Name: stepwise dosing protocol for increased throughput in label-free impedance-based gpcr assays
Uploaded: 2020-02-21T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Stepwise Dosing Protocol for Increased Throughput in Label-Free Impedance-Based GPCR Assays at JoVE.com

Vi tackar Barbara Goricnick och Nadja Hinterreiter för deras hjälp med cellodling och beredning av experimentella lösningar. Författarna erkänner tacksamt ekonomiskt stöd av Research Training Group 1910 "Medicinal chemistry of selective GPCR ligands" som finansieras av Den tyska forskningsstiftelsen (DFG) under bidragnummer 222125149. JAS är särskilt tacksam för ett stipendium som beviljats av det bayerska jämställdhetsprogrammet.

1. Cellsådd på elektrodarrayer
OBS: Val av elektrodlayout är en avvägning mellan känslighet och antal celler som studeras. Ju mindre elektroden, desto känsligare är mätningen men det mindre är antalet celler som studeras. För celler som visar starka impedansfluktuationer över tiden under baslinjeförhållanden är större eller interdigerade elektroder att föredra.
<ol><li>Förvärma alla lösningar som behövs för standard cell passaging och sådd i en 37 ° C vattenbad. För a...

<ol>
	<li>Rosenbaum, D. M., Rasmussen, S. G., Kobilka, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+and+function+of+G-protein-coupled+receptors.">The structure and function of G-protein-coupled receptors.</a> Nature. 459, 356-363 (2009).</li><li>Sriram, K., Insel, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G+Protein-Coupled+Receptors+as+Targets+for+Approved+Drugs:+How+Many+Targets+and+How+Many+Drugs.">G Protein-Coupled Receptors as Targets for Approved Drugs: How Many Targets and How Many Drugs.</a> Molecular Pharmacology. 93, 251-258 (2018).</li><li>Kaitin, K. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deconstructing+the+drug+development+process:+The+new+face+of+innovation.">Deconstructing the drug development process: The new face of innovation.</a> Clinical Pharmacoly and Therapeutics. 87, 6 (2010).</li><li>Kenakin, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+assays+as+portals+to+seven-transmembrane+receptor-based+drug+discovery.">Cellular assays as portals to seven-transmembrane receptor-based drug discovery.</a> Nature reviews. Drug discovery. 8, 617-626 (2009).</li><li>Zhang, R., Xie, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tools+for+GPCR+drug+discovery.">Tools for GPCR drug discovery.</a> Acta Pharmacologica Sinica. 33, 372-384 (2012).</li><li>Scott, C. W., Peters, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+whole-cell+assays:+expanding+the+scope+of+GPCR+screening.">Label-free whole-cell assays: expanding the scope of GPCR screening.</a> Drug Discovery Today. 15, 704-716 (2010).</li><li>Giaever, I., Keese, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+fibroblast+behavior+in+tissue+culture+with+an+applied+electric+field.">Monitoring fibroblast behavior in tissue culture with an applied electric field.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 81, 3761-3764 (1984).</li><li>Giaever, I., Keese, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+morphological+biosensor+for+mammalian+cells.">A morphological biosensor for mammalian cells.</a> Nature. 366, 591-592 (1993).</li><li>Fang, Y., Ferrie, A. M., Fontaine, N. H., Mauro, J., Balakrishnan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resonant+waveguide+grating+biosensor+for+living+cell+sensing.">Resonant waveguide grating biosensor for living cell sensing.</a> Biophysical Journal. 91, 16 (2006).</li><li>Stolwijk, J. A., Matrougui, K., Renken, C. W., Trebak, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impedance+analysis+of+GPCR-mediated+changes+in+endothelial+barrier+function:+overview+and+fundamental+considerations+for+stable+and+reproducible+measurements.">Impedance analysis of GPCR-mediated changes in endothelial barrier function: overview and fundamental considerations for stable and reproducible measurements.</a> Pflugers Archiv : European Journal of Physiology. 467, 2193-2218 (2015).</li><li>Lieb, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+versus+conventional+cellular+assays:+Functional+investigations+on+the+human+histamine+H1+receptor.">Label-free versus conventional cellular assays: Functional investigations on the human histamine H1 receptor.</a> Pharmacological Research. 114, 13-26 (2016).</li><li>Stolwijk, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increasing+the+throughput+of+label-free+cell+assays+to+study+the+activation+of+G-protein-coupled+receptors+by+using+a+serial+agonist+exposure+protocol.">Increasing the throughput of label-free cell assays to study the activation of G-protein-coupled receptors by using a serial agonist exposure protocol.</a> Integrative Biology. 11, 10 (2019).</li></ol>

