Name: isolation, culture, and adipogenic induction of neural crest original adipose-derived stem cells from periaortic adipose tissue
Uploaded: 2020-03-02T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation, Culture, and Adipogenic Induction of Neural Crest Original Adipose-Derived Stem Cells from Periaortic Adipose Tissue at JoVE.com

National Key R&D Program of China (2018YFC1312504), National Natural Science Foundation of China (81970378, 81670360, 81870293), og Videnskab og Teknologi Kommissionen i Shanghai Kommune (17411971000, 17140902402) forudsat midler til denne undersøgelse .

Dyreprotokollen er blevet gennemgået og godkendt af Animal Care Committee of Shanghai Jiao Tong University.
1. Generation af Wnt-1 Cre+/-; Rosa26RFP/+ Mus
<ol><li>Kryds Wnt-1 Cre+/- mus16 med Rosa26RFP/+ mus18 til at generere Wnt-1 Cre+/-; Rosa26RFP/+ mus. Husmus under en 12 timers lys/mørk cyklus i et patogenfrit anlæg ved 25 °C og 45% fugtighed, indtil de er 4-8 uger gamle....

<ol>
	<li>Afshin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Health+Effects+of+Overweight+and+Obesity+in+195+Countries+over+25+Years.">Health Effects of Overweight and Obesity in 195 Countries over 25 Years.</a> New England Journal of Medicine. 377 (1), 13-27 (2017).</li><li>Brown, N. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perivascular+adipose+tissue+in+vascular+function+and+disease:+a+review+of+current+research+and+animal+models.">Perivascular adipose tissue in vascular function and disease: a review of current research and animal models.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 34 (8), 1621-1630 (2014).</li><li>Britton, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevalence,+distribution,+and+risk+factor+correlates+of+high+thoracic+periaortic+fat+in+the+Framingham+Heart+Study.">Prevalence, distribution, and risk factor correlates of high thoracic periaortic fat in the Framingham Heart Study.</a> Journal of the American Heart Association. 1 (6), 004200 (2012).</li><li>Police, S. B., Thatcher, S. E., Charnigo, R., Daugherty, A., Cassis, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obesity+promotes+inflammation+in+periaortic+adipose+tissue+and+angiotensin+II-induced+abdominal+aortic+aneurysm+formation.">Obesity promotes inflammation in periaortic adipose tissue and angiotensin II-induced abdominal aortic aneurysm formation.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 29 (10), 1458-1464 (2009).</li><li>Farmer, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+control+of+adipocyte+formation.">Transcriptional control of adipocyte formation.</a> Cell Metabolism. 4 (4), 263-273 (2006).</li><li>Aune, U. L., Ruiz, L., Kajimura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+differentiation+of+stromal+vascular+cells+to+beige/brite+cells.">Isolation and differentiation of stromal vascular cells to beige/brite cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (73), e50191 (2013).</li><li>Ruan, H., Zarnowski, M. J., Cushman, S. W., Lodish, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standard+isolation+of+primary+adipose+cells+from+mouse+epididymal+fat+pads+induces+inflammatory+mediators+and+down-regulates+adipocyte+genes.">Standard isolation of primary adipose cells from mouse epididymal fat pads induces inflammatory mediators and down-regulates adipocyte genes.</a> Journal of Biological Chemistry. 278 (48), 47585-47593 (2003).</li><li>Cinti, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Between+brown+and+white:+novel+aspects+of+adipocyte+differentiation.">Between brown and white: novel aspects of adipocyte differentiation.</a> Annals of Medicine. 43 (2), 104-115 (2011).</li><li>Van Harmelen, V., Rohrig, K., Hauner, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+proliferation+and+differentiation+capacity+of+human+adipocyte+precursor+cells+from+the+omental+and+subcutaneous+adipose+tissue+depot+of+obese+subjects.">Comparison of proliferation and differentiation capacity of human adipocyte precursor cells from the omental and subcutaneous adipose tissue depot of obese subjects.</a> Metabolism. 53 (5), 632-637 (2004).</li><li>Rodeheffer, M. S., Birsoy, K., Friedman, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+white+adipocyte+progenitor+cells+in+vivo.">Identification of white adipocyte progenitor cells in vivo.</a> Cell. 135 (2), 240-249 (2008).