Name: isolation, culture, and adipogenic induction of neural crest original adipose-derived stem cells from periaortic adipose tissue
Uploaded: 2020-03-02T12:30:00
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National Key R&D Program of China (2018YFC1312504), National Natural Science Foundation of China (81970378, 81670360, 81870293) und Science and Technology Commission of Shanghai Municipality (17411971000, 17140902402) stellten die Mittel für diese Studie zur Verfügung. .

Das Tierprotokoll wurde vom Animal Care Committee der Shanghai Jiao Tong University überprüft und genehmigt.
1. Erzeugung von Wnt-1 Cre+/-; Rosa26RFP/+ Mäuse
<ol><li>Kreuz Wnt-1 Cre+/- Mäuse16 mit Rosa26RFP/+ Mäuse18, um Wnt-1 Cre zu erzeugen+/-; Rosa26RFP/+ Mäuse. Hausmäuse unter einem 12 h Licht/Dunkel-Zyklus in einer pathogenfreien Anlage bei 25 °C und 45% Luftfeuchtig...

<ol>
	<li>Afshin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Health+Effects+of+Overweight+and+Obesity+in+195+Countries+over+25+Years.">Health Effects of Overweight and Obesity in 195 Countries over 25 Years.</a> New England Journal of Medicine. 377 (1), 13-27 (2017).</li><li>Brown, N. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perivascular+adipose+tissue+in+vascular+function+and+disease:+a+review+of+current+research+and+animal+models.">Perivascular adipose tissue in vascular function and disease: a review of current research and animal models.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 34 (8), 1621-1630 (2014).</li><li>Britton, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevalence,+distribution,+and+risk+factor+correlates+of+high+thoracic+periaortic+fat+in+the+Framingham+Heart+Study.">Prevalence, distribution, and risk factor correlates of high thoracic periaortic fat in the Framingham Heart Study.</a> Journal of the American Heart Association. 1 (6), 004200 (2012).</li><li>Police, S. B., Thatcher, S. E., Charnigo, R., Daugherty, A., Cassis, L. 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L., Ruiz, L., Kajimura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+differentiation+of+stromal+vascular+cells+to+beige/brite+cells.">Isolation and differentiation of stromal vascular cells to beige/brite cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (73), e50191 (2013).</li><li>Ruan, H., Zarnowski, M. J., Cushman, S. W., Lodish, H. 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S., Birsoy, K., Friedman, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+white+adipocyte+progenitor+cells+in+vivo.">Identification of white adipocyte progenitor cells in vivo.</a> Cell. 135 (2), 240-249 (2008).</li><li>Church, C. D., Berry, R., Rodeheffer, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+study+of+adipocyte+precursors.">Isolation and study of adipocyte precursors.</a> Methods in Enzymology. 537, 31-46 (2014).</li><li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Differentiation+of+Adipose-Derived+Stem+Cells+from+Porcine+Subcutaneous+Adipose+Tissues.">Isolation and Differentiation of Adipose-Derived Stem Cells from Porcine Subcutaneous Adipose Tissues.</a> Journal of Visualized Experiments. (109), e53886 (2016).</li><li>Ye, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+and+functional+characteristics+of+the+thoracic+aorta+perivascular+adipocyte.">Developmental and functional characteristics of the thoracic aorta perivascular adipocyte.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 76 (4), 777-789 (2019).</li><li>Medeiros, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+evolution+of+the+neural+crest:+new+perspectives+from+lamprey+and+invertebrate+neural+crest-like+cells.">The evolution of the neural crest: new perspectives from lamprey and invertebrate neural crest-like cells.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews. Developmental Biology. 2 (1), 1-15 (2013).</li><li>Fu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+Crest+Cells+Differentiate+Into+Brown+Adipocytes+and+Contribute+to+Periaortic+Arch+Adipose+Tissue+Formation.">Neural Crest Cells Differentiate Into Brown Adipocytes and Contribute to Periaortic Arch Adipose Tissue Formation.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. , (2019).</li><li>Danielian, P. S., Muccino, D., Rowitch, D. H., Michael, S. K., McMahon, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modification+of+gene+activity+in+mouse+embryos+in+utero+by+a+tamoxifen-inducible+form+of+Cre+recombinase.">Modification of gene activity in mouse embryos in utero by a tamoxifen-inducible form of Cre recombinase.</a> Current Biology. 8 (24), 1323-1326 (1998).</li><li>Tamura, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+crest-derived+stem+cells+migrate+and+differentiate+into+cardiomyocytes+after+myocardial+infarction.">Neural crest-derived stem cells migrate and differentiate into cardiomyocytes after myocardial infarction.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 31 (3), 582-589 (2011).</li><li>Madisen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+robust+and+high-throughput+Cre+reporting+and+characterization+system+for+the+whole+mouse+brain.">A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain.</a> Nature Neuroscience. 13 (1), 133-140 (2010).</li><li>Tan, P., Pepin, &. #. 2. 0. 1. ;., Lavoie, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+Adipose+Tissue+Collection+and+Processing+for+RNA+Analysis.">Mouse Adipose Tissue Collection and Processing for RNA Analysis.</a> Journal of Visualized Experiments. (131), e57026 (2018).</li><li>Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+specific+cell+population+by+fluorescence+activated+cell+sorting+(FACS).">Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS).</a> Journal of Visualized Experiments. (41), e1546 (2010).</li><li>Gupta, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zfp423+expression+identifies+committed+preadipocytes+and+localizes+to+adipose+endothelial+and+perivascular+cells.">Zfp423 expression identifies committed preadipocytes and localizes to adipose endothelial and perivascular cells.</a> Cell Metabolism. 15 (2), 230-239 (2012).</li><li>Sowa, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose+stromal+cells+contain+phenotypically+distinct+adipogenic+progenitors+derived+from+neural+crest.">Adipose stromal cells contain phenotypically distinct adipogenic progenitors derived from neural crest.</a> PLoS One. 8 (12), 84206 (2013).</li><li>Billo, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+generation+of+adipocytes+by+the+neural+crest.">The generation of adipocytes by the neural crest.</a> Development. 134 (12), 2283-2292 (2007).</li><li>Thelen, K., Ayala-Lopez, N., Watts, S. W., Contreras, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+and+Adipogenesis+Induction+of+Adipocyte+Progenitors+from+Perivascular+Adipose+Tissue+Isolated+by+Magnetic+Activated+Cell+Sorting.">Expansion and Adipogenesis Induction of Adipocyte Progenitors from Perivascular Adipose Tissue Isolated by Magnetic Activated Cell Sorting.</a> Journal of Visualized Experiments. (124), e55818 (2017).</li></ol>