Detta protokoll beskriver en metod för etikettfria impedansmätningar för att bestämma dosresponsförhållandet hos agonist-inducerad GPCR-aktivering i frånvaro eller närvaro av specifika antagonister för samma receptor. Beviset på begreppet för denna metod presenterades i en nyligen publiceradpublikation 12. Vår kännedom är det den första studien som beskriver inrättandet av en fullständig dosresponskurva av agonistisk-medierad GPCR-aktivering med hjälp av ett enda celllager in vit...

Denna rapport presenterar en detaljerad beskrivning av ett följetong tillägg protokoll som utvecklats för kvantifiering av ligand-inducerad G protein-kopplade receptor (GPCR) aktivering i adherentodlade celler genom etikett-fri impedans mätningar. G proteinkopplade receptorer (GPCRs) är involverade i en mängd fysiologiska funktioner och mänskliga sjukdomar1. På grund av detta och deras goda tillgänglighet på cellytan är GPCRs ett av de viktigaste läkemedelsmålen. Denna bedömning återspeglas i ett uppskattat antal ~ 700 godkända läkemedel som riktar sig till GPCRs, vilket motsvarar en ~ 35% andel på alla marknadsförda läkemedel2.
Utvecklingen av nya läkemedel omfattar två centrala processer: i) identifiering och funktionell karakterisering av biologiska målmolekyler, och (ii) upptäckten av nya blyämnen och deras utveckling till administrerade läkemedel. I båda processerna krävs effektiva metoder för att kvantitativt utvärdera interaktion mellan läkemedel och den efterföljande biologiska nedströmsreaktionen. Olika stadier av den prekliniska läkemedelsutvecklingsprocessen använder sig av olika analysmetoder, från biomolekylära interaktionsstudier mellan läkemedel och mål, över funktionella studier på celler i kultur, till experiment på struket organmaterial eller hela djur. Både fysiologisk betydelse och biologisk komplexitet ökar från den förra till de senare3. Även om det är det övergripande målet att minimera djurförsök, farmakologiska studier med hjälp av isolerade organ från försöksdjur eller till och med hela djur anses oundvikliga att omfattande karakterisera nya läkemedelskandidater. När det gäller analytisk avläsning ger organfarmakologistudier ett distala, integrativ "holistiskt" funktionellt svar av högsta fysiologiska relevans. En nackdel med sådana experiment är att de inte är förenliga med hög genomströmning screening av tekniska och etiska skäl och har till stor del ersatts av studier baserade på in vitro cell kultur4.
Metoder för att kvantifiera GPCR aktivering i cellkulturer inkluderar olika etikett-baserade kemiska analyser, som specifikt upptäcka andra budbärare, fosforylering tillstånd nedströms signalering proteiner, transkriptional aktivering via vissa transkriptionsfaktorer eller ligand-inducerad intracellulära receptortrafficking4,5. En nackdel med sådana etikettbaserade analyser är behovet av att märka cellerna med potentiellt skadliga färgämnen eller radioaktiva markörer. Detta kräver ofta att köra analysen som en slutpunkt-bestämning för en exponeringstid som måste anges a priori. Använda etikettbaserade endpoint analyser lider av denna mycket begränsade och partiska tidpunkten för experimentet och risken för att kemiska etiketter och sonder kan störa den vanliga cellfysiologin – potentiellt obemärkt av experimentören.
Under de senaste åren har etikettfria analyser för övervakning av GPCR-aktivering uppstått, som impedansbaserade tekniker eller optiska metoder som tillämpar resonansvågsgaller5,6. Märkning av cellerna krävs experimentellt inte med dessa metoder. Eftersom dessa fysiska avläsningar fungerar på låg amplitud signaler, sådana metoder anses icke-invasiva, de möjliggör kontinuerlig cellövervakning potentiellt i realtid och observationstiden begränsas endast av cellkulturen inte av avläsningen. I likhet med avläsningar från hela organ, etikett-fria metoder rapporterar vanligen om holistiska cellsvar, långt nedströms receptoraktivering när integration längs hela signalnätverket leder till tidsberoende men ganska ospecifika förändringar i cellmorfologi eller massomfördelning. Impedansbaserade analyser mäter den dielektriska signaturen av förändringar i cellform7,8,och mätningar med hjälp av resonant waveguide galler är känsliga för förändringar i brytningsindex vid cell-substrat gränssnitt som härrör från dynamisk massomfördelning (DMR)9. Den integrativ karaktär gör etikett-fria metoder extremt känsliga för receptormedierad händelser oavsett vilken typ (s) av G protein (Gq,Gi/0, Gs, G12/13) eller β-arrestin inblandade i signalkaskad6 och väl lämpad för endogena uttryck nivåer av receptorn.
I en standard etikett-fri impedans-baserad analys cellerna är adherently odlas i multi-well plattor med coplanar guld-film elektroder deponeras på botten av varje brunn10. Dessa elektrodarrayer är anslutna till en impedansanalysator och cellsvaren på en experimentell stimulans registreras från individuella brunnar genom tidslösta impedansavläsningar. I en typisk GPCR analys en ligand läggs i individuellt olika koncentrationer till varje individ väl. De ligand-inducerad förändringar i impedans tidkursen analyseras sedan med avseende på karakteristiska kurva funktioner såsom maximal signalförändring, område under kurvan, signalförändring inom ett givet tidsintervall eller lutning av kurvan vid en viss tidpunkt, för att kvantifiera ligand en potens och effekt11.