</li><li>Church, C. D., Berry, R., Rodeheffer, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+study+of+adipocyte+precursors.">Isolation and study of adipocyte precursors.</a> Methods in Enzymology. 537, 31-46 (2014).</li><li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Differentiation+of+Adipose-Derived+Stem+Cells+from+Porcine+Subcutaneous+Adipose+Tissues.">Isolation and Differentiation of Adipose-Derived Stem Cells from Porcine Subcutaneous Adipose Tissues.</a> Journal of Visualized Experiments. (109), e53886 (2016).</li><li>Ye, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+and+functional+characteristics+of+the+thoracic+aorta+perivascular+adipocyte.">Developmental and functional characteristics of the thoracic aorta perivascular adipocyte.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 76 (4), 777-789 (2019).</li><li>Medeiros, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+evolution+of+the+neural+crest:+new+perspectives+from+lamprey+and+invertebrate+neural+crest-like+cells.">The evolution of the neural crest: new perspectives from lamprey and invertebrate neural crest-like cells.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews. Developmental Biology. 2 (1), 1-15 (2013).</li><li>Fu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+Crest+Cells+Differentiate+Into+Brown+Adipocytes+and+Contribute+to+Periaortic+Arch+Adipose+Tissue+Formation.">Neural Crest Cells Differentiate Into Brown Adipocytes and Contribute to Periaortic Arch Adipose Tissue Formation.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. , (2019).</li><li>Danielian, P. S., Muccino, D., Rowitch, D. H., Michael, S. K., McMahon, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modification+of+gene+activity+in+mouse+embryos+in+utero+by+a+tamoxifen-inducible+form+of+Cre+recombinase.">Modification of gene activity in mouse embryos in utero by a tamoxifen-inducible form of Cre recombinase.</a> Current Biology. 8 (24), 1323-1326 (1998).</li><li>Tamura, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+crest-derived+stem+cells+migrate+and+differentiate+into+cardiomyocytes+after+myocardial+infarction.">Neural crest-derived stem cells migrate and differentiate into cardiomyocytes after myocardial infarction.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 31 (3), 582-589 (2011).</li><li>Madisen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+robust+and+high-throughput+Cre+reporting+and+characterization+system+for+the+whole+mouse+brain.">A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain.</a> Nature Neuroscience. 13 (1), 133-140 (2010).</li><li>Tan, P., Pepin, &. #. 2. 0. 1. ;., Lavoie, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+Adipose+Tissue+Collection+and+Processing+for+RNA+Analysis.">Mouse Adipose Tissue Collection and Processing for RNA Analysis.</a> Journal of Visualized Experiments. (131), e57026 (2018).</li><li>Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+specific+cell+population+by+fluorescence+activated+cell+sorting+(FACS).">Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS).</a> Journal of Visualized Experiments. (41), e1546 (2010).</li><li>Gupta, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zfp423+expression+identifies+committed+preadipocytes+and+localizes+to+adipose+endothelial+and+perivascular+cells.">Zfp423 expression identifies committed preadipocytes and localizes to adipose endothelial and perivascular cells.</a> Cell Metabolism. 15 (2), 230-239 (2012).</li><li>Sowa, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose+stromal+cells+contain+phenotypically+distinct+adipogenic+progenitors+derived+from+neural+crest.">Adipose stromal cells contain phenotypically distinct adipogenic progenitors derived from neural crest.</a> PLoS One. 8 (12), 84206 (2013).</li><li>Billo, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+generation+of+adipocytes+by+the+neural+crest.">The generation of adipocytes by the neural crest.</a> Development. 134 (12), 2283-2292 (2007).</li><li>Thelen, K., Ayala-Lopez, N., Watts, S. W., Contreras, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+and+Adipogenesis+Induction+of+Adipocyte+Progenitors+from+Perivascular+Adipose+Tissue+Isolated+by+Magnetic+Activated+Cell+Sorting.">Expansion and Adipogenesis Induction of Adipocyte Progenitors from Perivascular Adipose Tissue Isolated by Magnetic Activated Cell Sorting.</a> Journal of Visualized Experiments. (124), e55818 (2017).</li></ol>

