Name: isolation, culture, and adipogenic induction of neural crest original adipose-derived stem cells from periaortic adipose tissue
Uploaded: 2020-03-02T12:30:00
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National Key R&D Program of China (2018YFC1312504), National Natural Science Foundation of China (81970378, 81670360, 81870293), e la Commissione scienza e tecnologia del comune di Shanghai (174111971000, 17140902402) ha fornito i fondi per questo studio .

Il protocollo sugli animali è stato rivisto e approvato dal Comitato per la cura degli animali della Shanghai Jiao Tong University.
1. Generazione di Wnt-1Cre Rosa26RfP/ Topi
<ol><li>Cross Wnt-1 Cre1 - Topi16 con rosa26RFP / mouse18 per generare Wnt-1 Cre. Topi Rosa26RFP/z. I topi della casa in un ciclo di luce/buio di 12 h in una struttura priva di agenti patogeni a 25 gradi ce...

<ol>
	<li>Afshin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Health+Effects+of+Overweight+and+Obesity+in+195+Countries+over+25+Years.">Health Effects of Overweight and Obesity in 195 Countries over 25 Years.</a> New England Journal of Medicine. 377 (1), 13-27 (2017).</li><li>Brown, N. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perivascular+adipose+tissue+in+vascular+function+and+disease:+a+review+of+current+research+and+animal+models.">Perivascular adipose tissue in vascular function and disease: a review of current research and animal models.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 34 (8), 1621-1630 (2014).</li><li>Britton, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevalence,+distribution,+and+risk+factor+correlates+of+high+thoracic+periaortic+fat+in+the+Framingham+Heart+Study.">Prevalence, distribution, and risk factor correlates of high thoracic periaortic fat in the Framingham Heart Study.</a> Journal of the American Heart Association. 1 (6), 004200 (2012).</li><li>Police, S. B., Thatcher, S. E., Charnigo, R., Daugherty, A., Cassis, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obesity+promotes+inflammation+in+periaortic+adipose+tissue+and+angiotensin+II-induced+abdominal+aortic+aneurysm+formation.">Obesity promotes inflammation in periaortic adipose tissue and angiotensin II-induced abdominal aortic aneurysm formation.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 29 (10), 1458-1464 (2009).</li><li>Farmer, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+control+of+adipocyte+formation.">Transcriptional control of adipocyte formation.</a> Cell Metabolism. 4 (4), 263-273 (2006).</li><li>Aune, U. L., Ruiz, L., Kajimura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+differentiation+of+stromal+vascular+cells+to+beige/brite+cells.">Isolation and differentiation of stromal vascular cells to beige/brite cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (73), e50191 (2013).</li><li>Ruan, H., Zarnowski, M. J., Cushman, S. W., Lodish, H. 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S., Birsoy, K., Friedman, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+white+adipocyte+progenitor+cells+in+vivo.">Identification of white adipocyte progenitor cells in vivo.</a> Cell. 135 (2), 240-249 (2008).</li><li>Church, C. D., Berry, R., Rodeheffer, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+study+of+adipocyte+precursors.">Isolation and study of adipocyte precursors.</a> Methods in Enzymology. 537, 31-46 (2014).</li><li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Differentiation+of+Adipose-Derived+Stem+Cells+from+Porcine+Subcutaneous+Adipose+Tissues.">Isolation and Differentiation of Adipose-Derived Stem Cells from Porcine Subcutaneous Adipose Tissues.</a> Journal of Visualized Experiments. (109), e53886 (2016).