Kostnaden för elektrodmatriserna kan begränsa tillämpningen av denna teknik i hts-kampanjer (High Genomströmning). Dessutom ökar antalet enskilda mätningar och minskar därmed den tillgängliga tidsupplösningen för varje brunn gradvis - även för toppmoderna flerkanalsinspelningar. Under sådana förhållanden kan snabba och tillfälliga cellsvar undgå mätningen. Dessutom innebär den konventionella enbrunnen – en koncentrationsmetod en betydande tids- och kostnadsfaktor för perfunderas organ-on-chip eller body-on-chip-utveckling med avseende på deras lämplighet i ligand-GPCR interaktionsanalys.
Av denna anledning utvecklade vi en stegvis dosering protokoll som möjliggör registrering av full dos-respons kurvor av ligand-inducerad GPCR aktivering i odlade cell monolayers genom att kontinuerligt övervaka impedans av en enda brunn medan den agonistiska koncentrationen ökar stegvis. Det seriella agonisttilläggsprotokollet ökar signifikant dataflödet per brunn från en koncentration till 10 eller fler koncentrationer, vilket visas på det aktuella exemplet på mänskliga U-373 MG-celler, som endogenöst uttrycker histamin 1-receptorn (H1R). Metoden har således potential att avsevärt förbättra dataflödet i etikettfria dosresponsstudier, medan tidsupplösningen behålls vid det instrumentella högsta.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>B&#252;rker counting chamber</td>
			<td>Marienfeld (Lauda-K&#246;nigshofen, Germany)</td>
			<td>640210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cell culture flasks 25 cm2</td>
			<td>Greiner bio-one (Frickenhausen, Germany)</td>
			<td>690175</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell incubator (Heraeus Function Line BB15)</td>
			<td>Thermo Scientific (Darmstadt, Germany)</td>
			<td>\</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge (Heraeus 1S-R)</td>
			<td>Thermo Scientific (Darmstadt, Germany)</td>
			<td>\</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diphenhydramine hydrochloride</td>
			<td>Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany)</td>
			<td>D3630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eagle&#39;s Minimum Essential Medium with 4.5 g/L D-Glucose and 2.2 g/L NaHCO3</td>
			<td>Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany)</td>
			<td>D5671</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Impedance Instrument (ECIS Z&#952;)</td>
			<td>Applied BioPhysics Inc. (Troy, NY, USA)</td>
			<td>\</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-well electrode Arrays (8W1E PET)</td>
			<td>Applied BioPhysics Inc. (Troy, NY, USA)</td>
			<td>\</td>
			<td>PET base with 0.049 mm2 working electrode and ~50 mm2 counter electrode (gold)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well electrode arrays (96W1E+ PET)</td>
			<td>Applied BioPhysics Inc. (Troy, NY, USA)</td>
			<td>\</td>
			<td>PET base with two electrodes (gold) with 0.256 mm2 total electrode area</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal calf serum (FCS)</td>
			<td>Biochrom (Berlin, Germany)</td>
			<td>S0615</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histamine dihydrochloride</td>
			<td>Carl Roth (Karlsruhe, Germany)</td>
			<td>4017.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar flow hood (Herasafe, KS 12)</td>
			<td>Thermo Scientific (Darmstadt, Germany)</td>
			<td>51022515</td>
			<td>class II safety cabinet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz&#39; L-15 medium</td>
			<td>Thermo Scientific (Darmstadt, Germany)</td>
			<td>21083-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany)</td>
			<td>G7513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette large (100 - 1000 &#181;L)</td>
			<td>Brandt (Wertheim, Germany)</td>
			<td>704780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette large (20 - 200 &#181;L)</td>
			<td>Brandt (Wertheim, Germany)</td>
			<td>704778</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope (phase contrast, Nikon Diaphot)</td>
			<td>Nikon (D&#252;sseldorf, Germany)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin</td>
			<td>Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany)</td>
			<td>P0781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany)</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette, serological</td>
			<td>Greiner bio-one (Frickenhausen, Germany)</td>
			<td>607 180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettor (accu-jet pro)</td>
			<td>Brandt (Wertheim, Germany)</td>
			<td>26300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany)</td>
			<td>T4174</td>
			<td>in PBS with 1 mM EDTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube, 15 mL</td>
			<td>Greiner bio-one (Frickenhausen, Germany)</td>
			<td>188 271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube, 50 mL</td>
			<td>Greiner bio-one (Frickenhausen, Germany)</td>
			<td>210 261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U-373 MG cells</td>
			<td>ATCC (Rockville, MD, USA)</td>
			<td>ATCC HTB-17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>water bath (TW21)</td>
			<td>Julabo (Seelbach, Germany)</td>
			<td>\</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

