos más grandes o interdigitados.
<ol><li>Precaliente todas las soluc...

<ol>
	<li>Rosenbaum, D. M., Rasmussen, S. G., Kobilka, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+and+function+of+G-protein-coupled+receptors.">The structure and function of G-protein-coupled receptors.</a> Nature. 459, 356-363 (2009).</li><li>Sriram, K., Insel, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G+Protein-Coupled+Receptors+as+Targets+for+Approved+Drugs:+How+Many+Targets+and+How+Many+Drugs.">G Protein-Coupled Receptors as Targets for Approved Drugs: How Many Targets and How Many Drugs.</a> Molecular Pharmacology. 93, 251-258 (2018).</li><li>Kaitin, K. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deconstructing+the+drug+development+process:+The+new+face+of+innovation.">Deconstructing the drug development process: The new face of innovation.</a> Clinical Pharmacoly and Therapeutics. 87, 6 (2010).</li><li>Kenakin, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+assays+as+portals+to+seven-transmembrane+receptor-based+drug+discovery.">Cellular assays as portals to seven-transmembrane receptor-based drug discovery.</a> Nature reviews. Drug discovery. 8, 617-626 (2009).</li><li>Zhang, R., Xie, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tools+for+GPCR+drug+discovery.">Tools for GPCR drug discovery.</a> Acta Pharmacologica Sinica. 33, 372-384 (2012).</li><li>Scott, C. W., Peters, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+whole-cell+assays:+expanding+the+scope+of+GPCR+screening.">Label-free whole-cell assays: expanding the scope of GPCR screening.</a> Drug Discovery Today. 15, 704-716 (2010).</li><li>Giaever, I., Keese, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+fibroblast+behavior+in+tissue+culture+with+an+applied+electric+field.">Monitoring fibroblast behavior in tissue culture with an applied electric field.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 81, 3761-3764 (1984).</li><li>Giaever, I., Keese, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+morphological+biosensor+for+mammalian+cells.">A morphological biosensor for mammalian cells.</a> Nature. 366, 591-592 (1993).</li><li>Fang, Y., Ferrie, A. M., Fontaine, N. H., Mauro, J., Balakrishnan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resonant+waveguide+grating+biosensor+for+living+cell+sensing.">Resonant waveguide grating biosensor for living cell sensing.</a> Biophysical Journal. 91, 16 (2006).</li><li>Stolwijk, J. A., Matrougui, K., Renken, C. W., Trebak, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impedance+analysis+of+GPCR-mediated+changes+in+endothelial+barrier+function:+overview+and+fundamental+considerations+for+stable+and+reproducible+measurements.">Impedance analysis of GPCR-mediated changes in endothelial barrier function: overview and fundamental considerations for stable and reproducible measurements.</a> Pflugers Archiv : European Journal of Physiology. 467, 2193-2218 (2015).</li><li>Lieb, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+versus+conventional+cellular+assays:+Functional+investigations+on+the+human+histamine+H1+receptor.">Label-free versus conventional cellular assays: Functional investigations on the human histamine H1 receptor.</a> Pharmacological Research. 114, 13-26 (2016).</li><li>Stolwijk, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increasing+the+throughput+of+label-free+cell+assays+to+study+the+activation+of+G-protein-coupled+receptors+by+using+a+serial+agonist+exposure+protocol.">Increasing the throughput of label-free cell assays to study the activation of G-protein-coupled receptors by using a serial agonist exposure protocol.</a> Integrative Biology. 11, 10 (2019).</li></ol>

Este protocolo describe un método para mediciones de impedancia sin etiquetas para determinar la relación dosis-respuesta de activación GPCR inducida por agonistas en ausencia o presencia de antagonistas específicos para el mismo receptor. La prueba de concepto de este método se presentó en una publicación reciente12. Hasta nuestro conocimiento, es el primer estudio que describe el establecimiento de una curva de dosis-respuesta completa de activación GPCR mediada por agonistas utilizando ...

