Name: isolation, culture, and adipogenic induction of neural crest original adipose-derived stem cells from periaortic adipose tissue
Uploaded: 2020-03-02T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation, Culture, and Adipogenic Induction of Neural Crest Original Adipose-Derived Stem Cells from Periaortic Adipose Tissue at JoVE.com

قدم البرنامج الوطني للبحث والتطوير الرئيسي في الصين (2018YFC1312504)، والمؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (81970378، 81670360، 81870293)، ولجنة العلوم والتكنولوجيا في بلدية شنغهاي (17411971000، 17140902402) الأموال اللازمة لهذه الدراسة .

وقد تمت مراجعة البروتوكول الحيوانى والموافقة عليه من قبل لجنة رعاية الحيوانات بجامعة جياو تونغ بشانغهاى .
1. جيل Wnt-1 كري+/-; Rosa26RFP/+ الفئران
<ol><li>عبر Wnt-1 كري+/- الفئران16 مع روزا26RFP/+ الفئران18 لتوليد Wnt-1 كري+/-; Rosa26RFP/ + ال?...

<ol>
	<li>Afshin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Health+Effects+of+Overweight+and+Obesity+in+195+Countries+over+25+Years.">Health Effects of Overweight and Obesity in 195 Countries over 25 Years.</a> New England Journal of Medicine. 377 (1), 13-27 (2017).</li><li>Brown, N. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perivascular+adipose+tissue+in+vascular+function+and+disease:+a+review+of+current+research+and+animal+models.">Perivascular adipose tissue in vascular function and disease: a review of current research and animal models.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 34 (8), 1621-1630 (2014).</li><li>Britton, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevalence,+distribution,+and+risk+factor+correlates+of+high+thoracic+periaortic+fat+in+the+Framingham+Heart+Study.">Prevalence, distribution, and risk factor correlates of high thoracic periaortic fat in the Framingham Heart Study.</a> Journal of the American Heart Association. 1 (6), 004200 (2012).</li><li>Police, S. B., Thatcher, S. E., Charnigo, R., Daugherty, A., Cassis, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obesity+promotes+inflammation+in+periaortic+adipose+tissue+and+angiotensin+II-induced+abdominal+aortic+aneurysm+formation.">Obesity promotes inflammation in periaortic adipose tissue and angiotensin II-induced abdominal aortic aneurysm formation.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 29 (10), 1458-1464 (2009).</li><li>Farmer, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+control+of+adipocyte+formation.">Transcriptional control of adipocyte formation.</a> Cell Metabolism. 4 (4), 263-273 (2006).</li><li>Aune, U. L., Ruiz, L., Kajimura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+differentiation+of+stromal+vascular+cells+to+beige/brite+cells.">Isolation and differentiation of stromal vascular cells to beige/brite cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (73), e50191 (2013).</li><li>Ruan, H., Zarnowski, M. J., Cushman, S. W., Lodish, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standard+isolation+of+primary+adipose+cells+from+mouse+epididymal+fat+pads+induces+inflammatory+mediators+and+down-regulates+adipocyte+genes.">Standard isolation of primary adipose cells from mouse epididymal fat pads induces inflammatory mediators and down-regulates adipocyte genes.</a> Journal of Biological Chemistry. 278 (48), 47585-47593 (2003).</li><li>Cinti, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Between+brown+and+white:+novel+aspects+of+adipocyte+differentiation.">Between brown and white: novel aspects of adipocyte differentiation.</a> Annals of Medicine. 43 (2), 104-115 (2011).</li><li>Van Harmelen, V., Rohrig, K., Hauner, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+proliferation+and+differentiation+capacity+of+human+adipocyte+precursor+cells+from+the+omental+and+subcutaneous+adipose+tissue+depot+of+obese+subjects.">Comparison of proliferation and differentiation capacity of human adipocyte precursor cells from the omental and subcutaneous adipose tissue depot of obese subjects.</a> Metabolism. 53 (5), 632-637 (2004).</li><li>Rodeheffer, M. S., Birsoy, K., Friedman, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+white+adipocyte+progenitor+cells+in+vivo.">Identification of white adipocyte progenitor cells in vivo.</a> Cell. 135 (2), 240-249 (2008).</li><li>Church, C. D., Berry, R., Rodeheffer, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+study+of+adipocyte+precursors.">Isolation and study of adipocyte precursors.