</li><li>Ye, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+and+functional+characteristics+of+the+thoracic+aorta+perivascular+adipocyte.">Developmental and functional characteristics of the thoracic aorta perivascular adipocyte.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 76 (4), 777-789 (2019).</li><li>Medeiros, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+evolution+of+the+neural+crest:+new+perspectives+from+lamprey+and+invertebrate+neural+crest-like+cells.">The evolution of the neural crest: new perspectives from lamprey and invertebrate neural crest-like cells.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews. Developmental Biology. 2 (1), 1-15 (2013).</li><li>Fu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+Crest+Cells+Differentiate+Into+Brown+Adipocytes+and+Contribute+to+Periaortic+Arch+Adipose+Tissue+Formation.">Neural Crest Cells Differentiate Into Brown Adipocytes and Contribute to Periaortic Arch Adipose Tissue Formation.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. , (2019).</li><li>Danielian, P. S., Muccino, D., Rowitch, D. H., Michael, S. K., McMahon, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modification+of+gene+activity+in+mouse+embryos+in+utero+by+a+tamoxifen-inducible+form+of+Cre+recombinase.">Modification of gene activity in mouse embryos in utero by a tamoxifen-inducible form of Cre recombinase.</a> Current Biology. 8 (24), 1323-1326 (1998).</li><li>Tamura, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+crest-derived+stem+cells+migrate+and+differentiate+into+cardiomyocytes+after+myocardial+infarction.">Neural crest-derived stem cells migrate and differentiate into cardiomyocytes after myocardial infarction.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 31 (3), 582-589 (2011).</li><li>Madisen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+robust+and+high-throughput+Cre+reporting+and+characterization+system+for+the+whole+mouse+brain.">A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain.</a> Nature Neuroscience. 13 (1), 133-140 (2010).</li><li>Tan, P., Pepin, &. #. 2. 0. 1. ;., Lavoie, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+Adipose+Tissue+Collection+and+Processing+for+RNA+Analysis.">Mouse Adipose Tissue Collection and Processing for RNA Analysis.</a> Journal of Visualized Experiments. (131), e57026 (2018).</li><li>Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+specific+cell+population+by+fluorescence+activated+cell+sorting+(FACS).">Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS).</a> Journal of Visualized Experiments. (41), e1546 (2010).</li><li>Gupta, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zfp423+expression+identifies+committed+preadipocytes+and+localizes+to+adipose+endothelial+and+perivascular+cells.">Zfp423 expression identifies committed preadipocytes and localizes to adipose endothelial and perivascular cells.</a> Cell Metabolism. 15 (2), 230-239 (2012).</li><li>Sowa, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose+stromal+cells+contain+phenotypically+distinct+adipogenic+progenitors+derived+from+neural+crest.">Adipose stromal cells contain phenotypically distinct adipogenic progenitors derived from neural crest.</a> PLoS One. 8 (12), 84206 (2013).</li><li>Billo, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+generation+of+adipocytes+by+the+neural+crest.">The generation of adipocytes by the neural crest.</a> Development. 134 (12), 2283-2292 (2007).</li><li>Thelen, K., Ayala-Lopez, N., Watts, S. W., Contreras, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+and+Adipogenesis+Induction+of+Adipocyte+Progenitors+from+Perivascular+Adipose+Tissue+Isolated+by+Magnetic+Activated+Cell+Sorting.">Expansion and Adipogenesis Induction of Adipocyte Progenitors from Perivascular Adipose Tissue Isolated by Magnetic Activated Cell Sorting.</a> Journal of Visualized Experiments. (124), e55818 (2017).</li></ol>

