Name: isolation, culture, and adipogenic induction of neural crest original adipose-derived stem cells from periaortic adipose tissue
Uploaded: 2020-03-02T12:30:00
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중국 국가 핵심 R&D 프로그램(2018YFC1312504), 중국 국립자연과학재단(81970378, 81670360, 81870293), 상하이시 과학기술위원회(17411971000, 1714090202) 기금 제공 .

동물 프로토콜은 상하이 자오퉁 대학의 동물 관리 위원회에 의해 검토되고 승인되었습니다.
1. Wnt-1 Cre+/-세대; 로사26RFP/+ 마우스
<ol><li>크로스 Wnt-1 Cre+/- 마우스16 Rosa26RFP/+ 마우스18 Wnt-1 Cre+/-생성; Rosa26RFP/+ 마우스. 25°C에서 병원균이 없는 시설에서 12시간 의 빛/암흑 주기하에 마우스를 4-8주?...

<ol>
	<li>Afshin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Health+Effects+of+Overweight+and+Obesity+in+195+Countries+over+25+Years.">Health Effects of Overweight and Obesity in 195 Countries over 25 Years.</a> New England Journal of Medicine. 377 (1), 13-27 (2017).</li><li>Brown, N. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perivascular+adipose+tissue+in+vascular+function+and+disease:+a+review+of+current+research+and+animal+models.">Perivascular adipose tissue in vascular function and disease: a review of current research and animal models.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 34 (8), 1621-1630 (2014).</li><li>Britton, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevalence,+distribution,+and+risk+factor+correlates+of+high+thoracic+periaortic+fat+in+the+Framingham+Heart+Study.">Prevalence, distribution, and risk factor correlates of high thoracic periaortic fat in the Framingham Heart Study.</a> Journal of the American Heart Association. 1 (6), 004200 (2012).</li><li>Police, S. B., Thatcher, S. E., Charnigo, R., Daugherty, A., Cassis, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obesity+promotes+inflammation+in+periaortic+adipose+tissue+and+angiotensin+II-induced+abdominal+aortic+aneurysm+formation.">Obesity promotes inflammation in periaortic adipose tissue and angiotensin II-induced abdominal aortic aneurysm formation.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 29 (10), 1458-1464 (2009).</li><li>Farmer, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+control+of+adipocyte+formation.">Transcriptional control of adipocyte formation.</a> Cell Metabolism. 4 (4), 263-273 (2006).</li><li>Aune, U. L., Ruiz, L., Kajimura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+differentiation+of+stromal+vascular+cells+to+beige/brite+cells.">Isolation and differentiation of stromal vascular cells to beige/brite cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (73), e50191 (2013).</li><li>Ruan, H., Zarnowski, M. J., Cushman, S. W., Lodish, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standard+isolation+of+primary+adipose+cells+from+mouse+epididymal+fat+pads+induces+inflammatory+mediators+and+down-regulates+adipocyte+genes.">Standard isolation of primary adipose cells from mouse epididymal fat pads induces inflammatory mediators and down-regulates adipocyte genes.</a> Journal of Biological Chemistry. 278 (48), 47585-47593 (2003).</li><li>Cinti, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Between+brown+and+white:+novel+aspects+of+adipocyte+differentiation.">Between brown and white: novel aspects of adipocyte differentiation.</a> Annals of Medicine. 43 (2), 104-115 (2011).</li><li>Van Harmelen, V., Rohrig, K., Hauner, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+proliferation+and+differentiation+capacity+of+human+adipocyte+precursor+cells+from+the+omental+and+subcutaneous+adipose+tissue+depot+of+obese+subjects.">Comparison of proliferation and differentiation capacity of human adipocyte precursor cells from the omental and subcutaneous adipose tissue depot of obese subjects.</a> Metabolism. 53 (5), 632-637 (2004).</li><li>Rodeheffer, M. S., Birsoy, K., Friedman, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+white+adipocyte+progenitor+cells+in+vivo.">Identification of white adipocyte progenitor cells in vivo.</a> Cell. 135 (2), 240-249 (2008).</li><li>Church, C. D., Berry, R., Rodeheffer, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+study+of+adipocyte+precursors.">Isolation and study of adipocyte precursors.</a> Methods in Enzymology. 537, 31-46 (2014).</li><li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Differentiation+of+Adipose-Derived+Stem+Cells+from+Porcine+Subcutaneous+Adipose+Tissues.">Isolation and Differentiation of Adipose-Derived Stem Cells from Porcine Subcutaneous Adipose Tissues.