Este informe presenta una descripción detallada de un protocolo de adición en serie desarrollado para la cuantificación de la activación del receptor acoplado a proteínaS G inducida por ligandos (GPCR) en células cultivadas adherentemente mediante mediciones de impedancia sin etiquetas. Los receptores acoplados a proteínas G (GPCR) participan en una multitud de funciones fisiológicas y enfermedades humanas1. Debido a esto y su buena accesibilidad en la superficie celular, los PCPR son uno de los objetivos de drogas más importantes. Esta evaluación se refleja en un número estimado de 700 medicamentos aprobados dirigidos a los GPCR, equivalente a una cuota del 35 % en todos los medicamentos comercializados2.
El desarrollo de nuevos fármacos comprende dos procesos centrales: i) la identificación y caracterización funcional de las moléculas diana biológicas, y ii) el descubrimiento de nuevas sustancias de plomo y su desarrollo en fármacos administrables. En ambos procesos, se requieren métodos eficientes para evaluar cuantitativamente las interacciones farmacológicas y la posterior respuesta biológica posterior. Diferentes etapas del proceso de desarrollo de fármacos preclínicos utilizan diferentes métodos de análisis que van desde estudios de interacción biomolecular entre fármaco y objetivo, sobre estudios funcionales sobre células en cultivo, hasta experimentos con material orgánico extirpado o animales enteros. Tanto el significado fisiológico como la complejidad biológica aumentan de los3primeros a los segundos. Aunque el objetivo general es minimizar los experimentos en animales, los estudios farmacológicos que utilizan órganos aislados de animales de laboratorio o incluso animales enteros se consideran inevitables para caracterizar exhaustivamente a los nuevos candidatos a fármacos. En términos de lectura analítica, los estudios farmacológicos de órganos proporcionan una respuesta funcional distal e integradora "holística" de mayor relevancia fisiológica. Un inconveniente de estos experimentos es que no son compatibles con el cribado de alto rendimiento por razones técnicas y éticas y han sido sustituidos en gran medida por estudios basados en el cultivo celular in vitro4.
Los métodos para cuantificar la activación de GPCR en cultivos celulares incluyen diferentes ensayos químicos basados en etiquetas, que detectan específicamente a los segundos mensajeros, el estado de fosforilación de las proteínas de señalización aguas abajo, la activación transcripcional a través de ciertos factores de transcripción o el tráfico de receptores intracelulares inducido por ligando4,5. Un inconveniente de estos ensayos basados en etiquetas es la necesidad de etiquetar las células con colorantes potencialmente dañinos o marcadores radiactivos. Esto a menudo requiere ejecutar el ensayo como una determinación de punto final para un tiempo de exposición que debe especificarse a priori. El uso de ensayos de punto final basados en etiquetas sufre de este momento muy limitado y sesgado del experimento y el riesgo de que las etiquetas químicas y las sondas puedan interferir con la fisiología celular regular, potencialmente desapercibida para el experimentador.
En los últimos años, han surgido ensayos sin etiquetas para el seguimiento de la activación de GPCR, como técnicas basadas en impedancia o métodos ópticos que aplican rejillas de guía de onda resonantes5,6. El etiquetado de las células no es necesario experimentalmente con estos enfoques. Como estas lecturas físicas operan en señales de baja amplitud, estos métodos se consideran no invasivos, permiten la supervisión continua de células potencialmente en tiempo real y el tiempo de observación sólo está limitado por el cultivo celular no por la lectura. Al igual que las lecturas de órganos enteros, los enfoques sin etiquetas suelen informar sobre las respuestas celulares holísticas, muy por debajo de la activación del receptor cuando la integración a lo largo de toda la red de señalización conduce a cambios dependientes del tiempo, sino más bien poco específicos en la morfología celular o la redistribución masiva. Mientras que los ensayos basados en impedancia miden la firma dieléctrica de los cambios en la forma de la célula7,8, las mediciones que utilizan rejillas de guía de onda resonantes son sensibles a los cambios en el índice de refracción en la interfaz de sustrato celular que se derivan de la redistribución dinámica de masa (DMR)9. El carácter integrador hace que los métodos libres de etiquetas sean extremadamente sensibles a los eventos mediados por receptores independientemente del tipo(s) de proteína G (Gq, Gi/0, Gs, G12/13)o -arrestina implicada en la cascada de señalización6 y adecuada para los niveles de expresión endógena del receptor.
En un ensayo estándar basado en impedancia sin etiquetas, las células se cultivan adherentemente en placas de varios pocillos con electrodos coplanares de película de oro depositados en la parte inferior de cada pozo10. Estas matrices de electrodos están conectadas a un analizador de impedancia y las respuestas celulares a un estímulo experimental se registran a partir de pozos individuales mediante lecturas de impedancia resueltas en el tiempo. En un ensayo típico de GPCR se añade un ligando en concentraciones individualmente diferentes a cada individuo bien. Los cambios inducidos por ligando en el curso de tiempo de impedancia se analizan con respecto a las características de la curva, como el cambio máximo de señal, el área bajo la curva, el cambio de señal dentro de un intervalo de tiempo determinado o la pendiente de la curva en un punto de tiempo especificado, con el fin de cuantificar la potencia y eficacia del ligando11.