In questo studio, presentiamo un metodo affidabile per l'isolamento, la cultura e l'induzione adipogenica degli NCADSC estratti dal PVAT di Wnt-1 Cre. Topi transgenici Rosa26RFP/z progettati per la produzione di RFPe ADSC. Le relazioni precedenti mostrano che non vi è alcuna differenza significativa nell'espressione dei marcatori di cellule staminali mesenchymale (MSC) multipotenti in NCADSC e non NCADSC22e che gli NCADSC hanno un forte potenziale per differenziar...

La prevalenza dell'obesità è in aumento in tutto il mondo, il che aumenta il rischio di malattie croniche correlate, tra cui malattie cardiovascolari e diabete1. IL PVAT circonda i vasi sanguigni ed è una delle principali fonti di fattori endocrini e paracrini coinvolti nella funzione di vascolatura. Studi clinici dimostrano che l'elevato contenuto di PVAT è un fattore di rischio indipendente della malattia cardiovascolare2,3, e la sua funzione patologica dipende dal fenotipo delle cellule staminali derivate da adiposa costitutive (ADSC)4.
Anche se le linee cellulari ADSC come il murino 3T3-L1, 3T3-F442A e OP9 sono utili modelli cellulari per studiare l'adipogenesi o la lipogenesi5, i meccanismi regolatori per l'adipogenesi differiscono tra le linee cellulari e le cellule primarie. Gli ADSC nella frazione di cellula vascolare stromale (SVF) isolati direttamente dai tessuti adiposi e indotti a differenziarsi in adipociti molto probabilmente ricapitolano in vivo adipogenesi e lipogenesi6. Tuttavia, la fragilità, la galleggiabilità e le variazioni di dimensioni e immunofenotipi degli ADSC rendono difficile il loro isolamento diretto. Inoltre, le diverse procedure di isolamento possono anche influenzare in modo significativo il fenotipo e la capacità potenziale adipogenica di queste cellule7, sottolineando così la necessità di un protocollo che mantenga l'integrità dell'ADSC.
Il tessuto adiposo è tipicamente classificato come il tessuto adiposo bianco (WAT) morfologicamente e funzionalmente distinto, o il tessuto adiposo marrone (BAT)8, che ospita ADSC distinti9. Mentre gli ADSC isolati dai WAT sottocutanei perigonadali e inguinali sono stati caratterizzati negli studi precedenti9,10,11,12, meno è noto per quanto riguarda gli ADSC da PVAT che è composto principalmente da BAT13.
In uno studio recente, abbiamo scoperto che una parte degli ADSC residenti nel tessuto adiposo dell'arco periaortico (PAAT) è derivata da cellule della cresta neurale (NCC), una popolazione transitoria di cellule progenitrici migratorie che provengono dall'ectoderma14,15. I topi transgenici Wnt1-Cre sono stati utilizzati per tracciare lo sviluppo delle cellule della cresta neurale16,17. Abbiamo attraversatoi topi Wnt1-Cre con i topi Rosa26RFP/ s per generare Wnt-1Cre. I topi Rosa26RFP/z, in cui gli NCC e i loro discendenti sono etichettati con proteine fluorescenti rosse (RFP) e sono facilmente rintracciabili in vivo e in vitro15. In questo articolo viene descritto un metodo per isolare gli ADSC derivati dalla cresta neurale (ADSC derivati da NC o NCADSC) dal PAAT del topo e induriamo gli NCADSC a differenziarsi in adipociti bianchi o adipociti bruni.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>4% PFA</td>
			<td>BBI life sciences</td>
			<td>E672002-0500</td>
			<td>Lot #: EC11FA0001</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>ABCONE (China)</td>
			<td>A47902</td>
			<td>1% working concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-cebp/&#945;</td>
			<td>ABclonal</td>
			<td>A0904</td>
			<td>1:1000 working concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse IgG, HRP-linked</td>
			<td>CST</td>
			<td>7076</td>
			<td>1:5000 working concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-perilipin</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>AB61682</td>
			<td>1 &#956;g/mL working concentration; lot #: GR66486-54</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-PPARy</td>
			<td>SANTA CRUZ</td>
			<td>sc-7273</td>
			<td>0.2 &#956;g/mL working concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-rabbit IgG, HRP-linked</td>
			<td>CST</td>
			<td>7074</td>
			<td>1:5000 working concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-&#946;-Tubulin</td>
			<td>CST</td>
			<td>2146</td>
			<td>1:1000 working concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>VWR life sciences</td>
			<td>0332-100G</td>
			<td>50 mg/mL working concentration; lot #: 0536C008</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase, Type I</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17018029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D4902</td>
			<td>0.1 &#181;M working concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erythrocyte Lysis Buffer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>00-4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Corning</td>
			<td>R35-076-CV</td>
			<td>50 mg/mL working concentration; lot #: R2040212FBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14025092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HDMEM</td>
			<td>Gelifesciences</td>
			<td>SH30243.01</td>
			<td>Lot #: AD20813268</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IBMX</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I7018</td>
			<td>0.5 mM working concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I3536</td>
			<td>1 &#956;g/mL working concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsurgical forceps</td>
			<td>Suzhou Mingren Medical Equipment Co.,Ltd. (China)</td>
			<td>MR-F201A-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsurgical scissor</td>
			<td>Suzhou Mingren Medical Equipment Co.,Ltd. (China)</td>
			<td>MR-H121A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oil Red O solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>O1516</td>
			<td>0.3% working concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (Phosphate buffered saline)</td>
			<td>ABCONE (China)</td>
			<td>P41970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrimeScript RT reagent Kit</td>
			<td>TAKARA</td>
			<td>RR047A</td>
			<td>Lot #: AK4802</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy kit</td>
			<td>TAKARA</td>
			<td>9767</td>
			<td>Lot #: AHF1991D</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rosa26RFP/+ mice</td>
			<td>JAX</td>
			<td>No.007909</td>
			<td>C57BL/6 backgroud; male and female</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rosiglitazone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R2408</td>
			<td>1 &#956;M working concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard forceps</td>
			<td>Suzhou Mingren Medical Equipment Co.,Ltd. (China)</td>
			<td>MR-F424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical scissor</td>
			<td>Suzhou Mingren Medical Equipment Co.,Ltd. (China)</td>
			<td>MR-S231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Premix Ex Taq</td>
			<td>TAKARA</td>
			<td>RR420A</td>
			<td>Lot #: AK9003</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triiodothyronine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T2877</td>
			<td>10 nM working concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wnt1-Cre+;PPAR&#947;flox/flox mice</td>
			<td>JAX</td>
			<td>No.009107</td>
			<td>C57BL/6 backgroud; male and female</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation, culture, and adipogenic induction of neural crest original adipose-derived stem cells from periaortic adipose tissue