</a> Methods in Enzymology. 537, 31-46 (2014).</li><li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Differentiation+of+Adipose-Derived+Stem+Cells+from+Porcine+Subcutaneous+Adipose+Tissues.">Isolation and Differentiation of Adipose-Derived Stem Cells from Porcine Subcutaneous Adipose Tissues.</a> Journal of Visualized Experiments. (109), e53886 (2016).</li><li>Ye, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+and+functional+characteristics+of+the+thoracic+aorta+perivascular+adipocyte.">Developmental and functional characteristics of the thoracic aorta perivascular adipocyte.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 76 (4), 777-789 (2019).</li><li>Medeiros, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+evolution+of+the+neural+crest:+new+perspectives+from+lamprey+and+invertebrate+neural+crest-like+cells.">The evolution of the neural crest: new perspectives from lamprey and invertebrate neural crest-like cells.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews. Developmental Biology. 2 (1), 1-15 (2013).</li><li>Fu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+Crest+Cells+Differentiate+Into+Brown+Adipocytes+and+Contribute+to+Periaortic+Arch+Adipose+Tissue+Formation.">Neural Crest Cells Differentiate Into Brown Adipocytes and Contribute to Periaortic Arch Adipose Tissue Formation.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. , (2019).</li><li>Danielian, P. S., Muccino, D., Rowitch, D. H., Michael, S. K., McMahon, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modification+of+gene+activity+in+mouse+embryos+in+utero+by+a+tamoxifen-inducible+form+of+Cre+recombinase.">Modification of gene activity in mouse embryos in utero by a tamoxifen-inducible form of Cre recombinase.</a> Current Biology. 8 (24), 1323-1326 (1998).</li><li>Tamura, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+crest-derived+stem+cells+migrate+and+differentiate+into+cardiomyocytes+after+myocardial+infarction.">Neural crest-derived stem cells migrate and differentiate into cardiomyocytes after myocardial infarction.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 31 (3), 582-589 (2011).</li><li>Madisen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+robust+and+high-throughput+Cre+reporting+and+characterization+system+for+the+whole+mouse+brain.">A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain.</a> Nature Neuroscience. 13 (1), 133-140 (2010).</li><li>Tan, P., Pepin, &. #. 2. 0. 1. ;., Lavoie, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+Adipose+Tissue+Collection+and+Processing+for+RNA+Analysis.">Mouse Adipose Tissue Collection and Processing for RNA Analysis.</a> Journal of Visualized Experiments. (131), e57026 (2018).</li><li>Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+specific+cell+population+by+fluorescence+activated+cell+sorting+(FACS).">Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS).</a> Journal of Visualized Experiments. (41), e1546 (2010).</li><li>Gupta, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zfp423+expression+identifies+committed+preadipocytes+and+localizes+to+adipose+endothelial+and+perivascular+cells.">Zfp423 expression identifies committed preadipocytes and localizes to adipose endothelial and perivascular cells.</a> Cell Metabolism. 15 (2), 230-239 (2012).</li><li>Sowa, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose+stromal+cells+contain+phenotypically+distinct+adipogenic+progenitors+derived+from+neural+crest.">Adipose stromal cells contain phenotypically distinct adipogenic progenitors derived from neural crest.</a> PLoS One. 8 (12), 84206 (2013).</li><li>Billo, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+generation+of+adipocytes+by+the+neural+crest.">The generation of adipocytes by the neural crest.</a> Development. 134 (12), 2283-2292 (2007).</li><li>Thelen, K., Ayala-Lopez, N., Watts, S. W., Contreras, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+and+Adipogenesis+Induction+of+Adipocyte+Progenitors+from+Perivascular+Adipose+Tissue+Isolated+by+Magnetic+Activated+Cell+Sorting.">Expansion and Adipogenesis Induction of Adipocyte Progenitors from Perivascular Adipose Tissue Isolated by Magnetic Activated Cell Sorting.</a> Journal of Visualized Experiments. (124), e55818 (2017).</li></ol>