El costo de las matrices de electrodos puede limitar la aplicación de esta técnica en campañas de detección de alto rendimiento (HTS). Además, con un número cada vez mayor de muestras a seguir en paralelo, el número de mediciones individuales aumenta y, por lo tanto, reduce la resolución de tiempo disponible para cada pocal gradualmente, incluso para las grabaciones multicanal de última generación. En tales condiciones, las respuestas celulares rápidas y transitorias pueden escapar de la medición. Además, el pozo convencional – un enfoque de concentración impone un factor de tiempo y costo significativo a los desarrollos de órgano en chip o cuerpo en chip perfundidos con respecto a su idoneidad en el análisis de interacción ligando-GPCR.
Por esta razón, desarrollamos un protocolo de dosificación escalonada que permite el registro de curvas de dosis-respuesta completa de activación GPCR inducida por ligando en monocapas celulares cultivadas mediante el monitoreo continuo de la impedancia de un solo pozo mientras que la concentración agonista se incrementa escalonadamente. El protocolo de adición agonista en serie aumenta significativamente el rendimiento por pozo de una concentración a 10 o más concentraciones, como se muestra en el ejemplo actual de células humanas U-373 MG, que endógenamente expresan el receptor de histamina 1 (H1R). Por lo tanto, el método tiene el potencial de mejorar significativamente el rendimiento en estudios de dosis-respuesta sin etiquetas, mientras que la resolución de tiempo se mantiene al máximo instrumental.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>B&#252;rker counting chamber</td>
			<td>Marienfeld (Lauda-K&#246;nigshofen, Germany)</td>
			<td>640210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cell culture flasks 25 cm2</td>
			<td>Greiner bio-one (Frickenhausen, Germany)</td>
			<td>690175</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell incubator (Heraeus Function Line BB15)</td>
			<td>Thermo Scientific (Darmstadt, Germany)</td>
			<td>\</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge (Heraeus 1S-R)</td>
			<td>Thermo Scientific (Darmstadt, Germany)</td>
			<td>\</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diphenhydramine hydrochloride</td>
			<td>Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany)</td>
			<td>D3630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eagle&#39;s Minimum Essential Medium with 4.5 g/L D-Glucose and 2.2 g/L NaHCO3</td>
			<td>Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany)</td>
			<td>D5671</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Impedance Instrument (ECIS Z&#952;)</td>
			<td>Applied BioPhysics Inc. (Troy, NY, USA)</td>
			<td>\</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-well electrode Arrays (8W1E PET)</td>
			<td>Applied BioPhysics Inc. (Troy, NY, USA)</td>
			<td>\</td>
			<td>PET base with 0.049 mm2 working electrode and ~50 mm2 counter electrode (gold)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well electrode arrays (96W1E+ PET)</td>
			<td>Applied BioPhysics Inc. (Troy, NY, USA)</td>
			<td>\</td>
			<td>PET base with two electrodes (gold) with 0.256 mm2 total electrode area</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal calf serum (FCS)</td>
			<td>Biochrom (Berlin, Germany)</td>
			<td>S0615</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histamine dihydrochloride</td>
			<td>Carl Roth (Karlsruhe, Germany)</td>
			<td>4017.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar flow hood (Herasafe, KS 12)</td>
			<td>Thermo Scientific (Darmstadt, Germany)</td>
			<td>51022515</td>
			<td>class II safety cabinet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz&#39; L-15 medium</td>
			<td>Thermo Scientific (Darmstadt, Germany)</td>
			<td>21083-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany)</td>
			<td>G7513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette large (100 - 1000 &#181;L)</td>
			<td>Brandt (Wertheim, Germany)</td>
			<td>704780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette large (20 - 200 &#181;L)</td>
			<td>Brandt (Wertheim, Germany)</td>
			<td>704778</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope (phase contrast, Nikon Diaphot)</td>
			<td>Nikon (D&#252;sseldorf, Germany)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin</td>
			<td>Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany)</td>
			<td>P0781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany)</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette, serological</td>
			<td>Greiner bio-one (Frickenhausen, Germany)</td>
			<td>607 180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettor (accu-jet pro)</td>
			<td>Brandt (Wertheim, Germany)</td>
			<td>26300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany)</td>
			<td>T4174</td>
			<td>in PBS with 1 mM EDTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube, 15 mL</td>
			<td>Greiner bio-one (Frickenhausen, Germany)</td>
			<td>188 271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube, 50 mL</td>
			<td>Greiner bio-one (Frickenhausen, Germany)</td>
			<td>210 261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U-373 MG cells</td>
			<td>ATCC (Rockville, MD, USA)</td>
			<td>ATCC HTB-17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>water bath (TW21)</td>
			<td>Julabo (Seelbach, Germany)</td>
			<td>\</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