Una quantità eccessiva di tessuto adiposo che circonda i vasi sanguigni (tessuto adiposo perivascolare, noto anche come PVAT) è associato ad un alto rischio di malattie cardiovascolari. Gli ADSC derivati da diversi tessuti adiposi mostrano caratteristiche distinte, e quelli del PVAT non sono stati ben caratterizzati. In un recente studio, abbiamo riferito che alcuni ADSC nel tessuto adiposo arco periaortico (PAAT) discendono dalle cellule della cresta neurale (NCC), una popolazione transitoria di cellule migratorie provenienti dall'ectoderma.
In questo articolo, descriviamo un protocollo per l'isolamento delle cCI con etichettatura RFP (proteina fluorescente rossa) dal PAAT del Wnt-1Cre MiriRosa26 RFP/z e inducendo ne la differenziazione adipogenica in vitro. In breve, la frazione vascolare stromale (SVF) è enzimaticamente dissociata dal PAAT, e la RFP- ADSC derivato dalla cresta neurale (NCADSC) sono isolati dalla fluorescenza activated cell sorting (FACS). Le NCADSC si differenziano in adipociti sia marroni che bianchi, possono essere crioconservate e mantenere il loro potenziale adipogenico per passaggi da 3 a 5 dollari. Il nostro protocollo può generare ABbondanti ADSC dal PVAT per la modellazione dell'adipogenesi PVAT o della lipogenesi in vitro. Pertanto, queste NCADSC possono fornire un valido sistema per studiare gli interruttori molecolari coinvolti nella differenziazione PVAT.

Utilizzando il protocollo descritto in precedenza, abbiamo ottenuto 0,5–1,0 x 106 ADSC da 5-6 Wnt-1Cre Rosa26topi RFP/z (48 settimane, maschi o femmine).
Il diagramma di flusso della raccolta di PAAT da topi è presentato nella Figura 1. La morfologia delle NCADSC era simile all'ADSC da altri tessuti adiposi dei topi. I NCADSC coltivati hanno raggiunto l'80-90% di confluenza dopo 7-8 giorni di cultura, e gli NCADSC hanno avuto un...