في هذه الدراسة، نقدم طريقة موثوقة لعزل، والثقافة، والحث adipogenic من NCADSCs المستخرجة من PVAT من Wnt-1 كري+/-؛ روزا26RFP / + الفئران المعدلة وراثيا مصممة لإنتاج RFP+ ADSCs. تظهر التقارير السابقة أنه لا يوجد فرق كبير في التعبير عن الخلايا الجذعية المتوسطة المتعددة القدرات العامة (MSCs) في NCADSCs و...

انتشار السمنة في تزايد في جميع أنحاء العالم، مما يزيد من خطر الأمراض المزمنة ذات الصلة، بما في ذلك أمراض القلب والأوعية الدموية ومرض السكري1. PVAT تحيط الأوعية الدموية وهو مصدر رئيسي لعوامل الغدد الصماء والباراكرين المشاركة في وظيفة الأوعية الدموية. تظهر الدراسات السريرية أن نسبة PVAT العالية هي عامل خطر مستقل لأمراض القلب والأوعية الدموية2،3، وتعتمد وظيفتها المرضية على النمط الظاهري للخلايا الجذعية المشتقة من الدهنية المكونة (ADSCs)4.
على الرغم من أن خطوط الخلايا ADSC مثل murine 3T3-L1, 3T3-F442A, وOP9 هي نماذج خلوية مفيدة لدراسة adipogenesis أو lipogenesis5,الآليات التنظيمية لadipogenesis تختلف بين خطوط الخلية والخلايا الأولية. وADSCs في كسر الخلية الوعائية سترومال (SVF) معزولة مباشرة من الأنسجة الدهنية والناجمة عن التفريق في الخلايا الدهنية على الأرجح خلاصة في الجسم الحي adipogenesis وlipogenesis6. ومع ذلك ، فإن هشاشة وطفو هاوية واختلافات في الحجم والأنماط المناعية للأنظمة المحاسبية الدولية للأنظمة تجعل عزلتها المباشرة صعبة. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن تؤثر إجراءات العزل المختلفة أيضًا بشكل كبير على النمط الظاهري والقدرة المحتملة الأيديجينية لهذه الخلايا7، مما يؤكد على الحاجة إلى بروتوكول يحافظ على سلامة ADSC.
عادة ما تصنف الأنسجة الدهنية إما الأنسجة الدهنية البيضاء متميزة شكليا ووظيفيا (وات)، أو الأنسجة الدهنية البني (BAT)8، الذي يؤوي ADSCsمتميزة 9. في حين أن ADSCs معزولة عن perigonadal والغناء تحت الجلد WATs وقد تميزت في الدراسات السابقة9،10،11،12، أقل من المعروف فيما يتعلق ADSCs من PVAT التي تتألف أساسا من BAT13.
في دراسة حديثة ، وجدنا أن جزءًا من ADSCs المقيم في الأنسجة الدهنية للقوس المحيطي (PAAT) مشتقة من خلايا القمة العصبية (NCCs) ، وهي مجموعة سكانية عابرة من خلايا السلف المهاجرة التي تنشأ من ectoderm14،15. تم استخدام الفئران المعدلة وراثيا Wnt1-Cre لتتبع تطور الخلايا العصبية كريست16،17. عبرنا Wnt1-Cre+ الفئران مع روزا26RFP / + الفئران لتوليد Wnt-1 كري+/-؛ روزا26RFP / + الفئران، التي يتم تسمية NCCs وذريتها مع البروتين الفلوري الأحمر (RFP) ويتم تعقبها بسهولة في vivo وفي المختبر15. هنا، ونحن نصف طريقة لعزل قمة العصبية المستمدة ADSCs (NC المشتقة ADSCs، أو NCADSCs) من PAAT الماوس وحث NCADSCs للتمييز إلى الخلايا الشحمية البيضاء أو الخلايا الشحمية البني.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>4% PFA</td>
			<td>BBI life sciences</td>
			<td>E672002-0500</td>
			<td>Lot #: EC11FA0001</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>ABCONE (China)</td>
			<td>A47902</td>
			<td>1% working concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-cebp/&#945;</td>
			<td>ABclonal</td>
			<td>A0904</td>
			<td>1:1000 working concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse IgG, HRP-linked</td>
			<td>CST</td>
			<td>7076</td>
			<td>1:5000 working concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-perilipin</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>AB61682</td>
			<td>1 &#956;g/mL working concentration; lot #: GR66486-54</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-PPARy</td>
			<td>SANTA CRUZ</td>
			<td>sc-7273</td>
			<td>0.2 &#956;g/mL working concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-rabbit IgG, HRP-linked</td>
			<td>CST</td>