stepwise dosing protocol for increased throughput in label-free impedance-based gpcr assays

Los ensayos basados en impedancia sin etiquetas se utilizan cada vez más para estudiar de forma no invasiva la activación de GPCR inducida por ligandos en experimentos de cultivo celular. El enfoque proporciona supervisión de celdas en tiempo real con una resolución de tiempo dependiente del dispositivo hasta varias decenas de milisegundos y está altamente automatizado. Sin embargo, cuando los números de muestra son altos (por ejemplo, estudios de dosis-respuesta para varios ligandos diferentes), el costo de las matrices de electrodos desechables, así como la resolución de tiempo disponible para grabaciones secuenciales bien por pozo pueden llegar a ser limitador. Por lo tanto, aquí presentamos un protocolo de adición agonista en serie que tiene el potencial de aumentar significativamente la salida de ensayos GPCR sin etiquetas. Usando el protocolo de adición agonista en serie, un agonista GPCR se agrega secuencialmente en el aumento de las concentraciones a una sola capa de celda mientras se supervisa continuamente la impedancia de la muestra (modo agonista). Con este enfoque en serie, ahora es posible establecer una curva de dosis-respuesta completa para un agonista GPCR a partir de una sola capa de células. El protocolo de adición agonista en serie es aplicable a diferentes tipos de acoplamiento GPCR, Gq Gi/0 o Gs y es compatible con los niveles de expresión recombinantes y endógenos del receptor en estudio. El bloqueo de receptores por los antagonistas de GPCR también es evaluable (modo antagonista).

Un esquema típico para la preparación de las diversas soluciones agonistas se muestra para un experimento utilizando matrices de electrodos de 8 pozos con histamina como agonista en las Tablas 1-4. La Tabla 1 y la Tabla 2 presentan volúmenes y concentraciones para un experimento utilizando el modo de adición 1 (cf., Figura 1), mientras que la Tabla 3 y la Tabla 4 presentan volúmenes y c...

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Stepwise Dosing Protocol for Increased Throughput in Label-Free Impedance-Based GPCR Assays

Este protocolo demuestra el registro en tiempo real de las relaciones de dosis-respuesta completa para la activación gpCR inducida por agonistas a partir de una sola capa de células cultivada en un solo microelectrodo mediante mediciones de impedancia sin etiquetas. El nuevo esquema de dosificación aumenta significativamente el rendimiento sin pérdida en la resolución de tiempo.

Protocolo de dosificación escalonada para aumentar el rendimiento en ensayos GPCR basados en impedancia sin etiquetas

Label-free impedance-based assays are increasingly used to non-invasively study ligand-induced GPCR activation in cell culture experiments. The approach ...