I denne undersøgelse præsenterer vi en pålidelig metode til isolation, kultur og adipogen induktion af NPC'er udvundet af PVAT af Wnt-1 Cre+/-; Rosa26RFP/+ transgene mus designet til at producere RFP+ AdsCs. Tidligere rapporter viser , at der ikke er nogen væsentlig forskel i ekspressionen af generelle multipotente mesenkymale stamceller (MFC'er) markører i NCADS'er og ikke-NDC'er22, og at Nicadscs har et stærkt potentiale til at differentiere sig til adipocy...

Forekomsten af fedme er stigende på verdensplan, hvilket øger risikoen for relaterede kroniske sygdomme, herunder hjerte-kar-sygdom og diabetes1. PVAT omgiver blodkarrene og er en vigtig kilde til endokrine og paracrine faktorer, der er involveret i vaskulatur funktion. Kliniske undersøgelser viser, at højt PVAT-indhold er en uafhængig risikofaktor for hjerte-kar-sygdomme2,3, og dets patologiske funktion afhænger af fænotypen af de bestanddele fedtafledte stamceller (FDC'er)4.
Selvom ADSC cellelinjer som murine 3T3-L1, 3T3-F442A, og OP9 er nyttige cellulære modeller til at studere adipogenesis eller lipogenesis5, regulerende mekanismer for adipogenesis varierer mellem cellelinjer og primære celler. FDC'erne i den stromale vaskulære cellefraktion (SVF) isoleret direkte fra fedtvæv og induceret til at differentiere sig i adipocytter sandsynligvis opsummere in vivo adipogenesis og lipogenesis6. Men skrøbelighed, opdrift, og variationer i størrelse og immunophenotyper af AdsC'er gør deres direkte isolation udfordrende. Desuden kan de forskellige isolationsprocedurer også i væsentlig grad påvirke dissecellersphenotype og adipogene potentielle evne til at understrege behovet for en protokol, der fastholder ADSC's integritet.
Fedtvæv er typisk klassificeret som enten morfologisk og funktionelt særskilt hvidt fedtvæv (WAT), eller den brune fedtvæv (BAT)8, som huser forskellige AdsCs9. Mens AdsC'er isoleret fra perigonadal og inguinale subkutane WAT'er har været karakteriseret i tidligere undersøgelser9,10,11,12, er der mindre kendt med hensyn til FDC'er fra PVAT , som hovedsagelig består af BAT13.
I en nylig undersøgelse, fandt vi, at en del af de hjemmehørende Adsik i den periaortiske arch fedtvæv (PAAT) er afledt af neurale crest celler (NCCs), en forbigående population af vandrende stamceller celler, der stammer fra ektoderm14,15. Wnt1-Cre transgene mus blev brugt til sporing neurale crest celle udvikling16,17. Vi krydsede Wnt1-Cre+ mus med Rosa26RFP/+ mus til at generere Wnt-1 Cre+/-; Rosa26RFP/+ mus, hvor NCC'er og deres efterkommere er mærket med rødt fluorescerende protein (RFP) og let spores in vivo og in vitro15. Her beskriver vi en metode til isolering af neurale crest-afledte ADSCs (NC-afledte ADSCs eller NCADS'er) fra musePAAT og tilskynde ncadscs til at differentiere sig til hvide adipocytter eller brune adipocytter.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>4% PFA</td>
			<td>BBI life sciences</td>
			<td>E672002-0500</td>
			<td>Lot #: EC11FA0001</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>ABCONE (China)</td>
			<td>A47902</td>
			<td>1% working concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-cebp/&#945;</td>
			<td>ABclonal</td>
			<td>A0904</td>
			<td>1:1000 working concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse IgG, HRP-linked</td>
			<td>CST</td>
			<td>7076</td>
			<td>1:5000 working concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-perilipin</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>AB61682</td>
			<td>1 &#956;g/mL working concentration; lot #: GR66486-54</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-PPARy</td>
			<td>SANTA CRUZ</td>
			<td>sc-7273</td>
			<td>0.2 &#956;g/mL working concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-rabbit IgG, HRP-linked</td>
			<td>CST</td>
			<td>7074</td>
			<td>1:5000 working concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-&#946;-Tubulin</td>
			<td>CST</td>
			<td>2146</td>
			<td>1:1000 working concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>VWR life sciences</td>
			<td>0332-100G</td>
			<td>50 mg/mL working concentration; lot #: 0536C008</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase, Type I</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17018029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D4902</td>
			<td>0.1 &#181;M working concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erythrocyte Lysis Buffer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>00-4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Corning</td>
			<td>R35-076-CV</td>
			<td>50 mg/mL working concentration; lot #: R2040212FBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14025092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HDMEM</td>
			<td>Gelifesciences</td>
			<td>SH30243.01</td>
			<td>Lot #: AD20813268</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IBMX</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I7018</td>
			<td>0.5 mM working concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I3536</td>
			<td>1 &#956;g/mL working concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsurgical forceps</td>
			<td>Suzhou Mingren Medical Equipment Co.,Ltd. (China)</td>
			<td>MR-F201A-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsurgical scissor</td>
			<td>Suzhou Mingren Medical Equipment Co.,Ltd. (China)</td>
			<td>MR-H121A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oil Red O solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>O1516</td>
			<td>0.3% working concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (Phosphate buffered saline)</td>
			<td>ABCONE (China)</td>
			<td>P41970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrimeScript RT reagent Kit</td>
			<td>TAKARA</td>
			<td>RR047A</td>
			<td>Lot #: AK4802</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy kit</td>
			<td>TAKARA</td>
			<td>9767</td>
			<td>Lot #: AHF1991D</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rosa26RFP/+ mice</td>
			<td>JAX</td>
			<td>No.007909</td>
			<td>C57BL/6 backgroud; male and female</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rosiglitazone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R2408</td>
			<td>1 &#956;M working concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard forceps</td>
			<td>Suzhou Mingren Medical Equipment Co.,Ltd. (China)</td>
			<td>MR-F424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical scissor</td>
			<td>Suzhou Mingren Medical Equipment Co.,Ltd. (China)</td>
			<td>MR-S231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Premix Ex Taq</td>
			<td>TAKARA</td>
			<td>RR420A</td>
			<td>Lot #: AK9003</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triiodothyronine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T2877</td>
			<td>10 nM working concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wnt1-Cre+;PPAR&#947;flox/flox mice</td>
			<td>JAX</td>
			<td>No.009107</td>
			<td>C57BL/6 backgroud; male and female</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation, culture, and adipogenic induction of neural crest original adipose-derived stem cells from periaortic adipose tissue