stepwise dosing protocol for increased throughput in label-free impedance-based gpcr assays

Etikettfria impedansbaserade analyser används i allt högre grad för att icke-invasivt studera ligand-inducerad GPCR-aktivering i cellodlingsexperiment. Metoden ger cellövervakning i realtid med en enhetsberoende tidsupplösning ner till flera tiotals millisekunder och den är mycket automatiserad. Men när provsiffrorna blir höga (t.ex. dosresponsstudier för olika ligands) kan dock kostnaden för de engångselektrodmatriser som tillgänglig tidsupplösning för sekventiella well-by-well-inspelningar bli begränsande. Därför presenterar vi här ett seriellt agonistiskt tilläggsprotokoll som har potential att avsevärt öka produktionen av etikettfria GPCR-analyser. Med hjälp av det seriella agonistiska tilläggsprotokollet läggs en GPCR-agonist till sekventiellt i ökande koncentrationer till ett enda celllager samtidigt som provets impedans (agonistläge) kontinuerligt övervakar provets impedans (agonistläge). Med denna seriella metod är det nu möjligt att fastställa en full dos-responskurva för en GPCR-agonist från bara ett celllager. Det seriella agonisttilläggsprotokollet gäller för olika GPCR kopplingstyper, Gq Gi/0 eller Gs och det är kompatibelt med rekombinant och endogena uttrycksnivåer av receptorn som studeras. Receptorblockering av GPCR-antagonister är också bedömningsbar (antagonistläge).

Ett typiskt system för att förbereda de olika agonistiska lösningar na visas för ett experiment med 8-brunnselektrodarrayer med histamin som agonist i tabellerna 1-4. Tabell 1 och tabell 2 presenterar volymer och koncentrationer för ett experiment med tilläggsläge 1 (jfr., figur 1), medan tabell 3 och tabell 4 uppvisar volymer och koncentrationer för ett experiment efter addi...

Watch this Scientific Journal Video about Stepwise Dosing Protocol for Increased Throughput in Label-Free Impedance-Based GPCR Assays at JoVE.com

Stepwise Dosing Protocol for Increased Throughput in Label-Free Impedance-Based GPCR Assays

Detta protokoll visar realtidsregistrering av full dosresponsrelationer för agonist-inducerad GPCR-aktivering från ett enda cellskikt som odlas på en enda mikroelektrod med etikettfria impedansmätningar. Det nya doseringssystemet ökar avsevärt dataflödet utan förlust i tidslösning.

Stegvis doseringsprotokoll för ökat dataflöde i etikettfria Impedansbaserade GPCR-analyser

Label-free impedance-based assays are increasingly used to non-invasively study ligand-induced GPCR activation in cell culture experiments. The approach ...

