Name: isolation, culture, and adipogenic induction of neural crest original adipose-derived stem cells from periaortic adipose tissue
Uploaded: 2020-03-02T12:30:00
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中国国家主要研究開発プログラム(2018YFC1312504)、中国自然科学財団(81970378、81670360、81870293)、上海市科学技術委員会(174119710000、17140902402)が提供した。.

動物のプロトコルは、上海交通大学の動物ケア委員会によって審査され、承認されています.
1. Wnt-1 Cre+/-の生成;ローザ26RFP/+マウス
<ol><li>クロスWnt-1 Cre+/-マウス16 Rosa26RFP/+マウス18を用いて Wnt-1 Cre+/-を生成する ;ローザ26RFP/+マウス。生後4~8週間まで、病原体のない施設で12時間の明暗サ?...

<ol>
	<li>Afshin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Health+Effects+of+Overweight+and+Obesity+in+195+Countries+over+25+Years.">Health Effects of Overweight and Obesity in 195 Countries over 25 Years.</a> New England Journal of Medicine. 377 (1), 13-27 (2017).</li><li>Brown, N. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perivascular+adipose+tissue+in+vascular+function+and+disease:+a+review+of+current+research+and+animal+models.">Perivascular adipose tissue in vascular function and disease: a review of current research and animal models.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 34 (8), 1621-1630 (2014).</li><li>Britton, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevalence,+distribution,+and+risk+factor+correlates+of+high+thoracic+periaortic+fat+in+the+Framingham+Heart+Study.">Prevalence, distribution, and risk factor correlates of high thoracic periaortic fat in the Framingham Heart Study.</a> Journal of the American Heart Association. 1 (6), 004200 (2012).</li><li>Police, S. B., Thatcher, S. E., Charnigo, R., Daugherty, A., Cassis, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obesity+promotes+inflammation+in+periaortic+adipose+tissue+and+angiotensin+II-induced+abdominal+aortic+aneurysm+formation.">Obesity promotes inflammation in periaortic adipose tissue and angiotensin II-induced abdominal aortic aneurysm formation.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 29 (10), 1458-1464 (2009).</li><li>Farmer, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+control+of+adipocyte+formation.">Transcriptional control of adipocyte formation.</a> Cell Metabolism. 4 (4), 263-273 (2006).</li><li>Aune, U. L., Ruiz, L., Kajimura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+differentiation+of+stromal+vascular+cells+to+beige/brite+cells.">Isolation and differentiation of stromal vascular cells to beige/brite cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (73), e50191 (2013).</li><li>Ruan, H., Zarnowski, M. J., Cushman, S. W., Lodish, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standard+isolation+of+primary+adipose+cells+from+mouse+epididymal+fat+pads+induces+inflammatory+mediators+and+down-regulates+adipocyte+genes.">Standard isolation of primary adipose cells from mouse epididymal fat pads induces inflammatory mediators and down-regulates adipocyte genes.</a> Journal of Biological Chemistry. 278 (48), 47585-47593 (2003).</li><li>Cinti, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Between+brown+and+white:+novel+aspects+of+adipocyte+differentiation.">Between brown and white: novel aspects of adipocyte differentiation.</a> Annals of Medicine. 43 (2), 104-115 (2011).</li><li>Van Harmelen, V., Rohrig, K., Hauner, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+proliferation+and+differentiation+capacity+of+human+adipocyte+precursor+cells+from+the+omental+and+subcutaneous+adipose+tissue+depot+of+obese+subjects.">Comparison of proliferation and differentiation capacity of human adipocyte precursor cells from the omental and subcutaneous adipose tissue depot of obese subjects.</a> Metabolism. 53 (5), 632-637 (2004).</li><li>Rodeheffer, M. S., Birsoy, K., Friedman, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+white+adipocyte+progenitor+cells+in+vivo.">Identification of white adipocyte progenitor cells in vivo.</a> Cell. 135 (2), 240-249 (2008).</li><li>Church, C. D., Berry, R., Rodeheffer, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+study+of+adipocyte+precursors.">Isolation and study of adipocyte precursors.</a> Methods in Enzymology. 537, 31-46 (2014).