Name: stepwise dosing protocol for increased throughput in label-free impedance-based gpcr assays
Uploaded: 2020-02-21T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Stepwise Dosing Protocol for Increased Throughput in Label-Free Impedance-Based GPCR Assays at JoVE.com

Barbara Goricnick ve Nadja Hinterreiter'e hücre culturing ve deneysel çözümlerin hazırlanması nda yardımcı olan lara teşekkür ederiz. Yazarlar minnetle Araştırma Eğitim Grubu 1910 "seçici GPCR ligands tıbbi kimya" Alman Araştırma Vakfı (DFG) hibe numarası 222125149 altında finanse mali destek kabul. JAS özellikle Bavyera Cinsiyet Eşitliği Programı tarafından verilen bir burs için minnettar.

1. Elektrot dizileri üzerinde hücre tohumlama
NOT: Elektrot düzeninin seçimi, hassaslık ve çalışıldaki hücre sayısı arasında bir dengedir. Elektrot ne kadar küçükse, ölçüm o kadar hassastır, ancak çalışıldaki hücre sayısı da o kadar küçüktür. Temel koşullar altında zaman içinde güçlü empedans dalgalanmaları gösteren hücreler için, daha büyük veya interdigitated elektrotlar tercih edilir.
<ol><li>37 °C'lik bir su banyosunda standart hücre geçişi ...

<ol>
	<li>Rosenbaum, D. M., Rasmussen, S. G., Kobilka, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+and+function+of+G-protein-coupled+receptors.">The structure and function of G-protein-coupled receptors.</a> Nature. 459, 356-363 (2009).</li><li>Sriram, K., Insel, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G+Protein-Coupled+Receptors+as+Targets+for+Approved+Drugs:+How+Many+Targets+and+How+Many+Drugs.">G Protein-Coupled Receptors as Targets for Approved Drugs: How Many Targets and How Many Drugs.</a> Molecular Pharmacology. 93, 251-258 (2018).</li><li>Kaitin, K. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deconstructing+the+drug+development+process:+The+new+face+of+innovation.">Deconstructing the drug development process: The new face of innovation.</a> Clinical Pharmacoly and Therapeutics. 87, 6 (2010).</li><li>Kenakin, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+assays+as+portals+to+seven-transmembrane+receptor-based+drug+discovery.">Cellular assays as portals to seven-transmembrane receptor-based drug discovery.</a> Nature reviews. Drug discovery. 8, 617-626 (2009).</li><li>Zhang, R., Xie, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tools+for+GPCR+drug+discovery.">Tools for GPCR drug discovery.</a> Acta Pharmacologica Sinica. 33, 372-384 (2012).</li><li>Scott, C. W., Peters, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+whole-cell+assays:+expanding+the+scope+of+GPCR+screening.">Label-free whole-cell assays: expanding the scope of GPCR screening.</a> Drug Discovery Today. 15, 704-716 (2010).</li><li>Giaever, I., Keese, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+fibroblast+behavior+in+tissue+culture+with+an+applied+electric+field.">Monitoring fibroblast behavior in tissue culture with an applied electric field.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 81, 3761-3764 (1984).</li><li>Giaever, I., Keese, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+morphological+biosensor+for+mammalian+cells.">A morphological biosensor for mammalian cells.</a> Nature. 366, 591-592 (1993).</li><li>Fang, Y., Ferrie, A. M., Fontaine, N. H., Mauro, J., Balakrishnan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resonant+waveguide+grating+biosensor+for+living+cell+sensing.">Resonant waveguide grating biosensor for living cell sensing.</a> Biophysical Journal. 91, 16 (2006).</li><li>Stolwijk, J. A., Matrougui, K., Renken, C. W., Trebak, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impedance+analysis+of+GPCR-mediated+changes+in+endothelial+barrier+function:+overview+and+fundamental+considerations+for+stable+and+reproducible+measurements.">Impedance analysis of GPCR-mediated changes in endothelial barrier function: overview and fundamental considerations for stable and reproducible measurements.</a> Pflugers Archiv : European Journal of Physiology. 467, 2193-2218 (2015).</li><li>Lieb, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+versus+conventional+cellular+assays:+Functional+investigations+on+the+human+histamine+H1+receptor.">Label-free versus conventional cellular assays: Functional investigations on the human histamine H1 receptor.</a> Pharmacological Research. 114, 13-26 (2016).</li><li>Stolwijk, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increasing+the+throughput+of+label-free+cell+assays+to+study+the+activation+of+G-protein-coupled+receptors+by+using+a+serial+agonist+exposure+protocol.">Increasing the throughput of label-free cell assays to study the activation of G-protein-coupled receptors by using a serial agonist exposure protocol.</a> Integrative Biology. 11, 10 (2019).</li></ol>