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Isolation, Culture, and Adipogenic Induction of Neural Crest Original Adipose-Derived Stem Cells from Periaortic Adipose Tissue

Vi presentiamo un protocollo per l'isolamento, la coltura e l'induzione adipogenica delle cellule staminali derivate dalla cresta neurale derivate da cellule staminali derivate da adiposo (NCADSC) dal tessuto adiposo periaortico del Wnt-1Cre Topi Rosa26RFP/z. Le NCADSC possono essere una fonte facilmente accessibile di ADSC per la modellazione dell'adipogenesi o della lipogenesi in vitro.

Isolamento, cultura e induzione adipogenica di cellule staminali adipose originali adipose-derivate da cellule staminali periaortiche

An excessive amount of adipose tissue surrounding the blood vessels (perivascular adipose tissue, also known as PVAT) is associated with a high risk of ...

La nostra metodologia semplice e pratica può essere utilizzata per ottenere abbondanti ADSCS per lo studio dell'adipogenesi PVAT in vitro e per testare i normali farmaci contro l'obesità e le malattie cardiovascolari correlate. Il vantaggio di questo metodo è la fluorescenza intrinseca degli NCADSC della biotina è necessario etichettare le cellule con anticorpi coniugati flou-cromo per FACS o smistamento cellulare magnetico attivato. Questo metodo può essere usato per acquisire abbondante ADSC derivato dalle cellule della cresta neurale dall'ectoderma per studiare l'adipogenesi PVAT, o lipogenesi in vitro.L'uso di giovani topi e l'esperienza con l'adipogenesi cautera e indotta significa che le cellule 3T3 sono fondamentali per il successo di questo protocollo. A dimostrare la procedura saranno Yiding Qi, uno studente laureato, e Lian Xu, un tecnico del mio laboratorio. Per la dissezione PAAT, dopo aver sterilizzato la carcassa di topo in etanolo al 75% per cinque minuti, utilizzare le forbici per tagliare e separare la pelle sull'addome.Tagliare lungo la linea mediana ventrale dal bacino al collo e aprire l'addome. Spostare il fegato per esporre il diaframma e tagliare il diaframma e le costole su entrambi i lati della linea mediana. Sbucciare le costole per esporre il cuore e i polmoni.E rimuovere i polmoni e il timo. Estrarre il PAAT insieme all'aorta e al cuore in una piastra di Petri. E tagliare l'aorta alla radice aortica per rimuovere il cuore.Quindi, fai un taglio tra l'arco aortico e l'aorta discendente. Separare accuratamente il tessuto adiposo che circonda entrambe le strutture e le arterie carotide comuni sinistra e destra dalla parete toracica posteriore. È importante separare il PAAT dalla radice e come vasi vascolari più grandi con attenzione, è la presenza di cellule della parete vascolare che può influire sull'efficienza FACS.Mettere il tessuto in una piastra di Petri contenente tampone HBSS ghiacciato. E utilizzare forcep sterili per rimuovere il più possibile la vascucolatura e la fascia. Quindi, trasferire il tessuto adiposo in un tubo Eppendorf a due millilitri, contenente il punto cinque millilitri di tampone HBSS ghiacciato sul ghiaccio.Una volta raccolto tutto il PAAT, trasferire il tessuto adiposo raccolto in un nuovo tubo di micro-centrifuga a due millilitri contenente un millilitro di mezzo di digestione appena preparato. E usa le forbici chirurgiche per tritare i tessuti. Trasferire i liquami tissutali in un tubo da 50 millimetri contenente nove millilitri di mezzo di digestione fresco.E usa una pipetta da un millilitro per triturare i tessuti 10 volte. Quando è stata ottenuta una soluzione omogenea, incubare il tubo per 30-45 minuti a 37 gradi Celsius e 100 giri al minuto, controllando ogni cinque-10 minuti per prevenire la sovradigestione. Quando si può osservare una soluzione di tessuto adiposo omogeneo giallo chiaro al momento del delicato vortice del tubo, interrompere la digestione con cinque millilitri di HDMEM integrati con siero bovino fetale al 10%.Dopo un'accurata miscelazione, centrifugare il campione di tessuto adiposo. La