			<td>7074</td>
			<td>1:5000 working concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-&#946;-Tubulin</td>
			<td>CST</td>
			<td>2146</td>
			<td>1:1000 working concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>VWR life sciences</td>
			<td>0332-100G</td>
			<td>50 mg/mL working concentration; lot #: 0536C008</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase, Type I</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17018029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D4902</td>
			<td>0.1 &#181;M working concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erythrocyte Lysis Buffer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>00-4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Corning</td>
			<td>R35-076-CV</td>
			<td>50 mg/mL working concentration; lot #: R2040212FBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14025092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HDMEM</td>
			<td>Gelifesciences</td>
			<td>SH30243.01</td>
			<td>Lot #: AD20813268</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IBMX</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I7018</td>
			<td>0.5 mM working concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I3536</td>
			<td>1 &#956;g/mL working concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsurgical forceps</td>
			<td>Suzhou Mingren Medical Equipment Co.,Ltd. (China)</td>
			<td>MR-F201A-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsurgical scissor</td>
			<td>Suzhou Mingren Medical Equipment Co.,Ltd. (China)</td>
			<td>MR-H121A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oil Red O solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>O1516</td>
			<td>0.3% working concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (Phosphate buffered saline)</td>
			<td>ABCONE (China)</td>
			<td>P41970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrimeScript RT reagent Kit</td>
			<td>TAKARA</td>
			<td>RR047A</td>
			<td>Lot #: AK4802</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy kit</td>
			<td>TAKARA</td>
			<td>9767</td>
			<td>Lot #: AHF1991D</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rosa26RFP/+ mice</td>
			<td>JAX</td>
			<td>No.007909</td>
			<td>C57BL/6 backgroud; male and female</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rosiglitazone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R2408</td>
			<td>1 &#956;M working concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard forceps</td>
			<td>Suzhou Mingren Medical Equipment Co.,Ltd. (China)</td>
			<td>MR-F424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical scissor</td>
			<td>Suzhou Mingren Medical Equipment Co.,Ltd. (China)</td>
			<td>MR-S231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Premix Ex Taq</td>
			<td>TAKARA</td>
			<td>RR420A</td>
			<td>Lot #: AK9003</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triiodothyronine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T2877</td>
			<td>10 nM working concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wnt1-Cre+;PPAR&#947;flox/flox mice</td>
			<td>JAX</td>
			<td>No.009107</td>
			<td>C57BL/6 backgroud; male and female</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation, culture, and adipogenic induction of neural crest original adipose-derived stem cells from periaortic adipose tissue