Detta protokoll möjliggör inspelning av en komplett funktionell koncentration svarsrelation av GPCR-agonist från en cellpopulation och ger detaljerad agonist karakterisering även för låga cellprovnummer. Den största fördelen med seriell dosning är ökningen av genomströmningen eftersom en enda brunn är tillräcklig för en fullständig koncentrationsresponsanalys. Denna teknik är väl lämpad att studera enstaka transduktion i sällsynta och komplexa biologiska modeller, som organ-on-chip format i slutna mikrofluidiska behållare.Protokollet är inte svårt att utföra, förutsatt att lämplig utrustning finns tillgänglig. Att förbereda de olika GPCR-ligandlösningarna vid rätt koncentration är nyckeln till framgång. Michael Skiba, en doktorand, och Anne Mildner, en grundutbildning student, från vårt laboratorium kommer att visa förfarandet.För cellsådd på elektrodarrayerna, tillsätt lämplig koncentration av celler till brunnarna i varje elektrod array, och låt cellerna att bosätta sig homogent på brunnen bottnar i 10 till 15 minuter vid rumstemperatur. Efter minst 36 timmar i en vanlig inkubator för cellodling vid 37 grader Celsius och 5 %koldioxid, inspektera cellskikten genom faskontrastmikroskopi för att säkerställa en fullständig täckning av varje elektrod med celler. Byt sedan ut cellodlingsmediet i varje brunn med lämplig volym av förvarat, serumfritt medium.För att starta en impedansinspelning placerar du elektrodmatrisen i impedansanalysatorns anslutningsmatare och bekräftar en ordentlig låg impedanskontakt mellan elektroderna och impedansanalysatorn. Välj elektrodtyp och/eller fler-brunnsformat i programvarans användargränssnitt. Om enkel- och flera frekvensdataanskaffningslägen är tillgängliga och antalet brunnar som ska analyseras är lågt eller tidsupplösningen inte är kritisk, väljer du flera frekvensinspelningar.För att säkerställa en maximal tidsupplösning väljer du en enda övervakningsfrekvens. Börja sedan anskaffning av tidskursdata och välj datamappen för var data ska sparas. Impedansavläsningarna kommer att registreras vid det angivna antalet frekvenser för varje brunn För att initiera det seriella additionsprotokollet i agonistläget för en åtta-brunns array, tillsätt 30 mikroliter av den lägsta koncentrationen av agonisten av intresse för cellerna.Låt sedan cellerna svara och jämvikt under den fördefinierade tidsperioden innan du lägger till 30 mikroliter av den näst högsta koncentrationen tills varje serieutspädning av agonisten har tillsatts. Analysera data genom att subtrahera impedansen för den sista datapunkten före det första tillägget av agonistlösningen, och ange tiden för tilläggsnoll för att normalisera impedansvärdena. Rita tidskursen för normaliserad impedans, och plotta de individuella tidskurserna för att identifiera maxima i impedans efter varje tilläggssteg.Komponera ett datablad med dessa värden, och rita upp värdena för maximal impedansförändring som en funktion av agonistkoncentrationen. Använd sedan en datapassande rutin för att bestämma de halv-maximala effektiva koncentrationerna och maximal respons med hjälp av den logistiska modellen med fyra parameter. I detta representativa experiment, 10 lösningar med ökande histamin koncentrationer var sekventiellt läggas till cellerna var 15 minuter, och förändringen i impedans mättes vid varje tidpunkt.Impedansändringarna kunde sedan ritas som en funktion av histaminkoncentration och överföringsfunktionen hos en logistisk modell med fyra parameter som monterats på de experimentella datapunkterna från sju brunnar. För att ta hänsyn till eventuella histamin receptorn nedreglering, cell desensibilisering, eller överstimulering, dataområdet för analysen kan minskas, som visas för denna enda seriell dosing experiment. Tre-parameter optimering kan sedan tillämpas på data, vilket ger en halv-maximal effektiv koncentration på 0,75 plus eller minus 0,12 mikromolar för denna analys.Tillägg av histaminreceptorantagonisten difenhydramin 20 minuter innan den första histamin resulterar i en fördröjd ökning av impedans inom systemet för seriell dosering, motsvarande behovet av en högre agonist för att framkalla en cell svar. I dosresponsförhållandet uttrycks antagonistens effekt som en högerförskjutning av kurvorna, motsvarande en ökning av halv-maximal effektiv koncentration, förutsatt att antagonisten är en konkurrenskraftig ligand i förhållande till agonisten. Framgångsrik tillämpning av seriellt dosing system är tekniskt lätt men kräver genomtänkt planering, eftersom det är utmanande att utföra alla steg med rätt timing.Seriell dosering har banat väg för att utföra koncentrationsresponsstudier med andra avläsningssystem som är begränsade med avseende på antalet prover som övervakas parallellt. De särskilda fördelarna med seriell dosering tillåta studiet av receptor-medierad signaltransduktion med helt nya avläsningar som är känsliga för andra fenotypiska förändringar, som cytomekanik. Var vänlig använd handskar och skyddsglasögon när du förbereder receptorgonistens stamlösningar, eftersom de kan vara farliga vid inandning eller förtäring.