</li><li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Differentiation+of+Adipose-Derived+Stem+Cells+from+Porcine+Subcutaneous+Adipose+Tissues.">Isolation and Differentiation of Adipose-Derived Stem Cells from Porcine Subcutaneous Adipose Tissues.</a> Journal of Visualized Experiments. (109), e53886 (2016).</li><li>Ye, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+and+functional+characteristics+of+the+thoracic+aorta+perivascular+adipocyte.">Developmental and functional characteristics of the thoracic aorta perivascular adipocyte.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 76 (4), 777-789 (2019).</li><li>Medeiros, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+evolution+of+the+neural+crest:+new+perspectives+from+lamprey+and+invertebrate+neural+crest-like+cells.">The evolution of the neural crest: new perspectives from lamprey and invertebrate neural crest-like cells.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews. Developmental Biology. 2 (1), 1-15 (2013).</li><li>Fu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+Crest+Cells+Differentiate+Into+Brown+Adipocytes+and+Contribute+to+Periaortic+Arch+Adipose+Tissue+Formation.">Neural Crest Cells Differentiate Into Brown Adipocytes and Contribute to Periaortic Arch Adipose Tissue Formation.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. , (2019).</li><li>Danielian, P. S., Muccino, D., Rowitch, D. H., Michael, S. K., McMahon, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modification+of+gene+activity+in+mouse+embryos+in+utero+by+a+tamoxifen-inducible+form+of+Cre+recombinase.">Modification of gene activity in mouse embryos in utero by a tamoxifen-inducible form of Cre recombinase.</a> Current Biology. 8 (24), 1323-1326 (1998).</li><li>Tamura, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+crest-derived+stem+cells+migrate+and+differentiate+into+cardiomyocytes+after+myocardial+infarction.">Neural crest-derived stem cells migrate and differentiate into cardiomyocytes after myocardial infarction.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 31 (3), 582-589 (2011).</li><li>Madisen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+robust+and+high-throughput+Cre+reporting+and+characterization+system+for+the+whole+mouse+brain.">A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain.</a> Nature Neuroscience. 13 (1), 133-140 (2010).</li><li>Tan, P., Pepin, &. #. 2. 0. 1. ;., Lavoie, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+Adipose+Tissue+Collection+and+Processing+for+RNA+Analysis.">Mouse Adipose Tissue Collection and Processing for RNA Analysis.</a> Journal of Visualized Experiments. (131), e57026 (2018).</li><li>Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+specific+cell+population+by+fluorescence+activated+cell+sorting+(FACS).">Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS).</a> Journal of Visualized Experiments. (41), e1546 (2010).</li><li>Gupta, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zfp423+expression+identifies+committed+preadipocytes+and+localizes+to+adipose+endothelial+and+perivascular+cells.">Zfp423 expression identifies committed preadipocytes and localizes to adipose endothelial and perivascular cells.</a> Cell Metabolism. 15 (2), 230-239 (2012).</li><li>Sowa, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose+stromal+cells+contain+phenotypically+distinct+adipogenic+progenitors+derived+from+neural+crest.">Adipose stromal cells contain phenotypically distinct adipogenic progenitors derived from neural crest.</a> PLoS One. 8 (12), 84206 (2013).</li><li>Billo, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+generation+of+adipocytes+by+the+neural+crest.">The generation of adipocytes by the neural crest.</a> Development. 134 (12), 2283-2292 (2007).</li><li>Thelen, K., Ayala-Lopez, N., Watts, S. W., Contreras, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+and+Adipogenesis+Induction+of+Adipocyte+Progenitors+from+Perivascular+Adipose+Tissue+Isolated+by+Magnetic+Activated+Cell+Sorting.">Expansion and Adipogenesis Induction of Adipocyte Progenitors from Perivascular Adipose Tissue Isolated by Magnetic Activated Cell Sorting.</a> Journal of Visualized Experiments. (124), e55818 (2017).</li></ol>