Bu protokol, aynı reseptör için özel antagonistlerin yokluğunda veya varlığında agonist indüklenen GPCR aktivasyonunun doz-yanıt ilişkisini belirlemek için etiketsiz empedans ölçümleri için bir yöntem tanımlamaktadır. Bu yöntemin kavramının kanıtı yeni bir yayındasunulmuştur 12. Bilgimiz için in vitro tek bir hücre tabakası kullanarak agonist aracılı GPCR aktivasyonu tam doz-yanıt eğrisi kurulması açıklayan ilk çalışmadır. Bu yaklaşım kaçınılmaz olarak ...

Bu rapor, bağlı olarak yetiştirilen hücrelerde ligand kaynaklı G protein-çiftreseptör (GPCR) aktivasyonunun etiketsiz empedans ölçümleri ile ölçülmesi için geliştirilmiş seri ek protokolünün ayrıntılı bir açıklamasını sunmaktadır. G protein-coupled reseptörleri (PcF) fizyolojik fonksiyonlar ve insan hastalıkları1çok sayıda yer almaktadır. Bu ve hücre yüzeyinde ki iyi erişilebilirlik nedeniyle, GPCR en önemli uyuşturucu hedeflerinden biridir. Bu değerlendirme, tüm pazarlanan ilaçlar2~% 35 paya eşdeğer, GPCR hedefleyen ~ 700 onaylı ilaçların tahmini sayısı yansıtılır.
Yeni ilaçların geliştirilmesi iki merkezi süreçten oluşur: (i) biyolojik hedef moleküllerin tanımlanması ve fonksiyonel karakterizasyonu ve (ii) yeni kurşun maddelerin keşfi ve bunların yönetilebilir ilaçlara dönüştürülmesi. Her iki süreçte de, ilaç hedef etkileşimlerini ve sonraki biyolojik aşağı tepkiyi nicel olarak değerlendirmek için etkin yöntemler gereklidir. Klinik öncesi ilaç geliştirme sürecinin farklı aşamalarında, ilaç ve hedef arasındaki biyomoleküler etkileşim çalışmalarından kültürdeki hücreler üzerinde yapılan fonksiyonel çalışmalara, eksise organ materyali veya bütün hayvanlar üzerinde deneylere kadar farklı analiz yöntemlerini kullanmaktadır. Her ikisi de, fizyolojik önemi ve biyolojik karmaşıklığı eski den ikinci3artış . Hayvan deneylerini en aza indirmek genel hedef olsa da, laboratuvar hayvanlarından ve hatta bütün hayvanlardan izole edilmiş organları kullanan farmakolojik çalışmalar, yeni ilaç adaylarını kapsamlı bir şekilde karakterize etmek için kaçınılmaz kabul edilmektedir. Analitik okuma açısından, organ farmakolojisi çalışmaları en yüksek fizyolojik alaka distal, bütünleştirici "bütünleştirici" fonksiyonel yanıt sağlar. Bu tür deneylerin bir dezavantajı, teknik yanı sıra etik nedenlerle yüksek iş elde tarama ile uyumlu değildir ve büyük ölçüde in vitro hücre kültürü4dayalı çalışmalar ile ikame edilmiştir.
Hücre kültürlerinde GPCR aktivasyonunu ölçmek için kullanılan yöntemler arasında, özellikle ikinci habercileri tespit eden farklı etiket tabanlı kimyasal tahliller, aşağı akım sinyal proteinlerinin fosforilasyon durumu, belirli transkripsiyon faktörleri veya ligand kaynaklı hücre içi reseptör ticareti ile transkripsiyonel aktivasyon4,5sayılabilir. Bu tür etiket tabanlı tahlillerin bir dezavantajı, hücreleri zararlı boyalar veya radyoaktif belirteçlerle etiketleme zorunluluğudur. Bu genellikle bir prioribelirtilmesi gereken bir pozlama süresi için bir bitiş noktası belirleme olarak tayini çalıştırmayı gerektirir. Etiket tabanlı uç nokta testlerinin kullanılması, deneyin bu çok sınırlı ve önyargılı zamanlamasından ve kimyasal etiketlerin ve probların normal hücre fizyolojisini etkileyebilecek riskten muzdaripdir – deneyci tarafından fark edilmeden.