ترتبط الكمية المفرطة من الأنسجة الدهنية المحيطة بالأوعية الدموية (الأنسجة الدهنية المحيطة بالأوعية الدموية، والمعروفة أيضًا باسم PVAT) بارتفاع خطر الإصابة بأمراض القلب والأوعية الدموية. تظهر ADSCs المشتقة من الأنسجة الدهنية المختلفة ميزات متميزة ، ولم يتم توصيف تلك الموجودة في PVAT بشكل جيد. في دراسة حديثة، أبلغنا أن بعض ADSCs في الأنسجة الدهنية القوس المحيطي (PAAT) تنحدر من خلايا القمة العصبية (NCCs)، وهي مجموعة عابرة من الخلايا المهاجرة الناشئة من الخلايا الجذعية.
في هذه الورقة، نصف بروتوكول لعزل البروتين الفلوري الأحمر (RFP) المسمى NCCs من PAAT من Wnt-1 Cre+/-; Rosa26RFP / + الفئران وحفز التمايز adipogenic في المختبر. باختصار ، يتم فصل كسر الأوعية الدموية المترفية (SVF) بشكل أنزيمي عن PAAT ، ويتم عزل RFP+ قمة العصبية المشتقة ADSCs (NCADSCs) عن طريق فرز الخلايا المنشطة الفلورية (FACS). وNCADSCs تفرق إلى كل من الخلايا الشحمية البني والأبيض، يمكن cryopreserved، والاحتفاظ إمكاناتها adipogenic ل ~ 3-5 الممرات. يمكن أن يولد بروتوكولنا ADSCs وفيرة من PVAT لنمذجة الخلايا الدهنية PVAT أو lipogenesis في المختبر. وهكذا، يمكن لهذه NCADSCs توفير نظام قيمة لدراسة مفاتيح الجزيئية المشاركة في التمايز PVAT.

باستخدام البروتوكول المذكور أعلاه، حصلنا على ~ 0.5-1.0 × 106 ADSCs من 5-6 Wnt-1 Cre+/-; روزا26RFP/+ الفئران (48 أسابيع من العمر، ذكر اولا او أنثى).
يتم تقديم مخطط تدفق مجموعة PAAT من الفئران في الشكل 1. كان مورفولوجيا NCADSCs مشابهة لـ ADSC من الأنسجة الدهنية للفئران ال?...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation, Culture, and Adipogenic Induction of Neural Crest Original Adipose-Derived Stem Cells from Periaortic Adipose Tissue at JoVE.com

Isolation, Culture, and Adipogenic Induction of Neural Crest Original Adipose-Derived Stem Cells from Periaortic Adipose Tissue

نقدم بروتوكولا ً للعزل والثقافة والحث الإديفيوجيني للخلايا الجذعية المشتقة من الخلايا الدهنية المشتقة من الخلايا الدهنية المشتقة من الخلايا الدهنية المحيطية لـ Wnt-1 Cre+/-؛ Rosa26RFP/ + الفئران. يمكن أن تكون NCADSCs مصدرًا يمكن الوصول إليه بسهولة من ADSCs لنمذجة الأديبوجينيسيس أو تكوين الدهون في المختبر.

العزلة والثقافة وتحريض Adipogenic من الخلايا الجذعية المشتقة من الخلايا الدهنية المشتقة من الخلايا الدهنية العصبية من الأنسجة الدهنية

An excessive amount of adipose tissue surrounding the blood vessels (perivascular adipose tissue, also known as PVAT) is associated with a high risk of ...