In dieser Studie stellen wir eine zuverlässige Methode für die Isolierung, Kultur und adipogene Induktion von NCADSCs dar, die aus dem PVAT von Wnt-1 Cre+/-extrahiert wurden. Rosa26RFP/+ transgene Mäuse zur Herstellung von RFP+ ADSCs. Frühere Berichte zeigen, dass es keinen signifikanten Unterschied in der Expression von allgemeinen multipotenten mesenchymalen Stammzellen (MSCs) Markern in NCADSCs und Nicht-NCADSCs22gibt und dass NCADSCs ein starkes Potenzial h...

Die Prävalenz von Adipositas nimmt weltweit zu, was das Risiko für verwandte chronische Krankheiten, einschließlich Herz-Kreislauf-Erkrankungen und Diabetes1erhöht. PVAT umgibt Blutgefäße und ist eine wichtige Quelle für endokrine und parakrine Faktoren, die an der Vaskulaturfunktion beteiligt sind. Klinische Studien zeigen, dass ein hoher PVAT-Gehalt ein unabhängiger Risikofaktor für Herz-Kreislauf-Erkrankungenist 2,3, und seine pathologische Funktion hängt vom Phänotyp der konstituierenden adipose-abgeleiteten Stammzellen (ADSCs)4ab.
Obwohl ADSC-Zelllinien wie die murinen 3T3-L1, 3T3-F442A und OP9 nützliche zelluläre Modelle sind, um Adipogenese oder Lipogenese5zu untersuchen, unterscheiden sich die regulatorischen Mechanismen für die Adipogenese zwischen Zelllinien und Primärzellen. Die ADSCs in der stromalen Vaskulären Zellfraktion (SVF) isoliert direkt aus Fettgewebeund und induziert, um in Adipozyten zu differenzieren höchstwahrscheinlich rekapitulieren in vivo Adipogenese und Lipogenese6. Die Fragilität, der Auftrieb und die Größenunterschiede und Immunphenotypen der ADSCs machen ihre direkte Isolation jedoch schwierig. Darüber hinaus können die verschiedenen Isolationsverfahren auch den Phänotyp und die adipogene Potenzialfähigkeit dieser Zellen7erheblich beeinflussen, wodurch die Notwendigkeit eines Protokolls betont wird, das die ADSC-Integrität beibehält.
Adipose-Gewebe wird in der Regel entweder als das morphologisch und funktionell ausgeprägte weiße Fettgewebe (WAT) oder das braune Fettgewebe (BAT)8klassifiziert, das unterschiedliche ADSCs9beherbergt. Während ADSCs, die aus perigonadalen und leistensubkutanen WATs isoliert sind, in früheren Studien9,10,11,12gekennzeichnet wurden, ist weniger in Bezug auf die ADSCs aus PVAT bekannt, die hauptsächlich aus BAT13bestehen.
In einer aktuellen Studie fanden wir heraus, dass ein Teil der gebietsansässigen ADSCs im periaortischen Arch-Fettgewebe (PAAT) aus neuronalen Kammzellen (NCCs) abgeleitet wird, einer vorübergehenden Population von wandernden Vorläuferzellen, die aus dem Ektoderm14,15stammen. Wnt1-Cre transgene Mäuse wurden zur Verfolgung der Entwicklung von neuronalen Kammzellen16,17verwendet. Wir kreuzten Wnt1-Cre+ Mäuse mit Rosa26RFP/+ Mäusen, um Wnt-1 Cre+/-zu erzeugen; Rosa26RFP/+ Mäuse, bei denen NCCs und ihre Nachkommen mit rotem fluoreszierendem Protein (RFP) gekennzeichnet sind und leicht in vivo und in vitro15nachverfolgt werden können. Hier beschreiben wir eine Methode zur Isolierung von neuronalen Kamm abgeleiteten ADSCs (NC-abgeleitete ADSCs oder NCADSCs) von Maus-PAAT und induzieren die NCADSCs, sich in weiße Adipozyten oder braune Adipozyten zu differenzieren.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>4% PFA</td>
			<td>BBI life sciences</td>
			<td>E672002-0500</td>
			<td>Lot #: EC11FA0001</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>ABCONE (China)</td>
			<td>A47902</td>
			<td>1% working concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-cebp/&#945;</td>
			<td>ABclonal</td>
			<td>A0904</td>
			<td>1:1000 working concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse IgG, HRP-linked</td>
			<td>CST</td>
			<td>7076</td>
			<td>1:5000 working concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-perilipin</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>AB61682</td>