Son yıllarda, GPCR aktivasyon izlemek için etiketsiz tahliller ortaya çıkmıştır, empedans tabanlı teknikler veya rezonans dalga kılavuzu ızgaraları uygulayan optik yöntemler gibi5,6. Bu yaklaşımlarla hücrelerin etiketlenmesi deneysel olarak gerekli değildir. Bu fiziksel okumalar düşük genlikli sinyaller üzerinde çalıştığından, bu tür yöntemler invaziv olmayan olarak kabul edilir, onlar potansiyel olarak gerçek zamanlı olarak sürekli hücre izleme için izin ve gözlem süresi sadece hücre kültürü ile sınırlıdır okuma ile değil. Tüm organlardan gelen okumalara benzer şekilde, etiketsiz yaklaşımlar genellikle bütünsel hücre yanıtları hakkında rapor, tüm sinyal ağı boyunca entegrasyon zamana bağlı ama hücre morfolojisi veya kitle yeniden dağıtımında zamana bağlı olmayan değişikliklere yol açtığında reseptör aktivasyonunun çok aşağısında. Empedans tabanlı tahliller hücre şekli7,8, rezonans dalga kılavuzu ızgaraları kullanarak ölçümler istatiksel imza ölçmek ise dinamik kütle yeniden dağılımı (DMR)9kaynaklanan hücre-substrat arabiriminde kırılma indisi değişikliklere duyarlıdır . İntegratif karakter, G proteininin (Gq, Gi/0, Gs, G12/13)veya β-arrestin in sinyalizasyon basamak6 dahil ve reseptörün endojen ekspresyon düzeyleri için uygun ne olursa olsun reseptör aracılı olaylara son derece duyarlı etiketsiz yöntemler yapar.
Standart etiketsiz empedans tabanlı bir teşbimizde hücreler, her kuyunun10'ununaltına biriken koplanar altın film elektrotlarla çok kuyulu plakalarda yapışkan bir şekilde yetiştirilir. Bu elektrot dizileri bir empedans analizörüne bağlanır ve deneysel bir uyarıcıya hücre tepkileri zaman çözümlü empedans okumaları ile bireysel kuyulardan kaydedilir. Tipik bir GPCR tsay bir ligand her bir eye ayrı ayrı farklı konsantrasyonlarda iyi eklenir. Empedans zaman dilimindeki ligand indüklenen değişiklikler daha sonra maksimum sinyal değişimi, eğrinin altındaki alan, belirli bir zaman aralığında ki sinyal değişimi veya eğrinin eğimi gibi karakteristik eğri özelliklerine göre analiz edilir, ligand'ın gücünü ve etkinliğini ölçmek için11.
Elektrot dizilerinin maliyeti, bu tekniğin yüksek iş yapma tarama (HTS) kampanyalarında uygulanmasını sınırlayabilir. Dahası, paralel olarak takip edilecek örnek sayısının artmasıyla, bireysel ölçümlerin sayısı artar ve böylece her bir kuyu için kullanılabilir zaman çözünürlüğünü kademeli olarak azaltır - en son teknoloji deki çok kanallı kayıtlar için bile. Bu koşullar altında hızlı ve geçici hücre yanıtları ölçümden kaçabilir. Buna ek olarak, konvansiyonel bir iyi - bir konsantrasyon yaklaşımı ligand-GPCR etkileşim analizi onların uygunluk açısından perfüzyon organ-on-chip veya vücut-on-chip gelişmeler önemli bir zaman ve maliyet faktörü empoze.
Bu nedenle, agonist konsantrasyonu kademeli olarak artarken tek bir kuyunun empedansını sürekli izleyerek, kültürlü hücre monokatmanlarında ligand kaynaklı GPCR aktivasyonunun tam doz-yanıt eğrilerinin kaydedilmesini sağlayan adım sallayan bir protokol geliştirdik. Seri agonist ekleme protokolü, histamin 1 reseptörünü (H1R) endojen bir şekilde ifade eden insan U-373 MG hücrelerinin mevcut örneğinde gösterildiği gibi, bir konsantrasyondan 10 veya daha fazla konsantrasyona kadar kuyu başına verimin önemli ölçüde arttırıldığı gibi. Böylece, yöntem önemli ölçüde etiketsiz doz-yanıt çalışmalarda iş bilgililik geliştirmek için potansiyele sahiptir, zaman çözünürlüğü enstrümantal maksimum korunur iken.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>B&#252;rker counting chamber</td>
			<td>Marienfeld (Lauda-K&#246;nigshofen, Germany)</td>
			<td>640210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cell culture flasks 25 cm2</td>
			<td>Greiner bio-one (Frickenhausen, Germany)</td>
			<td>690175</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell incubator (Heraeus Function Line BB15)</td>