En overdreven mængde fedtvæv omkring blodkarrene (perivaskulær fedtvæv, også kendt som PVAT) er forbundet med en høj risiko for hjerte-kar-sygdom. FSO'er, der stammer fra forskellige fedtvæv, viser forskellige funktioner, og dem fra PVAT har ikke været velkarakteriseret. I en nylig undersøgelse, vi rapporterede, at nogle AdsCs i den periaortiske arch fedtvæv (PAAT) nedstammer fra neurale crest celler (NCCs), en forbigående population af migrerende celler fra ektoderiet.
I dette dokument beskriver vi en protokol til isolering af rødt fluorescerende protein (RFP)-mærket NCC'er fra PAAT af Wnt-1 Cre+/-; Rosa26RFP/+ mus og fremkalde deres adipogenic differentiering in vitro. Kort, den stromale vaskulære fraktion (SVF) er enzymatisk adskilt fra PAAT, og RFP+ neurale crest afledt ADSCs (NCADS' er) isoleres af fluorescens aktiveret cellesortering (FACS). Ncadscs differentiere i både brune og hvide adipocytter, kan kryoreserveret, og bevare deres adipogene potentiale for ~ 3-5 passager. Vores protokol kan generere rigelige ADSCs fra PVAT til modellering PVAT adipogenesis eller lipogenese in vitro. Således kan disse NADS'er give et værdifuldt system til at studere de molekylære switche, der er involveret i PVAT differentiering.