ويمكن استخدام منهجيتنا بسيطة وعملية للحصول على ADSCS وفيرة لدراسة PVAT adipogenesis في المختبر واختبار الأدوية العادية ضد السمنة وأمراض القلب والأوعية الدموية ذات الصلة. وميزة هذه الطريقة هي الفلورس الكامنة من NCADSCs من البيوتين تحتاج إلى تسمية الخلايا مع الأجسام المضادة flou-chrome مترافق لFACS، أو الخلايا تنشيط المغناطيسي الفرز. يمكن استخدام هذه الطريقة للحصول على اكذال من الـ ADSC المشتقة من خلايا القمة العصبية من الخلايا البكندرية لدراسة تكوين الدهون الدهنية PVAT، أو تكوين الدهون في المختبر.استخدام الفئران الصغيرة وجود خبرة مع الكي وتولد الخلايا الدهنية المستحثة يعني 3T3 الخلايا أمر بالغ الأهمية لنجاح هذا البروتوكول. وسوف يكون إثبات الإجراء Yiding تشي، وهو طالب غراد، وليان شو، وهو فني من مختبري. لتشريح PAAT ، بعد تعقيم الذبيحة الماوس في 75 ٪ الإيثانول لمدة خمس دقائق ، استخدم المقص لقص وفصل الجلد على البطن.قطع على طول خط الوسط البطني من الحوض إلى الرقبة، وفتح البطن. حرك الكبد لفضح الحجاب الحاجز، وقطع الحجاب الحاجز والأضلاع على جانبي خط الوسط. قشر مرة أخرى الأضلاع لفضح القلب والرئتين.و أزل الرئتين والزعتر استخراج PAAT جنبا إلى جنب مع الشريان الأورطي والقلب في طبق بتري. وقطع الشريان الأبهر في الجذر الأبهري لإزالة القلب.ثم، جعل قطع بين القوس الأبهر والابهرية تنازلي. يفصل بعناية الأنسجة الدهنية المحيطة بكل من الهيكلين، والشرايين السباتية المشتركة اليسرى والأيّنية من جدار الصدر الخلفي. من المهم فصل PAAT عن الجذر وكأوعية الأوعية الدموية أكبر بعناية، هو وجود خلايا جدار الأوعية الدموية يمكن أن تؤثر على كفاءة FACS.وضع الأنسجة في طبق بتري تحتوي على الجليد الباردة HBSS العازلة. واستخدام ملقط العقيمة لإزالة أكبر قدر من الأوعية الدموية واللفافة قدر الإمكان. ثم، نقل الأنسجة الدهنية إلى أنبوب Eppendorf ملليلتر اثنين، تحتوي على نقطة خمسة ملليلتر من الجليد الباردة HBSS العازلة على الجليد.عندما تم جمع كل PAAT، نقل الأنسجة الدهنية المحصودة إلى أنبوب جديد ملليلتر جهاز طرد مركزي صغير يحتوي على ملليلتر واحد من هضم المتوسطة الطازجة. واستخدم مقص جراحياً لـ ينم الأنسجة نقل الطين الأنسجة في أنبوب 50 ملليمتر تحتوي على تسعة ملليلتر من الهضم الطازج المتوسطة.واستخدم ماصة ملليلتر واحدة لتثلث الأنسجة 10 مرات. عندما تم الحصول على حل متجانس، احتضان الأنبوب لمدة 30 إلى 45 دقيقة في 37 درجة مئوية و 100 الثورات في الدقيقة الواحدة، والتحقق من كل خمس إلى 10 دقائق لمنع إفراط في عسر الهضم. عندما يمكن ملاحظة محلول الأنسجة الدهنية المتجانسة الصفراء الفاتحة عند الدوامة اللطيفة للأنبوب ، توقف عن الهضم بخمس ملليلترات من HDMEM تكملها مصل الأبقار الجنيني بنسبة 10٪.بعد خلط شامل، الطرد المركزي عينة الأنسجة الدهنية. وسوف يكون جزء الخلية الوعائية stromal مرئية كما بيليه البني. إعادة تعليق بيليه في 10 ملليلتر من المتوسطة الثقافة, وتصفية تعليق الخلية من خلال مصفاة خلية ميكرومتر 70.جمع الخلايا عن طريق طرد مركز آخر. وبلطف إعادة تعليق بيليه في خمسة ملليلتر من الخلايا الحمراء العازلة تحلل. نقل التعليق إلى أنبوب 15 ملليلتر.