frazione cellulare vascolare stromale sarà visibile come un pellet brunastro. Sospendere di nuovo il pellet in 10 millilitri di mezzo di coltura e filtrare la sospensione cellulare attraverso un filtro cellulare da 70 micrometri.Raccogliere le cellule con un'altra centrifugazione. E sospendere delicatamente il pellet in cinque millilitri di tampone di lysis degli etrociti. Trasferire la sospensione su un tubo da 15 millilitri.Dopo 10 minuti, interrompere la reazione con due centrifugazioni in 10 millilitri di PBS, integrate con siero bovino fetale all'1%. Dopo la seconda centrifugazione, sospendere di nuovo il pellet in cinque millilitri di mezzo di coltura sul ghiaccio. E raccogliere le cellule con una centrifugazione finale.Quindi, sospendere di nuovo le celle in cinque millilitri di buffer FACS per il conteggio. Per impostare una coltura NCADSC, dopo il loro isolamento da parte di FACS secondo protocolli standard, posizionare le cellule a una concentrazione di coltura di cinque volte 10 alla terza parte per centimetro quadrata in ogni pozzo, una piastra di coltura di dodici pozzi. Mezzo di coltura incompleto a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica per 20-24 ore.Il giorno dopo, lavare le cellule con 37 gradi Celsius PBS e nutrire la coltura con un mezzo di coltura fresco. Quando la coltura raggiunge l'80-90% di confluenza, trattare le cellule con due millilitri dello 0,25% di tripside EDTA per pozzo per tre o cinque minuti a 37 gradi Celsius. Quando le cellule sono state staccate dal fondo della piastra, neutralizzare gli enzimi con due millilitri di terreno coltivato e raccogliere le cellule raccolte per centrifugazione.Sospendere di nuovo il pellet in un millilitro di mezzo di coltura fresco per il conteggio. E seminare le cellule in una nuova piastra di coltura di 12 pozzi in una concentrazione di cinque volte 10-terza cellule per centimetro al quadrato. Quindi, sospendere nuovamente le restanti cellule in un mezzo di coltura integrato con solfossido di dimetile al 10% per lo stoccaggio congelato in azoto liquido.Per indurre la differenziazione adipogenica, quando le cellule raggiungono una confluenza dall'80 al 90%, trattare le cellule con mezzo di induzione adipogenico marrone o bianco per due giorni, a seconda dei casi. Al termine dell'incubazione, lavare delicatamente le cellule due volte con PBS prima di aggiungere ad ogni pozzo il mezzo di induzione adipogenico fresco appropriato e riportare le cellule nell'incubatore di coltura cellulare per altri tre o cinque giorni di incubazione. Gli NCADSC colti raggiungono una confluenza dall'80 al 90% dopo sette-otto giorni di cultura.E dimostrare una morfologia espansa simile alla fibra di vetro. Per confermare ulteriormente il loro potenziale adipogenico, è possibile eseguire la colorazione rosso olio degli NCADSC differenziati per rilevare adipociti maturi. Tipicamente, gli adipociti maturi si osservano dopo otto giorni di induzione adipogenica bianca o marrone con oltre il 60% degli NCADSC che mostrano differenziazione adipogenica.Si noti che gli NCADSC dimostrano un potenziale adipogenico notevolmente ridotto dopo la passaging. L'immunoblotting e la PCR quantitativa in tempo reale rivelano che l'espressione di proteine e geni relativi specifici adipocite aumenta significativamente negli NCADSC adipogenicamente differenziati dopo otto giorni di induzione adipogenica bianca. Allo stesso modo, l'espressione di geni specifici adipocite e geni specifici dell'adipocite marrone, aumenta significativamente anche dopo otto giorni di induzione adipogenica marrone.Poiché la maggior parte del protocollo di isolamento NCADSC è semplice, economico e non richiede l'uso di anticorpi, per questo, la forte intensità del fluido di IFP può migliorare l'efficienza di nutrimento FACS.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

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Ricerca

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