			<td>1 &#956;g/mL working concentration; lot #: GR66486-54</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-PPARy</td>
			<td>SANTA CRUZ</td>
			<td>sc-7273</td>
			<td>0.2 &#956;g/mL working concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-rabbit IgG, HRP-linked</td>
			<td>CST</td>
			<td>7074</td>
			<td>1:5000 working concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-&#946;-Tubulin</td>
			<td>CST</td>
			<td>2146</td>
			<td>1:1000 working concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>VWR life sciences</td>
			<td>0332-100G</td>
			<td>50 mg/mL working concentration; lot #: 0536C008</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase, Type I</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17018029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D4902</td>
			<td>0.1 &#181;M working concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erythrocyte Lysis Buffer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>00-4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Corning</td>
			<td>R35-076-CV</td>
			<td>50 mg/mL working concentration; lot #: R2040212FBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14025092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HDMEM</td>
			<td>Gelifesciences</td>
			<td>SH30243.01</td>
			<td>Lot #: AD20813268</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IBMX</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I7018</td>
			<td>0.5 mM working concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I3536</td>
			<td>1 &#956;g/mL working concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsurgical forceps</td>
			<td>Suzhou Mingren Medical Equipment Co.,Ltd. (China)</td>
			<td>MR-F201A-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsurgical scissor</td>
			<td>Suzhou Mingren Medical Equipment Co.,Ltd. (China)</td>
			<td>MR-H121A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oil Red O solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>O1516</td>
			<td>0.3% working concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (Phosphate buffered saline)</td>
			<td>ABCONE (China)</td>
			<td>P41970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrimeScript RT reagent Kit</td>
			<td>TAKARA</td>
			<td>RR047A</td>
			<td>Lot #: AK4802</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy kit</td>
			<td>TAKARA</td>
			<td>9767</td>
			<td>Lot #: AHF1991D</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rosa26RFP/+ mice</td>
			<td>JAX</td>
			<td>No.007909</td>
			<td>C57BL/6 backgroud; male and female</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rosiglitazone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R2408</td>
			<td>1 &#956;M working concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard forceps</td>
			<td>Suzhou Mingren Medical Equipment Co.,Ltd. (China)</td>
			<td>MR-F424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical scissor</td>
			<td>Suzhou Mingren Medical Equipment Co.,Ltd. (China)</td>
			<td>MR-S231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Premix Ex Taq</td>
			<td>TAKARA</td>
			<td>RR420A</td>
			<td>Lot #: AK9003</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triiodothyronine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T2877</td>
			<td>10 nM working concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wnt1-Cre+;PPAR&#947;flox/flox mice</td>
			<td>JAX</td>
			<td>No.009107</td>
			<td>C57BL/6 backgroud; male and female</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation, culture, and adipogenic induction of neural crest original adipose-derived stem cells from periaortic adipose tissue