本研究では、Wnt-1 Cre+/-のPVATから抽出されたNCACの分離、培養、および食化誘導のための信頼できる方法を提示する。RFP+ ADCを製造するように設計されたRosa26RFP/+トランスジェニックマウス。これまでの報告では、NCACおよび非NCAdsC2における一般的な多能性間葉系幹細胞(CS)マーカーの発現に有意差はなく、NCAdsCはビトロ15,22,23の中でジポサイトに分化す?...

肥満の罹患率は世界的に増加しており、これは心血管疾患および糖尿病を含む関連慢性疾患のリスクを増大させる1.PVATは血管を取り囲み、血管系機能に関与する内分泌およびパラクリン因子の主要な供給源である。臨床研究は、高いPVAT含有量が心血管疾患2、3の独立した危険因子であり、その病理学的機能が構成脂肪由来幹細胞(AC)の表現型に依存することを示す4。
マウス3T3-L1、3T3-F442A、OP9などのADSC細胞株は、脂肪形成または脂肪形成5を研究するのに有用な細胞モデルであるが、脂肪形成のための調節機構は細胞株と一次細胞間で異なる。間質血管細胞画分(SVF)中のAVCは脂肪組織から直接分離し、生体内脂肪形成および脂肪形成6で再キャピテーションする可能性が最も高い脂肪細胞に分化するように誘導される。しかし、APCの脆弱性、浮力、およびサイズと免疫フェノタイプのバリエーションは、その直接的な分離を困難にします。さらに、異なる分離手順は、これらの細胞7の表現型および食前性電位能力にも大きな影響を及ぼし、したがってADSC完全性を維持するプロトコルの必要性を強調する。
脂肪組織は典型的には、形態学的および機能的に別個の白色脂肪組織(WAT)、または褐色脂肪組織(BAT)8のいずれかに分類され、これらは異なるACC9を収容する。皮下過性およびインギナル皮下WATから単離されたAVCは、以前の研究9、10、11、12で特徴付けられてきたが、BAT13を主成分とするPVATからのAVCに関してはあまり知られていない。
最近の研究では、周皮弓脂肪組織(PAAT)に存在するADCの一部が神経堤細胞(NCCs)に由来することを発見した。Wnt1-Creトランスジェニックマウスは、神経堤細胞発生16、17をトレースするために使用した。私たちは、Wnt-1 Cre+/-を生成する Rosa26RFP/+マウスと Wnt1-Cre+マウスを交配しました。Rosa26RFP/+マウスは、NCCとその子孫が赤色蛍光タンパク質(RFP)で標識され、生体内およびインビトロ15で容易に追跡される。ここでは、マウスPAATから神経堤由来AVC(NC由来AVC、またはNCAC)を分離し、白色のアディポサイトまたは褐色のアディポサイトに分化するようにNCAdsCを誘導する方法について説明する。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>4% PFA</td>
			<td>BBI life sciences</td>
			<td>E672002-0500</td>
			<td>Lot #: EC11FA0001</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>ABCONE (China)</td>
			<td>A47902</td>
			<td>1% working concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-cebp/&#945;</td>
			<td>ABclonal</td>
			<td>A0904</td>
			<td>1:1000 working concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse IgG, HRP-linked</td>
			<td>CST</td>
			<td>7076</td>
			<td>1:5000 working concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-perilipin</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>AB61682</td>
			<td>1 &#956;g/mL working concentration; lot #: GR66486-54</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-PPARy</td>
			<td>SANTA CRUZ</td>
			<td>sc-7273</td>
			<td>0.2 &#956;g/mL working concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-rabbit IgG, HRP-linked</td>
			<td>CST</td>
			<td>7074</td>
			<td>1:5000 working concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-&#946;-Tubulin</td>
			<td>CST</td>
			<td>2146</td>
			<td>1:1000 working concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>VWR life sciences</td>
			<td>0332-100G</td>
			<td>50 mg/mL working concentration; lot #: 0536C008</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase, Type I</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17018029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D4902</td>
			<td>0.1 &#181;M working concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erythrocyte Lysis Buffer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>00-4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Corning</td>
			<td>R35-076-CV</td>
			<td>50 mg/mL working concentration; lot #: R2040212FBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14025092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HDMEM</td>
			<td>Gelifesciences</td>
			<td>SH30243.01</td>
			<td>Lot #: AD20813268</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IBMX</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I7018</td>
			<td>0.5 mM working concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I3536</td>
			<td>1 &#956;g/mL working concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsurgical forceps</td>
			<td>Suzhou Mingren Medical Equipment Co.,Ltd. (China)</td>
			<td>MR-F201A-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsurgical scissor</td>
			<td>Suzhou Mingren Medical Equipment Co.,Ltd. (China)</td>
			<td>MR-H121A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oil Red O solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>O1516</td>
			<td>0.3% working concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (Phosphate buffered saline)</td>
			<td>ABCONE (China)</td>
			<td>P41970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrimeScript RT reagent Kit</td>
			<td>TAKARA</td>
			<td>RR047A</td>
			<td>Lot #: AK4802</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy kit</td>
			<td>TAKARA</td>
			<td>9767</td>
			<td>Lot #: AHF1991D</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rosa26RFP/+ mice</td>
			<td>JAX</td>
			<td>No.007909</td>
			<td>C57BL/6 backgroud; male and female</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rosiglitazone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R2408</td>
			<td>1 &#956;M working concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard forceps</td>
			<td>Suzhou Mingren Medical Equipment Co.,Ltd. (China)</td>
			<td>MR-F424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical scissor</td>
			<td>Suzhou Mingren Medical Equipment Co.,Ltd. (China)</td>
			<td>MR-S231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Premix Ex Taq</td>
			<td>TAKARA</td>
			<td>RR420A</td>
			<td>Lot #: AK9003</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triiodothyronine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T2877</td>
			<td>10 nM working concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wnt1-Cre+;PPAR&#947;flox/flox mice</td>
			<td>JAX</td>
			<td>No.009107</td>
			<td>C57BL/6 backgroud; male and female</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation, culture, and adipogenic induction of neural crest original adipose-derived stem cells from periaortic adipose tissue