Ved hjælp af den protokol, der er beskrevet ovenfor, fik vi ~0,5-1,0 x 106 AdsCs fra 5-6 Wnt-1 Cre+/-; Rosa26RFP/+ mus (48 uger gammel, mand eller kvinde).
Strømningsdiagrammet for indsamling af PAAT fra mus er præsenteret i figur 1. De ntac'ers morfologi svarede til ADSC fra andre mus fedtvæv. De kultiverede NDC'er nåede 80-90% sammenløb efter 7-8 dages kultur, og NCADSCs havde en udvidet fibroblast-lignende morfologi<strong...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation, Culture, and Adipogenic Induction of Neural Crest Original Adipose-Derived Stem Cells from Periaortic Adipose Tissue at JoVE.com

Isolation, Culture, and Adipogenic Induction of Neural Crest Original Adipose-Derived Stem Cells from Periaortic Adipose Tissue

Vi præsenterer en protokol for isolation, kultur og adipogen induktion af neurale crest afledte stamceller (NCADSCs) fra det periaortiske fedtvæv af Wnt-1 Cre+/-; Rosa26RFP/+ mus. NCADSCs kan være en let tilgængelig kilde til Adscs til modellering adipogenesis eller lipogenese in vitro.

Isolation, Kultur og adipogen induktion af neuralcrest original fedt-afledte stamceller fra periaortisk fedtvæv

An excessive amount of adipose tissue surrounding the blood vessels (perivascular adipose tissue, also known as PVAT) is associated with a high risk of ...