Eine übermäßige Menge an Fettgewebe, das die Blutgefäße umgibt (perivaskuläres Fettgewebe, auch bekannt als PVAT), ist mit einem hohen Risiko für Herz-Kreislauf-Erkrankungen verbunden. ADSCs, die aus verschiedenen Fettgeweben gewonnen wurden, weisen unterschiedliche Merkmale auf, und die von der PVAT sind nicht gut charakterisiert. In einer aktuellen Studie berichteten wir, dass einige ADSCs im periaortischen Bogenfettgewebe (PAAT) von den neuralen Kammzellen (NCCs) abstammen, einer vorübergehenden Population von Zugzellen, die aus dem Ektoderm stammen.
In diesem Beitrag beschreiben wir ein Protokoll zur Isolierung von rotem fluoreszierendem Protein (RFP)-markierten NCCs aus dem PAAT von Wnt-1 Cre+/-; Rosa26RFP/+ Mäuse und induzieren ihre adipogene Differenzierung in vitro. Kurz gesagt, die stromale Gefäßfraktion (SVF) wird enzymatisch vom PAAT getrennt, und die rFP+ neuronalen Kamm abgeleiteten ADSCs (NCADSCs) werden durch fluoreszaktivierte Zellsortierung (FACS) isoliert. Die NCADSCs unterscheiden sich sowohl in braune als auch in weiße Adipozyten, können kryokonserviert werden und behalten ihr adipogenes Potenzial für 3–5 Passagen. Unser Protokoll kann reichlich ADSCs aus dem PVAT zur Modellierung der PVAT-Adipogenese oder Lipogenese in vitro generieren. Somit können diese NCADSCs ein wertvolles System zur Untersuchung der molekularen Schalter bieten, die an der PVAT-Differenzierung beteiligt sind.

Mit dem oben beschriebenen Protokoll erhielten wir 0,5–1,0 x 106 ADSCs von 5–6 Wnt-1 Cre+/-; Rosa26RFP/+ Mäuse (48 Wochen alt, männlich oder weiblich).
Das Flussdiagramm der SAMMLUNG von PAAT von Mäusen ist in Abbildung 1dargestellt. Die Morphologie der NCADSCs ähnelte dem ADSC von anderen Mäusen Fettgewebe. Die kultivierten NCADSCs erreichten nach 7–8 Tagen Kultur 80–90 % Konfluenz, und die NCADSCs hatten eine erweite...

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Isolation, Culture, and Adipogenic Induction of Neural Crest Original Adipose-Derived Stem Cells from Periaortic Adipose Tissue

Wir präsentieren ein Protokoll zur Isolierung, Kultur und adipogene Induktion von neuronalen Kamm abgeleiteten Adipose-abgeleiteten Stammzellen (NCADSCs) aus dem periaortischen Fettgewebe von Wnt-1 Cre+/-; Rosa26RFP/+ Mäuse. Die NCADSCs können eine leicht zugängliche Quelle von ADSCs zur Modellierung von Adipogenese oder Lipogenese in vitro sein.