血管を取り巻く脂肪組織の過剰な量(PVATとも呼ばれる血管周囲脂肪組織)は、心血管疾患のリスクが高いと関連している。異なる脂肪組織に由来するAVCは明確な特徴を示し、PVATからのAPCは十分に特徴付けされていなかった。最近の研究では、周皮弓脂肪組織(PAAT)の一部のADCが、外虫に由来する一過性の移動細胞である神経堤細胞(NCCs)から下降することを報告した。
本稿では、Wnt-1 Cre+/-のPAATから赤蛍光タンパク質(RFP)標識NCCを分離するためのプロトコルについて説明する。Rosa26RFP/+マウスと体外でのそれらの二分化を誘導します。簡単に言うと、間質血管画分(SVF)はPAATから酵素的に解離され、RFP+神経堤由来AVC(NCADSC)は蛍光活性化細胞選別(FACS)によって単離される。NCADSCは、茶色と白の両方のアディポサイトに分化し、凍結保存することができ、〜3〜5節の間、その有数可能性を保持することができます。当社のプロトコルは、PVATの脂肪形成またはインビトロでの脂肪生成のモデル化のためにPVATから豊富なAdscを生成することができる。したがって、これらのNCADSCはPVAT分化に関与する分子スイッチを研究するための貴重なシステムを提供することができる。

上記のプロトコルを使用して、5–6 Wnt-1 Cre+/-から~0.5~1.0 x 106 Adscを取得しました。Rosa26RFP/+マウス (48 週齢, 男性または女性).
マウスからのPAATの収集のフローチャートを図1に示します。NCAdsCsの形態は、他のマウス脂肪組織からのADSCに類似していた。培養されたNcAdscは、7-8日の培養後に80~90%の合流率に達し、NCAdsCは線維芽細胞?...

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Isolation, Culture, and Adipogenic Induction of Neural Crest Original Adipose-Derived Stem Cells from Periaortic Adipose Tissue

Wnt-1 Cre+/-の周産脂肪組織から誘導された脂肪由来幹細胞 (NCAC) の神経堤の分離、培養、脂肪誘導のプロトコルを提示します。ローザ26RFP/+マウス。NCAdscは、インビトロで脂肪形成または脂肪形成をモデル化するためのACの簡単にアクセス可能なソースであることができます。

神経紋の分離、培養、脂肪形成誘導、周食脂肪組織由来の脂肪由来幹細胞

An excessive amount of adipose tissue surrounding the blood vessels (perivascular adipose tissue, also known as PVAT) is associated with a high risk of ...