Este protocolo permite el registro de una relación de respuesta de concentración funcional completa del agonista GPCR de una población celular y proporciona una caracterización agonista detallada incluso para números de muestra de células bajos. La principal ventaja de la dosificación en serie es el aumento del rendimiento, ya que un único pozo es suficiente para un análisis completo de la respuesta de concentración. Esta técnica es adecuada para estudiar una sola transducción en modelos biológicos raros y complejos, como formatos de órgano en chip en envases microfluídicos cerrados.El protocolo no es difícil de realizar, siempre que el equipo adecuado esté disponible. Preparar las diversas soluciones de ligando GPCR en la concentración correcta es la clave del éxito. Michael Skiba, un estudiante de posgrado, y Anne Mildner, una estudiante de pregrado, de nuestro laboratorio demostrarán el procedimiento.Para la siembra celular en las matrices de electrodos, agregue la concentración adecuada de células a los pozos de cada matriz de electrodos, y permita que las células se asienten homogéneamente en los fondos de los pozos durante 10 a 15 minutos a temperatura ambiente. Después de al menos 36 horas en una incubadora de cultivo celular estándar a 37 grados Celsius y 5%dióxido de carbono, inspeccione las capas celulares por microscopía de contraste de fase para asegurar una cobertura completa de cada electrodo con células. A continuación, reemplace el medio de cultivo celular en cada pozo con el volumen adecuado de medio precalecido y libre de suero.Para iniciar una grabación de impedancia, coloque la matriz de electrodos en el soporte de la matriz de conexión del analizador de impedancia y confirme un contacto adecuado de baja impedancia entre los electrodos y el analizador de impedancia. Seleccione el tipo de electrodo y/o el formato multi-pozo en la interfaz de usuario del software. Si hay modos de adquisición de datos de frecuencia única y múltiple disponibles y el número de pozos que se analizarán es bajo o la resolución de tiempo no es crítica, seleccione varias grabaciones de frecuencia.Para garantizar una resolución de tiempo máxima, seleccione una única frecuencia de supervisión. A continuación, inicie la adquisición de los datos del curso de tiempo y seleccione la carpeta de datos para dónde guardar los datos. Las lecturas de impedancia se registrarán en el número especificado de frecuencias para cada pozo Para iniciar el protocolo de adición en serie en el modo agonista para una matriz de ocho pozos, agregue 30 microlitros de la concentración más baja del agonista de interés para las células.Luego deje que las células respondan y equilibren durante el período de tiempo predefinido antes de agregar 30 microlitros de la siguiente concentración más alta hasta que se haya añadido cada dilución en serie del agonista. Para analizar los datos, reste la impedancia del último punto de datos antes de la primera adición de la solución agonista y establezca el tiempo de adición cero para normalizar los valores de impedancia. Trazar el curso de tiempo de impedancia normalizada y trazar los cursos de tiempo individuales para identificar la máxima en impedancia después de cada paso de adición.Componga una hoja de datos con estos valores y trace los valores del cambio de impedancia máxima en función de la concentración agonista. A continuación, utilice una rutina de ajuste de datos para determinar las concentraciones efectivas medio máximas y la respuesta máxima utilizando el modelo logístico de cuatro parámetros. En este experimento representativo, se añadieron secuencialmente a las células 10 soluciones con concentraciones crecientes de histamina cada 15 minutos, y el cambio en la impedancia se midió en cada punto de tiempo.Los cambios de impedancia podrían trazarse en función de la concentración de histamina y la función de transferencia de un modelo logístico de cuatro parámetros instalado en los puntos de datos experimentales de siete pozos. Para tener en cuenta la posible reducción del receptor de histamina, la desensibilización celular o la sobreestimulación, el rango de datos para el análisis se puede reducir, como se muestra para este experimento de dosificación en serie único. La optimización de tres parámetros se puede aplicar a los datos, proporcionando una concentración efectiva medio máxima de 0,75 más o menos 0,12 micromolares para este análisis.La adición del antagonista de la histamina difenhidramina antagonista 20 minutos antes de la primera histamina resulta en un aumento retardado de la impedancia dentro del esquema de dosificación en serie, correspondiente a la necesidad de un agonista más alto para obtener una respuesta celular. En la relación de respuesta a la dosis, el efecto del antagonista se expresa como un desplazamiento hacia la derecha de las curvas, correspondiente a un aumento de la concentración efectiva a medio máxima, siempre que el antagonista sea un ligando competitivo en relación con el agonista. La aplicación exitosa del esquema de dosificación en serie es técnicamente fácil, pero requiere una planificación reflexiva, ya que es difícil realizar todos los pasos con el tiempo correcto.La dosificación en serie ha allanado el camino para realizar estudios de respuesta a la concentración con otros sistemas de lectura que están limitados con respecto al número de muestras monitoreadas en paralelo. Las ventajas particulares de la dosificación en serie permiten el estudio de la transducción de señal mediada por receptores con lecturas completamente nuevas que son sensibles a otros cambios fenotípicos, como la citomecánica. Por favor, use guantes y gafas al preparar las soluciones de stock del agonista del receptor, ya que pueden ser peligrosas cuando se inhalan o se tragan.

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