Isolation, Kultur und adipogene Induktion von Neural Crest Original Adipose-Derived Stem Cells from Periaortic Adipose Tissue

An excessive amount of adipose tissue surrounding the blood vessels (perivascular adipose tissue, also known as PVAT) is associated with a high risk of ...

Unsere einfache und praktische Methodik kann verwendet werden, um reichlich ADSCS für die Untersuchung der PVAT-Adipogenese in vitro und den Test normaler Medikamente gegen Fettleibigkeit und damit verbundene Herz-Kreislauf-Erkrankungen zu erhalten. Der Vorteil dieser Methode ist die inhärente Fluoreszenz der NCADSCs von Biotin, die Sie benötigen, um die Zellen mit flou-chrom konjugierten Antikörpern für FACS oder magnetisch aktivierte Zellsortierung zu kennzeichnen. Diese Methode kann verwendet werden, um reichlich ADSC aus neuronalen Kammzellen aus dem Ektoderm zu erwerben, um PVAT-Adipogenese oder Lipogenese in vitro zu untersuchen.Die Verwendung junger Mäuse und Die Erfahrung mit Kauterie und induzierter Adipogenese bedeutet, dass 3T3-Zellen entscheidend für den Erfolg dieses Protokolls sind. Demonstriert wird das Verfahren von Yiding Qi, einem Grad-Studenten, und Lian Xu, einem Techniker aus meinem Labor. Für DIE PAAT-Sektion, nach der Sterilisation der Maus Kadaver in 75%Ethanol für fünf Minuten, verwenden Sie eine Schere zu schnippen und trennen Sie die Haut auf dem Bauch.Schneiden Sie entlang der ventralen Mittellinie vom Becken bis zum Hals, und öffnen Sie den Bauch. Bewegen Sie die Leber, um das Zwerchfell freizulegen, und schneiden Sie das Zwerchfell und die Rippen auf beiden Seiten der Mittellinie. Schälen Sie die Rippen zurück, um das Herz und die Lunge freizulegen.Und entfernen Sie die Lunge und den Thymus. Extrahieren Sie die PAAT zusammen mit der Aorta und herz in eine Petrischale. Und schneiden Sie die Aorta an der Aortenwurzel ab, um das Herz zu entfernen.Dann machen Sie einen Schnitt zwischen dem Aortenbogen und absteigenden Aorta. Trennen Sie vorsichtig das Fettgewebe, das beide Strukturen umgibt, und die linken und rechten gemeinsamen Karotisarterien von der hinteren Brustwand. Es ist wichtig, die PAAT von der Wurzel zu trennen und als größere Gefäßgefäße sorgfältig, ist das Vorhandensein von Gefäßwandzellen können FACS Effizienz beeinflussen.Legen Sie das Gewebe in eine Petrischale mit eiskaltem HBSS-Puffer. Und verwenden Sie sterile Zangen, um so viel von der Vaskulatur und Faszie wie möglich zu entfernen. Dann übertragen Sie das Fettgewebe in eine zwei Milliliter Eppendorf-Röhre, die Punkt fünf Milliliter eiskalten HBSS-Puffer auf Eis enthält.Wenn alle PAAT gesammelt wurden, übertragen Sie das geerntete Fettgewebe in ein neues Zwei-Milliliter-Mikrozentrifugenrohr, das ein Milliliter frisch zubereitetes Verdauungsmedium enthält. Und verwenden Sie chirurgische Schere, um das Gewebe zu zerkleinern. Übertragen Sie die Gewebeschlämme in ein 50-Millimeter-Rohr mit neun Millilitern frischem Verdauungsmedium.Und verwenden Sie eine 1 Milliliter Pipette, um das Gewebe 10 Mal zu triturat. Wenn eine homogene Lösung erhalten ist, inkubieren Sie die Röhre für 30 bis 45 Minuten bei 37 Grad Celsius und 100 Umdrehungen pro Minute, und überprüfen Sie alle fünf bis zehn Minuten, um Überverdauungen zu verhindern. Wenn eine hellgelbe homogene Fettgewebelösung beim sanften Wirbeln der Röhre beobachtet werden kann, stoppen Sie die Verdauung mit fünf MilliliterhdMEM, ergänzt mit 10% fetalem Rinderserum.Zentrifugieren Sie nach einer gründlichen Mischung die Fettgewebeprobe. Die stromale Gefäßzellfraktion wird als bräunliches Pellet sichtbar sein. Setzen Sie das Pellet in 10 Milliliter Kulturmedium wieder auf und filtern