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Pharmacology

Biochemistry

Unit 1

Pharmacodynamics

SCIENTISTS IN ACTION

Automated Acoustic Dispensing for the Serial Dilution of Peptide Agonists in Potency Determination Assays

Automatiserad Acoustic Utlämning för serieutspädning av peptidagonister i Styrka Fastställande Analyser

As with small molecule drug discovery, screening for peptide agonists requires the serial dilution of peptides to produce concentration-response curves. ...

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

En enkel metod för hög genomströmning kemisk Screening i Caenorhabditis Elegans

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

In Vitro Ubiquitination and Deubiquitination Assays of Nucleosomal Histones

In vitro Ubiquitination och Deubiquitination assays av Nukleosomala Histones

Ubiquitination is a post-translational modification that plays important roles in various signaling pathways and is notably involved in the coordination ...

Monitoring GPCR-&#946;-arrestin1/2 Interactions in Real Time Living Systems to Accelerate Drug Discovery

Monitoring GPCR-ÃƒÅ½Ã‚Â²-arrestin1/2 Interactions in Real Time Living Systems to Accelerate Drug Discovery

Övervakning av GPCR-β-arrestin1/2 interaktioner i real tid levande system för att påskynda Drug discovery

Interactions between G-protein coupled receptors (GPCRs) and &#946;-arrestins are vital processes with physiological implications of great importance. ...

Label-Free Immunoprecipitation Mass Spectrometry Workflow for Large-scale Nuclear Interactome Profiling

Label-fri immunoprecipitation masspektrometri arbetsflöde för storskalig nukleär Interactome profilering

Immunoaffinity purification mass spectrometry (IP-MS) has emerged as a robust quantitative method of identifying protein-protein interactions. This ...

A Rapidly Incremented Tethered-Swimming Maximal Protocol for Cardiorespiratory Assessment of Swimmers

En snabbt ökat Tjudrade-Simning Maximal protokoll för Cardiorespiratory Bedömning av simmare

Incremental exercise testing is the standard means of assessing cardiorespiratory capacity of endurance athletes. While the maximal rate of oxygen ...

Creating Highly Specific Chemically Induced Protein Dimerization Systems by Stepwise Phage Selection of a Combinatorial Single-Domain Antibody Library

Att skapa mycket specifika kemiskt inducerad Proteindimeriseringssystem genom stegvis val av ett kombinatoriskt Endomänsantikroppsbibliotek

Protein dimerization events that occur only in the presence of a small-molecule ligand enable the development of small-molecule biosensors for the ...

Strategic Screening and Characterization of the Visual GPCR-mini-G Protein Signaling Complex for Successful Crystallization

Strategisk screening och karakterisering av Visual GPCR-mini-G Protein Signaling Complex för framgångsrik kristallisering

The key to determining crystal structures of membrane protein complexes is the quality of the sample prior to crystallization. In particular, the choice ...

Parallel Interrogation of &#946;-Arrestin2 Recruitment for Ligand Screening on a GPCR-Wide Scale using PRESTO-Tango Assay

Parallel Interrogation of ÃƒÅ½Ã‚Â²-Arrestin2 Recruitment for Ligand Screening on a GPCR-Wide Scale using PRESTO-Tango Assay

Parallell förhör av β-Arrestin2 Rekrytering till Ligand Screening på en GPCR-wide scale med PRESTO-Tango Assay

As the largest and most versatile gene superfamily and mediators of a gamut of cellular signaling pathways, G-protein-coupled receptors (GPCRs) represent ...

In Vitro Characterization of Histone Chaperones using Analytical, Pull-Down and Chaperoning Assays

In Vitro Characterization of Histone Chaperones using Analytical, Pull-Down and Chaperoning Assays

In vitro Karakterisering av Histone Chaperones med hjälp av analytiska, pull-down och chaperoning analyser

Histone proteins associate with DNA to form the eukaryotic chromatin. The basic unit of chromatin is a nucleosome, made up of a histone octamer consisting ...