</a> Journal of Visualized Experiments. (109), e53886 (2016).</li><li>Ye, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+and+functional+characteristics+of+the+thoracic+aorta+perivascular+adipocyte.">Developmental and functional characteristics of the thoracic aorta perivascular adipocyte.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 76 (4), 777-789 (2019).</li><li>Medeiros, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+evolution+of+the+neural+crest:+new+perspectives+from+lamprey+and+invertebrate+neural+crest-like+cells.">The evolution of the neural crest: new perspectives from lamprey and invertebrate neural crest-like cells.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews. Developmental Biology. 2 (1), 1-15 (2013).</li><li>Fu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+Crest+Cells+Differentiate+Into+Brown+Adipocytes+and+Contribute+to+Periaortic+Arch+Adipose+Tissue+Formation.">Neural Crest Cells Differentiate Into Brown Adipocytes and Contribute to Periaortic Arch Adipose Tissue Formation.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. , (2019).</li><li>Danielian, P. S., Muccino, D., Rowitch, D. H., Michael, S. K., McMahon, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modification+of+gene+activity+in+mouse+embryos+in+utero+by+a+tamoxifen-inducible+form+of+Cre+recombinase.">Modification of gene activity in mouse embryos in utero by a tamoxifen-inducible form of Cre recombinase.</a> Current Biology. 8 (24), 1323-1326 (1998).</li><li>Tamura, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+crest-derived+stem+cells+migrate+and+differentiate+into+cardiomyocytes+after+myocardial+infarction.">Neural crest-derived stem cells migrate and differentiate into cardiomyocytes after myocardial infarction.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 31 (3), 582-589 (2011).</li><li>Madisen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+robust+and+high-throughput+Cre+reporting+and+characterization+system+for+the+whole+mouse+brain.">A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain.</a> Nature Neuroscience. 13 (1), 133-140 (2010).</li><li>Tan, P., Pepin, &. #. 2. 0. 1. ;., Lavoie, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+Adipose+Tissue+Collection+and+Processing+for+RNA+Analysis.">Mouse Adipose Tissue Collection and Processing for RNA Analysis.</a> Journal of Visualized Experiments. (131), e57026 (2018).</li><li>Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+specific+cell+population+by+fluorescence+activated+cell+sorting+(FACS).">Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS).</a> Journal of Visualized Experiments. (41), e1546 (2010).</li><li>Gupta, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zfp423+expression+identifies+committed+preadipocytes+and+localizes+to+adipose+endothelial+and+perivascular+cells.">Zfp423 expression identifies committed preadipocytes and localizes to adipose endothelial and perivascular cells.</a> Cell Metabolism. 15 (2), 230-239 (2012).</li><li>Sowa, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose+stromal+cells+contain+phenotypically+distinct+adipogenic+progenitors+derived+from+neural+crest.">Adipose stromal cells contain phenotypically distinct adipogenic progenitors derived from neural crest.</a> PLoS One. 8 (12), 84206 (2013).</li><li>Billo, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+generation+of+adipocytes+by+the+neural+crest.">The generation of adipocytes by the neural crest.</a> Development. 134 (12), 2283-2292 (2007).</li><li>Thelen, K., Ayala-Lopez, N., Watts, S. W., Contreras, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+and+Adipogenesis+Induction+of+Adipocyte+Progenitors+from+Perivascular+Adipose+Tissue+Isolated+by+Magnetic+Activated+Cell+Sorting.">Expansion and Adipogenesis Induction of Adipocyte Progenitors from Perivascular Adipose Tissue Isolated by Magnetic Activated Cell Sorting.</a> Journal of Visualized Experiments. (124), e55818 (2017).</li></ol>

본 연구에서는 Wnt-1 Cre+/-PVAT에서 추출된 NCADSCs의 격리, 배양 및 지방 흡입에 대한 신뢰할 수 있는 방법을 제시합니다. RfP +ADSC를 생산하도록 설계된 Rosa26RFP/+ 형질전환 마우스. 이전 보고서에 따르면 NCADSCs 및 비 NCADSCs22에서일반적인 다능성 중간엽 줄기 세포(MSCs) 마커의 발현에 유의한 차이가 없음을 보여주고, NCADSCs는 시험관 내 지방세포로 분화할 수 있는...

비만의 보급은 심장 혈관 질병 및 당뇨병을 포함하여 관련 만성 질병의 리스크를 증가시키는 세계전반 증가하고 있습니다1. PVAT는 혈관을 포위하고 혈관 기능에서 관련시킨 내분비 및 paracrine 요인의 중요한 근원입니다. 임상 연구에 따르면 높은 PVAT 함량은 심혈관 질환2,3의독립적인 위험 인자이며, 그 병리학적 기능은 성분 지방 유래 줄기 세포(ADSCs)의 표현형에 따라 달라집니다 4.