Vores enkle og praktiske metode kan bruges til at opnå rigelige ADSCS til at studere PVAT adipogenesis in vitro og til at teste normale lægemidler mod fedme og relaterede hjerte-kar-sygdomme. Fordelen ved denne metode er den iboende fluorescens af NCADSCs af biotin du nødt til at mærke cellerne med flou-krom konjugerede antistoffer til FACS, eller magnetisk aktiveret celle sortering. Denne metode kan bruges til at erhverve rigelige ADSC stammer fra neurale crest celler fra ectoderm at studere PVAT adipogenesis, eller lipogenese in vitro.Brug af unge mus og erfaring med ætsning og induceret adipogenesis betyder 3T3 celler er afgørende for succesen af denne protokol. Demonstration af proceduren vil være Yiding Qi, en grad studerende, og Lian Xu, en tekniker fra mit laboratorium. For PAAT dissektion, efter sterilisering af musen slagtekroppen i 75% ethanol i fem minutter, bruge en saks til at klippe og adskille huden på maven.Skær langs ventrale midterlinjen fra bækken til halsen, og åbne maven. Bevæg leveren for at eksponere mellemgulvet, og skær mellemgulvet og ribbenene på begge sider af midterlinjen. Skræl ribbenene tilbage for at afsløre hjertet og lungerne.Og fjern lungerne og thymusen. Uddrag PAAT sammen med aorta og hjerte i en petriskål. Og afbrød aorta på aorta roden for at fjerne hjertet.Derefter lave et snit mellem aorta bue og faldende aorta. Forsigtigt adskille fedtvæv omkring begge strukturer, og venstre og højre fælles halspulsårer fra den bageste brystvæg. Det er vigtigt at adskille PAAT fra roden og som en større vaskulære fartøjer omhyggeligt, er tilstedeværelsen af vaskulære vægceller kan påvirke FACS effektivitet.Vævet sættes i en petriskål indeholdende iskold HBSS-buffer. Og brug sterile kraftbecer til at fjerne så meget af vaskulaturen og fascia som muligt. Derefter overføres fedtvævet til et to milliliter Eppendorf-rør, der indeholder punkt fem milliliter iskold HBSS-buffer på is.Når alle PAAT er indsamlet, overføres det høstede fedtvæv til et nyt mikrocentrifugerør med to milliliter, der indeholder en milliliter frisklavet fordøjelsesmedium. Og brug kirurgisk saks til at hakke væv. Vævsslamenten overføres til et 50 millimeter rør med ni milliliter frisk fordøjelsesmedium.Og brug en en milliliter pipette til at triturere vævene 10 gange. Når der er opnået en homogen opløsning, inkuberes røret i 30 til 45 minutter ved 37 grader Celsius og 100 omdrejninger i minuttet, kontrolleres hvert femte til 10 minutter for at forhindre overdigestion. Når en lys gul homogen fedtvævsopløsning kan observeres ved blid hvirvel af røret, skal fordøjelsen stoppes med fem milliliter HDMEM suppleret med 10 % føtalt kvægserum.Efter en grundig blanding, centrifuge fedtvævsprøven. Den stromale vaskulære cellefraktion vil være synlig som en brunlig pellet. Re-suspendere pellet i 10 milliliter kultur medium, og filtrere celle suspension gennem en 70 mikrometer celle si.Indsamle cellerne ved en anden centrifugering. Og forsigtigt re-suspendere pellet i fem milliliter erythrocytter lysis buffer. Suspensionen overføres til et 15 milliliterrør.Efter 10 minutter standses reaktionen med to centrifugeringer i 10 milliliter PBS suppleret med 1 % føtalt kvægserum. Efter den anden centrifugering suspenderes pelletet igen i fem milliliter kulturmedium på is. Og saml cellerne med en endelig centrifugering.Derefter re-suspendere cellerne i fem milliliter FACS buffer til optælling. For at oprette en NCADSC kultur, efter deres isolering af FACS i henhold til standard protokoller, placere cellerne på en fem gange 10 til de tredje celler per centimeter kvadreret koncentration i hver brønd, en tolv godt kultur plade. Ufuldstændig kultur medium ved 37 grader Celsius og 5% kuldioxid i 20 til 24 timer.Den næste dag, vaske cellerne med 37 grader Celsius PBS, og fodre kulturen med frisk kultur medium. Når kulturen når 80 til 90% sammenløbet, behandle cellerne med to milliliter 0,25% trypsin EDTA per brønd i tre til fem minutter ved 37 grader Celsius. Når cellerne er blevet løsrevet fra bunden af pladen, neutraliseres enzymerne med to milliliter dyrket medium, og de høstede celler indsamles ved centrifugering.Re-suspendere pellet i en milliliter af frisk kultur medium til optælling. Og frø cellerne i en ny 12 brønd kultur plade i en fem gange 10 til den tredje celler per centimeter kvadreret koncentration. Derefter re-suspendere de resterende celler i kultur medium suppleret med 10% dimethylsulfoxid til frossen opbevaring i flydende nitrogen.For at fremkalde adipogen differentiering, når cellerne når en 80 til 90%sammenløb, behandle cellerne med brun eller hvid adipogenic induktion medium i to dage efter behov. Ved inkubationens afslutning vaskes cellerne forsigtigt to gange med PBS, før det relevante friske adipogeninduktionsmedium til hver brønd tilføjes, og cellerne returneres til cellekulturkubvøsen i yderligere tre til fem dages inkubation. Dyrkede NCADSCs nå en 80 til 90% sammenløb efter syv til otte dages kultur.Og demonstrere en udvidet glasfiber som morfologi. For yderligere at bekræfte deres adipogenic potentiale, olie rød farvning af de differentierede NCADSCs kan udføres for at opdage modne adipocytter. Typisk observeres modne adipocytter efter otte dages hvid eller brun adipogen induktion, hvor over 60 % af NCADS'erne udviser adipogen differentiering.Bemærk, at NCADSC'er udviser et stærkt reduceret binipogent potentiale efter aflevering. Immunoblotting og kvantitative real-time PCR viser, at ekspressionen af adipocyt specifikke relative proteiner og gener stiger betydeligt i adipogenically differentieret NCADSCs efter otte dage med hvid adipogen induktion. Tilsvarende udtrykket af adipocyt specifikke gener, og brun adipocyt specifikke gener, også betydeligt stiger efter otte dage med brun adipogenic induktion.Da de fleste NCADSC isolation protokol er enkel, økonomisk, og kræver ikke brug af antistoffer, for at de stærke flydende grunde intensiteten af IFP kan forbedre FACS næring effektivitet.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Isolation and Enrichment of Human Adipose-derived Stromal Cells for Enhanced Osteogenesis

Isolering og Berigelse af human adipøst afledte stromaceller til Enhanced Osteogenesis

Bone marrow-derived mesenchymal stromal cells (BM-MSCs) are considered the gold standard for stem cell-based tissue engineering applications. However, the ...