Sie die Zellsuspension durch ein 70-Mikrometer-Zellsieb.Sammeln Sie die Zellen durch eine andere Zentrifugation. Und das Pellet vorsichtig in fünf Milliliterer Erythrozyten Lysepuffer wieder aufhängen. Übertragen Sie die Suspension auf ein 15 Milliliter Rohr.Nach 10 Minuten, stoppen Sie die Reaktion mit zwei Zentrifugationen in 10 Milliliter PBS, ergänzt mit 1%fetalem Rinderserum. Nach der zweiten Zentrifugation das Pellet in fünf MilliliterKulturmedium auf Eis wieder aufhängen. Und sammeln Sie die Zellen mit einer abschließenden Zentrifugation.Setzen Sie dann die Zellen in fünf Milliliter FACS-Puffer für die Zählung erneut aus. Um eine NCADSC-Kultur einzurichten, nach ihrer Isolierung durch FACS nach Standardprotokollen, platzieren Sie die Zellen bei einer fünfmal 10 bis dritten Zelle pro Zentimeter quadratischer Konzentration in jedem Brunnen, einer zwölf Brunnenkulturplatte. Unvollständiges Kulturmedium bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid für 20 bis 24 Stunden.Am nächsten Tag die Zellen mit 37 Grad Celsius PBS waschen und die Kultur mit frischem Kulturmedium füttern. Wenn die Kultur 80 bis 90% Konfluenz erreicht, behandeln Sie die Zellen mit zwei Millilitern von 0,25%Trypsin EDTA pro Brunnen für drei bis fünf Minuten bei 37 Grad Celsius. Wenn die Zellen von der Unterseite der Platte gelöst wurden, neutralisieren Sie die Enzyme mit zwei Millilitern kultivierten Mediums und sammeln Sie die geernteten Zellen durch Zentrifugation.Das Pellet in einem Milliliter frischem Kulturmedium zum Zählen wieder aussetzen. Und säen Sie die Zellen in einer neuen 12 Brunnenkulturplatte in einer fünfmal 10 bis dritten Zelle pro Zentimeter quadratische Konzentration. Dann, wieder aussetzen die verbleibenden Zellen in Kulturmedium mit 10%Dimethylsulfoxid für die gefrorene Lagerung in flüssigem Stickstoff ergänzt.Um eine adipogene Differenzierung zu induzieren, behandeln die Zellen, wenn sie eine Konfluenz von 80 bis 90 % erreichen, die Zellen mit braunem oder weißem adipogenem Induktionsmedium für jeweils zwei Tage. Am Ende der Inkubation die Zellen zwei Mal mit PBS vorsichtig waschen, bevor Sie jedem Brunnen das entsprechende frische adipogene Induktionsmedium hinzufügen und die Zellen für weitere drei bis fünf Tage in kubisch in den Zellkultur-Inkubator zurückbringen. Kultivierte NCADSCs erreichen nach sieben bis acht Tagen Kultur eine Konfluenz von 80 bis 90 %.Und zeigen eine erweiterte Fiberglas-ähnliche Morphologie. Um ihr adipogenes Potenzial weiter zu bestätigen, können ölrote Färbungen der differenzierten NCADSCs durchgeführt werden, um reife Adipozyten zu erkennen. Typischerweise werden reife Adipozyten nach acht Tagen weißer oder brauner adipogenicr Induktion beobachtet, wobei über 60% der NCADSCs eine adipogene Differenzierung aufweisen.Beachten Sie, dass NCADSCs nach dem Passaging ein stark reduziertes adipogenes Potenzial nachweisen. Immunoblotting und quantitative Echtzeit-PCR zeigen, dass die Expression von adipozyten spezifischen relativen Proteinen und Genen bei adipogen differenzierten NCADSCs nach acht Tagen weißer adipogener Induktion signifikant zunimmt. In ähnlicher Weise nimmt die Expression von adipozytenspezifischen Genen und braunen Adipozyten-spezifischen Genen auch nach acht Tagen brauner adipogener Induktion signifikant zu.Da die meisten NCADSC-Isolationsprotokolle einfach, wirtschaftlich und nicht den Einsatz von Antikörpern erfordern, kann die starke Flüssigkeitsintensität von IFP die Ernährungseffizienz von FACS verbessern.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Isolation and Enrichment of Human Adipose-derived Stromal Cells for Enhanced Osteogenesis