私たちのシンプルで実用的な方法論は、体外でPVATの藍化を研究するための豊富なADSCSを得るために、肥満および関連する心血管疾患に対するテストの正常な薬物に使用することができる。この方法の利点は、FACS、または磁気活性化細胞の並べ替えのためのflou-クロム共役抗体で細胞にラベルを付ける必要があるビオチンのNCADSCの固有の蛍光です。この方法は、外因性から神経堤細胞由来の豊富なADSCを取得してPVAT脂肪生成、またはインビトロでの脂肪生成を研究するために使用することができる。若いマウスを使用し、焼灼および誘発された異状形成の経験を有することは、3T3細胞がこのプロトコルの成功に不可欠であることを意味する。この手順のデモンストレーションは、大学院生のイディン・チーと、私の研究室の技術者であるリアン・シューです。PAAT解剖の場合、マウスの死骸を75%エタノールで5分間殺菌した後、はさみを使って腹部の皮膚を切り取り、分離する。骨盤から首に腹側の正線に沿ってカットし、腹部を開きます。肝臓を動かして横隔膜を露出させ、正中線の両側の横隔膜と肋骨を切ります。肋骨を剥がして心臓と肺を露出する。そして、肺と胸腺を取り除く。大大ターと心臓と一緒にPAATをシャーレに抽出します。そして、心臓を取り除くために大動脈根で大動脈を切断します。次に大動脈弓と下り大動脈の間に切り口を作ります。両方の構造を取り囲む脂肪組織と、後胸壁から左右の一般的な頸動脈を慎重に分離する。PAATを根から分離し、より大きな血管として慎重に、血管壁細胞の存在がFACS効率に影響を与え得ることが重要である。氷冷HBSSバッファーを含むシャーレに組織を入れます。そして、できるだけ多くの脈管構造と筋膜を取り除くために無菌鉗子を使用してください。次いで、脂肪組織を2ミリリットルのエペンドルフチューブに移し、氷の上に5ミリリットルの氷冷HBSSバッファーを含む。すべてのPAATが収集されたら、収穫した脂肪組織を、作りたての消化培地を1ミリリットル含む新しい2ミリリットルのマイクロ遠心分離管に移す。そして、組織をミンチするために外科用ハサミを使用してください。9ミリリットルの新鮮な消化媒体を含む50ミリメートルのチューブに組織スラリーを移す。そして、組織を10回トリチュレートするために1ミリリットルのピペットを使用してください。均質な溶液が得られたら、30〜45分間摂氏37度、1分あたり100回転、5分から10分ごとに消化不良を防ぎます。軽い黄色の均質な脂肪組織溶液が管の穏やかな渦巻き時に観察できる場合、10%の胎児ウシ血清を補充した5ミリリットルのHDMEMで消化を止める。十分に混合した後、脂肪組織試料を遠心分離する。この間質血管細胞分画は、褐色がかったペレットとして見える。ペレットを10ミリリットルの培養培地で再懸濁し、70マイクロメートルの細胞ストレーナーを介して細胞懸濁液を濾過する。別の遠心分離によって細胞を収集します。そして、5ミリリットルの赤血球リシスバッファー中にペレットを穏やかに再中断します。懸濁液を15ミリリットルのチューブに移します。10分後、PBSの10ミリリットルで2回の遠心分離で反応を停止し、1%の胎児のウシ血清を補充する。第2遠心分離後、氷上の培養培地を5ミリリットルに再懸濁する。そして、最終的な遠心分離で細胞を収集します。次いで、細胞を計数用のFACSバッファーの5ミリリットルで再懸濁する。NCADSC培養を設定するには、標準プロトコルに従ってFACSによって分離した後、各ウェルに5倍の10倍の3番目の細胞センチメートルの濃度、12のウェル培養プレートを配置します。37°Cで不完全な培養培地、20〜24時間の間に5%の二酸化炭素。翌日、細胞を37°CPBSで洗浄し、新鮮な培養培地で培養液を供給する。培養が80〜90%の合流度に達したら、摂氏37度で3〜5分間、1ウェルあたり0.25%トリプシンEDTAの2ミリリットルで細胞を治療する。細胞がプレートの底部から剥離されたら、培養培地を2ミリリットルで酵素を中和し、遠心分離により採取した細胞を回収する。ペレットをカウント用の新鮮な培養培地の1ミリリットルに再懸濁する。そして、新しい12ウェル培養プレートに5倍の10〜3番目の細胞/センチメートル平方濃度で播種します。次いで、残りの細胞を培地中に10%ジメチルスルホキシドを添加し、液体窒素中で凍結保存する。卵胞分化を誘導するために、細胞が80〜90%の合流度に達した場合、必要に応じて2日間、褐色または白色のアディポジェニック誘導培地で細胞を治療する。インキュベーションの最後に、PBSで細胞を2回静かに洗浄してから、適切な新鮮な希釈誘導培地を各ウェルに添加し、さらに3〜5日間の培養器に細胞を戻します。培養されたNCADSCは、培養の7〜8日後に80〜90%の合流度に達する。そして、形態のような拡大されたガラス繊維を実証する。さらにそれらの有数化の可能性を確認するために、分化したNCADSCsのオイルレッド染色を行い、成熟したアディポサイトを検出することができる。典型的には、成熟したアディポサイトは、8日間の白または褐色のアディポジェニック誘導の後に観察され、60%以上のNCADSCが異分化を呈する。NCADSCsは、過渡後のアディポジェニックポテンシャルを大幅に低下させることに注意してください。免疫ブロッティングおよび定量的リアルタイムPCRは、8日間の白色脂質誘発の後、アディポサイト特異的な相対タンパク質および遺伝子の発現が、アディポジェニック分化されたNCADSCにおいて有意に増加することを明らかにした。同様に、藍細胞特異的遺伝子の発現、および褐色のアディポサイト特異的遺伝子は、8日間の褐色脂質誘発の後にも有意に増加する。ほとんどのNCADSC絶縁プロトコルは単純で経済的で、抗体の使用を必要としないため、IFPの強い流体理由強度はFACSの栄養効率を向上させることができます。