Direct Induction of Human Neural Stem Cells from Peripheral Blood Hematopoietic Progenitor Cells

Direkte Induktion af humane neurale stamceller fra perifert blod hæmatopoietiske stamceller

Human disease specific neuronal cultures are essential for generating in vitro models for human neurological diseases. However, the lack of access to ...

Culturing Human Pluripotent and Neural Stem Cells in an Enclosed Cell Culture System for Basic and Preclinical Research

Dyrkning Menneskelig pluripotente og neurale stamceller i en Lukket Cell Culture System for Basic og Prækliniske Research

This paper describes how to use a custom manufactured, commercially available enclosed cell culture system for basic and preclinical research. Biosafety ...

Isolation and Differentiation of Adipose-Derived Stem Cells from Porcine Subcutaneous Adipose Tissues

Isolering og differentiering af adipøst afledte stamceller fra Porcine subkutane fedtvæv

Obesity is an unconstrained worldwide epidemic. Unraveling molecular controls in adipose tissue development holds promise to treat obesity or diabetes. ...

Immunomagnetic Separation of Fat Depot-specific Sca1high Adipose-derived Stem Cells (ASCs)

Immunomagnetic Separation of Fat Depot-specific Sca1high Adipose-derived Stem Cells ASCs

Immunomagnetisk Adskillelse af Fat Depot-specifikke Sca1<sup&gt; høj</sup&gt; adipøst afledte stamceller (ASC&#39;er)

The isolation of adipose-derived stem cells (ASCs) is an important method in the field of adipose tissue biology, adipogenesis, and extracellular matrix ...

Isolation and Expansion of Mesenchymal Stem/Stromal Cells Derived from Human Placenta Tissue

Isolation og udvidelse af mesenchymstamceller / stromacellers afledt af humane Placenta Tissue

Mesenchymal stem/stromal cells (MSC) are promising candidates for use in cell-based therapies. In most cases, therapeutic response appears to be cell-dose ...

Large-Scale Production of Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells Using a Highly Reproducible Small Molecule-Based Differentiation Protocol

Storstilet produktion af cardiomyocytter fra menneskelige pluripotente stamceller Ved hjælp af en meget reproducerbar lille molekyle-Based Differentiering Protocol

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust ...

Chondrogenic Differentiation Induction of Adipose-derived Stem Cells by Centrifugal Gravity

Chondrogene differentiering Induktion af adipøst afledte stamceller ved centrifugal Gravity

Impaired cartilage cannot heal naturally. Currently, the most advanced therapy for defects in cartilage is the transplantation of chondrocytes ...

Rapid Isolation of BMPR-IB+ Adipose-Derived Stromal Cells for Use in a Calvarial Defect Healing Model

Hurtig Isolering af BMPR-IB + Adipose-afledte stromaceller til brug i en calvariale Defekt Healing Model

Invasive cancers, major injuries, and infection can cause bone defects that are too large to be reconstructed with preexisting bone from the patient's own ...

In Vivo Tracking of Human Adipose-derived Mesenchymal Stem Cells in a Rat Knee Osteoarthritis Model with Fluorescent Lipophilic Membrane Dye

In Vivo Tracking of Human Adipose-derived Mesenchymal Stem Cells in a Rat Knee Osteoarthritis Model with Fluorescent Lipophilic Membrane Dye

In Vivo Sporing af menneskers fedt-afledt mesenkymale stamceller i en rotte knæet slidgigt Model med fluorescerende lipofile membran farvestof

In order to support the clinical application of human adipose-derived mesenchymal stem cell (haMSC) therapy for knee osteoarthritis (KOA), we examined the ...