Isolierung und Anreicherung von menschlichen Fettgewebe gewonnene Stromazellen für verbesserte Osteogenesis

Bone marrow-derived mesenchymal stromal cells (BM-MSCs) are considered the gold standard for stem cell-based tissue engineering applications. However, the ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Direct Induction of Human Neural Stem Cells from Peripheral Blood Hematopoietic Progenitor Cells

Direkte Induktion von humanen neuralen Stammzellen aus peripherem Blut hämatopoetischen Vorläuferzellen

Human disease specific neuronal cultures are essential for generating in vitro models for human neurological diseases. However, the lack of access to ...

Culturing Human Pluripotent and Neural Stem Cells in an Enclosed Cell Culture System for Basic and Preclinical Research

Die Kultivierung humanen pluripotenten und Neurale Stammzellen in einem geschlossenen Zellkultursystem für Grund- und Präklinische Forschung

This paper describes how to use a custom manufactured, commercially available enclosed cell culture system for basic and preclinical research. Biosafety ...

Isolation and Differentiation of Adipose-Derived Stem Cells from Porcine Subcutaneous Adipose Tissues

Isolierung und Differenzierung von Fettgewebe gewonnenen Stammzellen aus Porcine Subkutan Fettgewebes

Obesity is an unconstrained worldwide epidemic. Unraveling molecular controls in adipose tissue development holds promise to treat obesity or diabetes. ...

Immunomagnetic Separation of Fat Depot-specific Sca1high Adipose-derived Stem Cells (ASCs)

Immunomagnetic Separation of Fat Depot-specific Sca1high Adipose-derived Stem Cells ASCs

Immunomagnetische Trennung von Fett Depot-spezifische Sca1<sup&gt; Hoch</sup&gt; Fettgewebe gewonnene Stammzellen (ASC)

The isolation of adipose-derived stem cells (ASCs) is an important method in the field of adipose tissue biology, adipogenesis, and extracellular matrix ...

Isolation and Expansion of Mesenchymal Stem/Stromal Cells Derived from Human Placenta Tissue

Isolierung und Expansion von mesenchymalen Stamm- / Stroma-Zellen aus humanen Placenta Gewebe gewonnen

Mesenchymal stem/stromal cells (MSC) are promising candidates for use in cell-based therapies. In most cases, therapeutic response appears to be cell-dose ...

Large-Scale Production of Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells Using a Highly Reproducible Small Molecule-Based Differentiation Protocol

Die Großproduktion von Kardiomyozyten aus humanen pluripotenten Stammzellen hochreproduzierbarer Kleinmolekül-basierte Differenzierung Protokoll

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust ...

Chondrogenic Differentiation Induction of Adipose-derived Stem Cells by Centrifugal Gravity

Chondrogene Differenzierung Induktion von Fettgewebe gewonnene Stammzellen durch Zentrifugalkraft Gravity

Impaired cartilage cannot heal naturally. Currently, the most advanced therapy for defects in cartilage is the transplantation of chondrocytes ...

Rapid Isolation of BMPR-IB+ Adipose-Derived Stromal Cells for Use in a Calvarial Defect Healing Model

Schnelle Isolierung von BMPR-IB + Fettgewebe gewonnene Stromazellen für die Verwendung in einem Schädeldachdefektheilung Modell

Invasive cancers, major injuries, and infection can cause bone defects that are too large to be reconstructed with preexisting bone from the patient's own ...

In Vivo Tracking of Human Adipose-derived Mesenchymal Stem Cells in a Rat Knee Osteoarthritis Model with Fluorescent Lipophilic Membrane Dye

In Vivo Tracking of Human Adipose-derived Mesenchymal Stem Cells in a Rat Knee Osteoarthritis Model with Fluorescent Lipophilic Membrane Dye

In Vivo Tracking der menschlichen Fettgewebe mesenchymalen Stammzellen in einem Rattenmodell Knie Arthrose mit fluoreszierenden lipophile Membran Farbstoff

In order to support the clinical application of human adipose-derived mesenchymal stem cell (haMSC) therapy for knee osteoarthritis (KOA), we examined the ...