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Isolation and Enrichment of Human Adipose-derived Stromal Cells for Enhanced Osteogenesis

強化された骨形成のためのヒト脂肪由来間質細胞の単離および濃縮

Bone marrow-derived mesenchymal stromal cells (BM-MSCs) are considered the gold standard for stem cell-based tissue engineering applications. However, the ...

Direct Induction of Human Neural Stem Cells from Peripheral Blood Hematopoietic Progenitor Cells

末梢血造血前駆細胞からヒト神経幹細胞の直接誘導

Human disease specific neuronal cultures are essential for generating in vitro models for human neurological diseases. However, the lack of access to ...

Culturing Human Pluripotent and Neural Stem Cells in an Enclosed Cell Culture System for Basic and Preclinical Research

Basicおよび前臨床研究のための密閉型細胞培養系でヒト多能性および神経幹細胞を培養します

This paper describes how to use a custom manufactured, commercially available enclosed cell culture system for basic and preclinical research. Biosafety ...

Isolation and Differentiation of Adipose-Derived Stem Cells from Porcine Subcutaneous Adipose Tissues

ブタ皮下脂肪組織から分離し、脂肪由来幹細胞の分化

Obesity is an unconstrained worldwide epidemic. Unraveling molecular controls in adipose tissue development holds promise to treat obesity or diabetes. ...

Immunomagnetic Separation of Fat Depot-specific Sca1high Adipose-derived Stem Cells (ASCs)

Immunomagnetic Separation of Fat Depot-specific Sca1high Adipose-derived Stem Cells ASCs

脂肪デポ固有のSca1の免疫磁気分離<sup&gt;高</sup&gt;脂肪由来幹細胞（ASCに）

The isolation of adipose-derived stem cells (ASCs) is an important method in the field of adipose tissue biology, adipogenesis, and extracellular matrix ...

Isolation and Expansion of Mesenchymal Stem/Stromal Cells Derived from Human Placenta Tissue

単離およびヒト胎盤組織由来の間葉系幹/間質細胞の増殖

Mesenchymal stem/stromal cells (MSC) are promising candidates for use in cell-based therapies. In most cases, therapeutic response appears to be cell-dose ...

Large-Scale Production of Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells Using a Highly Reproducible Small Molecule-Based Differentiation Protocol

再現性の高い小分子ベースの分化プロトコルを使用したヒト多能性幹細胞から心筋細胞の大規模生産

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust ...

Chondrogenic Differentiation Induction of Adipose-derived Stem Cells by Centrifugal Gravity

遠心重力によって脂肪由来幹細胞の軟骨形成分化誘導

Impaired cartilage cannot heal naturally. Currently, the most advanced therapy for defects in cartilage is the transplantation of chondrocytes ...

Rapid Isolation of BMPR-IB+ Adipose-Derived Stromal Cells for Use in a Calvarial Defect Healing Model

頭蓋冠欠損治癒モデルで使用するためのBMPR-IB +脂肪由来間質細胞の迅速な単離

Invasive cancers, major injuries, and infection can cause bone defects that are too large to be reconstructed with preexisting bone from the patient's own ...

In Vivo Tracking of Human Adipose-derived Mesenchymal Stem Cells in a Rat Knee Osteoarthritis Model with Fluorescent Lipophilic Membrane Dye

In Vivo Tracking of Human Adipose-derived Mesenchymal Stem Cells in a Rat Knee Osteoarthritis Model with Fluorescent Lipophilic Membrane Dye

生体内でひと脂肪由来間葉系幹細胞が脂溶性膜の蛍光色素をラット膝関節変形性関節症モデルでの追跡

In order to support the clinical application of human adipose-derived mesenchymal stem cell (haMSC) therapy for knee osteoarthritis (KOA), we examined the ...