			<td>Thermo Scientific (Darmstadt, Germany)</td>
			<td>\</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge (Heraeus 1S-R)</td>
			<td>Thermo Scientific (Darmstadt, Germany)</td>
			<td>\</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diphenhydramine hydrochloride</td>
			<td>Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany)</td>
			<td>D3630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eagle&#39;s Minimum Essential Medium with 4.5 g/L D-Glucose and 2.2 g/L NaHCO3</td>
			<td>Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany)</td>
			<td>D5671</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Impedance Instrument (ECIS Z&#952;)</td>
			<td>Applied BioPhysics Inc. (Troy, NY, USA)</td>
			<td>\</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-well electrode Arrays (8W1E PET)</td>
			<td>Applied BioPhysics Inc. (Troy, NY, USA)</td>
			<td>\</td>
			<td>PET base with 0.049 mm2 working electrode and ~50 mm2 counter electrode (gold)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well electrode arrays (96W1E+ PET)</td>
			<td>Applied BioPhysics Inc. (Troy, NY, USA)</td>
			<td>\</td>
			<td>PET base with two electrodes (gold) with 0.256 mm2 total electrode area</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal calf serum (FCS)</td>
			<td>Biochrom (Berlin, Germany)</td>
			<td>S0615</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histamine dihydrochloride</td>
			<td>Carl Roth (Karlsruhe, Germany)</td>
			<td>4017.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar flow hood (Herasafe, KS 12)</td>
			<td>Thermo Scientific (Darmstadt, Germany)</td>
			<td>51022515</td>
			<td>class II safety cabinet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz&#39; L-15 medium</td>
			<td>Thermo Scientific (Darmstadt, Germany)</td>
			<td>21083-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany)</td>
			<td>G7513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette large (100 - 1000 &#181;L)</td>
			<td>Brandt (Wertheim, Germany)</td>
			<td>704780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette large (20 - 200 &#181;L)</td>
			<td>Brandt (Wertheim, Germany)</td>
			<td>704778</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope (phase contrast, Nikon Diaphot)</td>
			<td>Nikon (D&#252;sseldorf, Germany)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin</td>
			<td>Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany)</td>
			<td>P0781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany)</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette, serological</td>
			<td>Greiner bio-one (Frickenhausen, Germany)</td>
			<td>607 180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettor (accu-jet pro)</td>
			<td>Brandt (Wertheim, Germany)</td>
			<td>26300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany)</td>
			<td>T4174</td>
			<td>in PBS with 1 mM EDTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube, 15 mL</td>
			<td>Greiner bio-one (Frickenhausen, Germany)</td>
			<td>188 271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube, 50 mL</td>
			<td>Greiner bio-one (Frickenhausen, Germany)</td>
			<td>210 261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U-373 MG cells</td>
			<td>ATCC (Rockville, MD, USA)</td>
			<td>ATCC HTB-17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>water bath (TW21)</td>
			<td>Julabo (Seelbach, Germany)</td>
			<td>\</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