بعد 10 دقائق، ووقف رد فعل مع اثنين من الطرد المركزي في 10 ملليلتر من برنامج تلفزيوني، وتستكمل مع 1٪ مصل البقر الجنين. بعد الطرد المركزي الثاني، إعادة تعليق بيليه في خمسة ملليلتر من المتوسطة الثقافة على الجليد. وجمع الخلايا مع الطرد المركزي النهائي.ثم، إعادة تعليق الخلايا في خمسة ملليلتر من المخزن المؤقت FACS للعد. لإقامة ثقافة NCADSC، بعد عزلها من قبل FACS وفقا للبروتوكولات القياسية، ووضع الخلايا في خمس مرات 10 إلى الخلايا الثالثة لكل سنتيمتر مربع التركيز في كل بئر، لوحة ثقافة 12 جيدا. غير مكتملة متوسطة الثقافة في 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 20 إلى 24 ساعة.في اليوم التالي، وغسل الخلايا مع 37 درجة مئوية PBS، وتغذية الثقافة مع ثقافة جديدة المتوسطة. عندما تصل الثقافة إلى 80 إلى 90٪ التقاء، علاج الخلايا مع مليلتر اثنين من 0.25٪ التربسين EDTA في البئر لمدة ثلاث إلى خمس دقائق في 37 درجة مئوية. عندما يتم فصل الخلايا من الجزء السفلي من لوحة، تحييد الإنزيمات مع مليلتر اثنين من المتوسطة المستزرعة، وجمع الخلايا المحصودة عن طريق الطرد المركزي.إعادة تعليق بيليه في ملليلتر واحد من الثقافة الطازجة المتوسطة للعد. وبذِر الخلايا في لوحة جديدة 12 ثقافة جيدة في خمس مرات 10 إلى الخلايا الثالثة لكل سنتيمتر مربع التركيز. ثم، إعادة تعليق الخلايا المتبقية في المتوسط الثقافة تكمل مع 10٪ ثنائي الفينيل السلفوكسيد لتخزين المجمدة في النيتروجين السائل.للحث على التمايز الايديبويجيني، عندما تصل الخلايا إلى 80 إلى 90٪ التقاء، علاج الخلايا مع البني أو الأبيض adipogenic التعريفي المتوسطة لمدة يومين حسب الاقتضاء. في نهاية الحضانة، وغسل بلطف الخلايا مرتين مع برنامج تلفزيوني قبل إضافة المناسبة adipogenic جديدة التعريفي المتوسطة لكل بئر، وإعادة الخلايا إلى الحاضنة ثقافة الخلية لمدة إضافية من ثلاثة إلى خمسة أيام من الحضانة. اللجان الوطنية للثقافة تصل إلى 80 إلى 90٪ التقاء بعد سبعة إلى ثمانية أيام من الثقافة.وتثبت توسيع الألياف الزجاجية مثل مورفولوجيا. لمزيد من تأكيد إمكاناتها الادبويجينية، يمكن إجراء تلطيخ الزيت الأحمر من NCADSCs المتمايزة للكشف عن الخلايا الدهنية الناضجة. عادة، لوحظت adipocytes ناضجة بعد ثمانية أيام من الأبيض أو البني adipogenic التعريفي مع أكثر من 60٪ من NCADSCs عرض تمايزadipogenic.لاحظ أن NCADSCs تظهر إلى حد كبير انخفاض adipogenic المحتملة بعد passaging. تكشف PCR المناعية والكمية في الوقت الحقيقي أن التعبير عن بروتينات جينات نسبية محددة من الناحية المحددة يزيد بشكل كبير في NCADSCs المتمايزة بشكل اديوجيني بعد ثمانية أيام من الحث الأبيض الاديبويجيني. وبالمثل، فإن التعبير عن جينات محددة من الخلايا الشحمية، والجينات المحددة الدهنية البنية، يزداد أيضا بشكل كبير بعد ثمانية أيام من الحث البنيadipogenic.منذ معظم بروتوكول العزل NCADSC بسيطة واقتصادية، ولا تتطلب استخدام الأجسام المضادة، لذلك، فإن شدة أسباب السوائل القوية من IFP يمكن أن تحسن كفاءة التغذية FACS.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Isolation and Enrichment of Human Adipose-derived Stromal Cells for Enhanced Osteogenesis