stepwise dosing protocol for increased throughput in label-free impedance-based gpcr assays

Etiketsiz empedans bazlı tahliller, hücre kültürü deneylerinde ligand kaynaklı GPCR aktivasyonunu invaziv olmayan olarak incelemek için giderek daha fazla kullanılmaktadır. Bu yaklaşım, aygıta bağlı zaman çözünürlüğü yle gerçek zamanlı hücre izleme sağlar ve bu durum çok yüksek derecede otomatiktir. Ancak, örnek sayıları nidik aldığında (örneğin, çeşitli ligandlar için doz-yanıt çalışmaları), tek kullanımlık elektrot dizilerinin maliyeti ve sıralı iyi kuyu kayıtları için kullanılabilir zaman çözünürlüğü sınırlayıcı hale gelebilir. Bu nedenle, burada önemli ölçüde etiket içermeyen GPCR tahlilçıktısını artırmak için potansiyele sahip bir seri agonist ek protokolü sıyoruz. Seri agonist ekleme protokolü kullanılarak, bir GPCR agonist sürekli örnek empedans (agonist modu) izlerken tek bir hücre katmanına artan konsantrasyonları artarda eklenir. Bu seri yaklaşım ile, artık sadece tek bir hücre tabakasından bir GPCR agonist için tam doz-yanıt eğrisi kurmak mümkündür. Seri agonist ekleme protokolü farklı GPCR kaplin tipleri, Gq Gi/0 veya Gs için geçerlidir ve çalışma altındaki reseptörün rekombinant ve endojen ekspresyon düzeyleri ile uyumludur. GPCR antagonistleri tarafından reseptör blokesi de değerlendirilebilir (antagonist mod).

Çeşitli agonist çözümleri hazırlamak için tipik bir şema Tablolar 1-4agonist olarak histamin ile 8-iyi elektrot dizileri kullanarak bir deney için gösterilir. Tablo 1 ve Tablo 2, ek modu 1 (cf., Şekil 1)kullanılarak bir deney için mevcut hacimleri ve konsantrasyonları bulunurken, Tablo 3 ve Tablo 4 ek modu 2'yi izleyen bir deney için hacimleri ve konsantrasyon...

Watch this Scientific Journal Video about Stepwise Dosing Protocol for Increased Throughput in Label-Free Impedance-Based GPCR Assays at JoVE.com

Stepwise Dosing Protocol for Increased Throughput in Label-Free Impedance-Based GPCR Assays

Bu protokol, etiketsiz empedans ölçümleri kullanılarak tek bir mikroelektrot üzerinde yetiştirilen tek bir hücre tabakasından agonist kaynaklı GPCR aktivasyonu için tam doz-yanıt ilişkilerinin gerçek zamanlı kaydını göstermektedir. Yeni dosing şeması, zaman çözümlü zaman kaybı olmadan iş buzunu önemli ölçüde artırır.

Label-Free Empedans Tabanlı GPCR Denemelerinde Artırılmış İş İlerletme Protokolü

Label-free impedance-based assays are increasingly used to non-invasively study ligand-induced GPCR activation in cell culture experiments. The approach ...

Bu protokol, GPCR agonistinin bir hücre popülasyonundan tam bir fonksiyonel konsantrasyon yanıt ilişkisinin kaydedilmesini sağlar ve düşük hücre lisayı ları için bile ayrıntılı agonist karakterizasyonu sağlar. Seri dozlamanın en büyük avantajı, tek bir kuyu tam konsantrasyon yanıt analizi için yeterli olduğundan, üretim artışıdır. Bu teknik, kapalı mikroakışkan kaplarda organ-on-chip biçimleri gibi nadir ve karmaşık biyolojik modellerde tek transdüksiyon çalışması için uygundur.Uygun ekipman mevcut olduğu koşuluyla protokolü gerçekleştirmek zor değildir. Çeşitli GPCR ligand çözeltilerini doğru konsantrasyonda hazırlamak başarının anahtarıdır. Michael Skiba, bir lisans üstü öğrenci, ve Anne Mildner, bir lisans öğrencisi, bizim laboratuvardan prosedürü gösterecektir.Elektrot dizileri üzerine hücre tohumlama için, her elektrot dizisinin kuyularına uygun hücre konsantrasyonu ekleyin ve hücrelerin oda sıcaklığında 10 ila 15 dakika boyunca kuyu diplerine homojen bir şekilde yerleşmelerine izin verin. Standart hücre kültürü kuvözde en az 36 saat kuvözde 37 santigrat derece ve %5 karbondioksit ten sonra, her elektrotun hücrelerle tam bir kapsama alanı sağlamak için faz kontrastlı mikroskobu ile hücre katmanlarını inceleyin. Daha sonra her kuyudaki hücre kültür ortamını önceden ısıtılmış, serumsuz ortamın uygun hacmiyle değiştirin.Empedans kaydı başlatmak için elektrot dizisini empedans analizörün bağlantı dizisi tutucuya yerleştirin ve elektrotlar ile empedans analizörü arasında uygun bir düşük empedans teması doğrulayın. Yazılımın kullanıcı arabirimindeki elektrot türünü ve/veya çok iyi biçimini seçin. Tek ve birden çok frekanslı veri toplama modları varsa ve analiz edilecek kuyu sayısı düşükse veya zaman çözünürlüğü kritik değilse, birden çok frekans kaydı seçin.Maksimum zaman çözünürlüğü sağlamak için tek bir izleme frekansı seçin. Ardından, zaman ders verilerinin edinimine başlayın ve verileri nerede kaydedebileceğiniziçin veri klasörünü seçin. Empedans okumaları her kuyu için belirtilen sayıda frekansta kaydedilecek Sekiz kuyulu bir dizi için agonist modda seri ekleme protokolünü başlatmak için, hücrelere ilgi agonist en düşük konsantrasyon30 mikrolitre ekleyin.Daha sonra agonistin her seri seyreltme eklenene kadar bir sonraki en yüksek konsantrasyonun 30 mikrolitresini eklemeden önce hücrelerin yanıt vermesine ve önceden tanımlanmış bir süre boyunca dengelemelerine izin verin. Verileri çözümlemek için agonist çözümün ilk eklenmesinden önce son veri noktasının empedansını çıkarın ve empedans değerlerini normalleştirmek için ekleme sıfır saatini ayarlayın. Normalleştirilmiş empedans zaman ders arsa ve her ekleme adımından sonra empedans maxima tanımlamak için bireysel zaman kursları arsa.Bu değerlerle bir veri sayfası oluşturun ve agonist konsantrasyonun bir fonksiyonu olarak maksimum empedans değişiminin değerlerini çizin. Daha sonra dört parametreli lojistik modeli kullanarak yarı maksimal etkili konsantrasyonları ve maksimum yanıtı belirlemek için veri uydurma yordamı kullanın. Bu temsili deneyde, histamin konsantrasyonlarını artıran 10 çözelti her 15 dakikada bir hücrelere sırayla eklenmiştir ve her zaman empedansdeğişimi ölçüldü.Empedans değişiklikleri daha sonra histamin konsantrasyonunun bir fonksiyonu ve yedi kuyudan deneysel veri noktalarına takılan dört parametrelik bir lojistik modelin aktarım fonksiyonu olarak çizilebilir. Olası histamin reseptör downregülasyonu, hücre duyarsızlaştırma, ya da aşırı stimülasyon için hesap, analiz için veri aralığı azaltılabilir, Bu tek seri dosing deney için gösterildiği gibi. Üç parametre optimizasyonu daha sonra verilere uygulanabilir ve bu analiz için 0,75 artı veya eksi 0,12 mikromolar yarım maksimal etkin konsantrasyon sağlanabilir.Histamin reseptör antagonisti difenhidramin in eklenmesi 20 dakika önce ilk histamin seri dozlama düzeni içinde empedans gecikmeli bir artış ile sonuçlanır, bir hücre yanıtı ortaya çıkarmak için daha yüksek bir agonist için ihtiyaç karşılık. Doz yanıt ilişkisinde, antagonistin etkisi eğrilerin sağa kayması olarak ifade edilir, yarı maksimal etkin konsantrasyonda bir artışa karşılık gelen, antagonisti agonist göre rekabetçi bir ligand olması koşuluyla. Seri dosing şemasının başarılı bir şekilde uygulanması teknik olarak kolaydır, ancak doğru zamanlama ile tüm adımları gerçekleştirmek zor olduğu için düşünceli planlama gerektirir.Seri dosing paralel olarak izlenen numune sayısı ile sınırlı diğer okuma sistemleri ile konsantrasyon yanıt çalışmaları gerçekleştirmek için yol açmıştır. Seri dosing belirli avantajları sitomekanik gibi diğer henotik değişikliklere duyarlı tamamen yeni okumalar ile reseptör aracılı sinyal transdüksiyon çalışma sağlar. Lütfen reseptör agonisinin stok çözümlerini hazırlarken eldiven ve gözlük takın, çünkü solunduğunda veya yutulduğunda tehlikeli olabilirler.