العزلة وإثراء الإنسان الدهنية المشتقة من خلايا انسجة لتعزيز تكون العظم

Bone marrow-derived mesenchymal stromal cells (BM-MSCs) are considered the gold standard for stem cell-based tissue engineering applications. However, the ...

Direct Induction of Human Neural Stem Cells from Peripheral Blood Hematopoietic Progenitor Cells

الحث المباشر من العصبية الإنسان الخلايا الجذعية من خلايا الدم المحيطي المكونة للدم السلف

Human disease specific neuronal cultures are essential for generating in vitro models for human neurological diseases. However, the lack of access to ...

Culturing Human Pluripotent and Neural Stem Cells in an Enclosed Cell Culture System for Basic and Preclinical Research

زراعة متعددة القدرات البشرية والعصبية الخلايا الجذعية في نظام زراعة الخلايا المغلقة للبحوث الأساسية وقبل السريرية

This paper describes how to use a custom manufactured, commercially available enclosed cell culture system for basic and preclinical research. Biosafety ...

Isolation and Differentiation of Adipose-Derived Stem Cells from Porcine Subcutaneous Adipose Tissues

العزلة وتمايز الخلايا الجذعية الدهنية المشتقة من الخنزير تحت الجلد الدهنية الأنسجة

Obesity is an unconstrained worldwide epidemic. Unraveling molecular controls in adipose tissue development holds promise to treat obesity or diabetes. ...

Immunomagnetic Separation of Fat Depot-specific Sca1high Adipose-derived Stem Cells (ASCs)

Immunomagnetic Separation of Fat Depot-specific Sca1high Adipose-derived Stem Cells ASCs

الفصل Immunomagnetic من Sca1 الدهون مستودع محددة<sup&gt; عالية</sup&gt; الدهنية المشتقة من الخلايا الجذعية (مخولا لصيانة طائرات)

The isolation of adipose-derived stem cells (ASCs) is an important method in the field of adipose tissue biology, adipogenesis, and extracellular matrix ...

Isolation and Expansion of Mesenchymal Stem/Stromal Cells Derived from Human Placenta Tissue

العزل والتوسع في الجذعية الوسيطة / خلايا انسجة مشتقة من المشيمة البشرية الأنسجة

Mesenchymal stem/stromal cells (MSC) are promising candidates for use in cell-based therapies. In most cases, therapeutic response appears to be cell-dose ...

Large-Scale Production of Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells Using a Highly Reproducible Small Molecule-Based Differentiation Protocol

إنتاج واسع النطاق العضلية من الخلايا الجذعية متعددة القدرات البشرية باستخدام تكرار للغاية الصغيرة وبناء جزيء بروتوكول التمايز

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust ...

Chondrogenic Differentiation Induction of Adipose-derived Stem Cells by Centrifugal Gravity

مكون للغضروف التمايز تحريض الخلايا الجذعية الدهنية المشتقة من الجاذبية الطرد المركزي

Impaired cartilage cannot heal naturally. Currently, the most advanced therapy for defects in cartilage is the transplantation of chondrocytes ...

Rapid Isolation of BMPR-IB+ Adipose-Derived Stromal Cells for Use in a Calvarial Defect Healing Model

عزل السريع لBMPR-IB + الدهنية المشتقة الخلايا اللحمية للاستخدام في قبي عيب شفاء نموذج

Invasive cancers, major injuries, and infection can cause bone defects that are too large to be reconstructed with preexisting bone from the patient's own ...

In Vivo Tracking of Human Adipose-derived Mesenchymal Stem Cells in a Rat Knee Osteoarthritis Model with Fluorescent Lipophilic Membrane Dye

In Vivo Tracking of Human Adipose-derived Mesenchymal Stem Cells in a Rat Knee Osteoarthritis Model with Fluorescent Lipophilic Membrane Dye

في فيفو تتبع البشرية المستمدة من الدهنية الخلايا الجذعية الوسيطة في نموذج الفئران هشاشة العظام ركبة مع صبغ الغشاء محبتين نيون

In order to support the clinical application of human adipose-derived mesenchymal stem cell (haMSC) therapy for knee osteoarthritis (KOA), we examined the ...