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Pharmacology

Biochemistry

Unit 1

Pharmacodynamics

SCIENTISTS IN ACTION

Automated Acoustic Dispensing for the Serial Dilution of Peptide Agonists in Potency Determination Assays

Etkili belirlenmesi tahlillerinde Peptit Agonistlerinin seri Seyreltme için Dağıtım Otomatik Akustik

As with small molecule drug discovery, screening for peptide agonists requires the serial dilution of peptides to produce concentration-response curves. ...

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

Yüksek işlem hacmi Caenorhabditis Elegans kimyasal tarama için basit bir yöntem

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

In Vitro Ubiquitination and Deubiquitination Assays of Nucleosomal Histones

Nükliosomal Histones in vitro Ubiquitination ve Deubiquitination bulguları

Ubiquitination is a post-translational modification that plays important roles in various signaling pathways and is notably involved in the coordination ...

Monitoring GPCR-&#946;-arrestin1/2 Interactions in Real Time Living Systems to Accelerate Drug Discovery

Monitoring GPCR-ÃƒÅ½Ã‚Â²-arrestin1/2 Interactions in Real Time Living Systems to Accelerate Drug Discovery

İzleme GPCR-β-arrestin1/2 etkileşimleri gerçek zamanlı yaşam sistemleri Ilaç Discovery hızlandırmak için

Interactions between G-protein coupled receptors (GPCRs) and &#946;-arrestins are vital processes with physiological implications of great importance. ...

Label-Free Immunoprecipitation Mass Spectrometry Workflow for Large-scale Nuclear Interactome Profiling

Büyük Ölçekli Nükleer Etkileşimom Profilleme için Etiketsiz İmmünoprekütle Spektrometresi İş Akışı

Immunoaffinity purification mass spectrometry (IP-MS) has emerged as a robust quantitative method of identifying protein-protein interactions. This ...

A Rapidly Incremented Tethered-Swimming Maximal Protocol for Cardiorespiratory Assessment of Swimmers

Yüzücülerin Kardiyorespiratuar Değerlendirmesi için Hızla Artan Tethered-Swimming Maksimal Protokolü

Incremental exercise testing is the standard means of assessing cardiorespiratory capacity of endurance athletes. While the maximal rate of oxygen ...

Creating Highly Specific Chemically Induced Protein Dimerization Systems by Stepwise Phage Selection of a Combinatorial Single-Domain Antibody Library

Bir Kombinatoryal Tek Etki Alanı Antikor Kütüphanesi adım wise Faj Seçimi ile Son Derece Spesifik Kimyasal Kaynaklı Protein Dimerization Sistemleri Oluşturma

Protein dimerization events that occur only in the presence of a small-molecule ligand enable the development of small-molecule biosensors for the ...

Strategic Screening and Characterization of the Visual GPCR-mini-G Protein Signaling Complex for Successful Crystallization

Başarılı Kristalizasyon Için Görsel GPCR-mini-G Protein Sinyal Kompleksi Stratejik Tarama ve Karakterizasyonu

The key to determining crystal structures of membrane protein complexes is the quality of the sample prior to crystallization. In particular, the choice ...

Parallel Interrogation of &#946;-Arrestin2 Recruitment for Ligand Screening on a GPCR-Wide Scale using PRESTO-Tango Assay

Parallel Interrogation of ÃƒÅ½Ã‚Â²-Arrestin2 Recruitment for Ligand Screening on a GPCR-Wide Scale using PRESTO-Tango Assay

Β-Arrestin2 Ligand Tarama için PRESTO-Tango Tetkik ini Kullanarak GPCR-Geniş Ölçekte İşe Alımın Paralel Sorgulaması

As the largest and most versatile gene superfamily and mediators of a gamut of cellular signaling pathways, G-protein-coupled receptors (GPCRs) represent ...

In Vitro Characterization of Histone Chaperones using Analytical, Pull-Down and Chaperoning Assays

In Vitro Characterization of Histone Chaperones using Analytical, Pull-Down and Chaperoning Assays

İn Vitro Histon Chaperonlarının Analitik, Pull-Down ve Chaperoning Testleri Kullanılarak Karakterizasyonu

Histone proteins associate with DNA to form the eukaryotic chromatin. The basic unit of chromatin is a nucleosome, made up of a histone octamer consisting ...