뮤린 3T3-L1, 3T3-F442A 및 OP9과 같은 ADSC 세포주들은 지질발생 또는 지방발생을 연구하는 데 유용한 세포 모델이지만5,지질발생에 대한 조절 기전은 세포주와 1차 세포 간에 차이가 있다. 지체 성 혈관 세포 분획(SVF)에서 ADSCs는 지방 조직에서 직접 분리되고 지방세포로 분화하도록 유도되어 생체 내 지방형성 및 지방발생에서 가장 가능성이 높은 회생을유도한다 6. 그러나, 연약함, 부력 및 ADSCs의 크기 및 면역 표현형의 변화는 그들의 직접적인 격리를 어렵게 만듭니다. 또한, 상이한 절연 절차는 또한 이들세포의표현형 및 지방생성 전위 능력에 유의하여, 따라서 ADSC 무결성을 유지하는 프로토콜의 필요성을 강조할 수 있다.
지방 조직은 전형적으로 형태학적으로 및 기능적으로 구별되는 백색 지방 조직(WAT) 또는 갈색 지방 조직(BAT)8로분류되며, 이는 뚜렷한 ADSCs9를수용한다. 반면 아식스는 회항나달 및 인멸피하로부터 분리된 ADSC는 이전 연구에서특징이 있었지만9,10,11,12,BAT13으로주로 구성되는 PVAT로부터의 ADSCs에 대해서는 덜 알려져 있다.
최근 연구에서, 우리는 주경 아치 지방 조직 (PAAT)에 있는 RESIDENT ADSCs의 일부가 신경 문장 세포 (NCC)에서 파생된다는 것을 것을을 발견했습니다, ectoderm14,15에서유래하는 철새 전구 세포의 일시적인 인구. Wnt1-Cre 형질전환 마우스는 신경 문장 세포 개발16,17을추적하는 데 사용되었다. 우리는 Wnt-1 Cre+/- Wnt-1 Cre+/-생성Rosa26RFP/+ 마우스와 Wnt1-Cre + 마우스를 교차; Rosa26RFP/+ 마우스는 NCC와 그 후손이 적색 형광 단백질(RFP)으로 표시되어 생체 내 및 시험관 내15에서쉽게 추적됩니다. 여기서, 우리는 마우스 PAAT로부터 신경 문장 유래 ADSCs(NC-유래 ADSCs, 또는 NCADSCs)를 분리하는 방법을 설명하고 NCADSCs를 백색 지방세포 또는 갈색 지방세포로 분화하도록 유도한다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>4% PFA</td>
			<td>BBI life sciences</td>
			<td>E672002-0500</td>
			<td>Lot #: EC11FA0001</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>ABCONE (China)</td>
			<td>A47902</td>
			<td>1% working concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-cebp/&#945;</td>
			<td>ABclonal</td>
			<td>A0904</td>
			<td>1:1000 working concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse IgG, HRP-linked</td>
			<td>CST</td>
			<td>7076</td>
			<td>1:5000 working concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-perilipin</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>AB61682</td>
			<td>1 &#956;g/mL working concentration; lot #: GR66486-54</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-PPARy</td>
			<td>SANTA CRUZ</td>
			<td>sc-7273</td>
			<td>0.2 &#956;g/mL working concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-rabbit IgG, HRP-linked</td>
			<td>CST</td>
			<td>7074</td>
			<td>1:5000 working concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-&#946;-Tubulin</td>
			<td>CST</td>
			<td>2146</td>
			<td>1:1000 working concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>VWR life sciences</td>
			<td>0332-100G</td>
			<td>50 mg/mL working concentration; lot #: 0536C008</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase, Type I</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17018029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D4902</td>
			<td>0.1 &#181;M working concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erythrocyte Lysis Buffer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>00-4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Corning</td>
			<td>R35-076-CV</td>
			<td>50 mg/mL working concentration; lot #: R2040212FBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14025092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HDMEM</td>
			<td>Gelifesciences</td>
			<td>SH30243.01</td>
			<td>Lot #: AD20813268</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IBMX</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I7018</td>
			<td>0.5 mM working concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I3536</td>
			<td>1 &#956;g/mL working concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsurgical forceps</td>
			<td>Suzhou Mingren Medical Equipment Co.,Ltd. (China)</td>
			<td>MR-F201A-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsurgical scissor</td>
			<td>Suzhou Mingren Medical Equipment Co.,Ltd. (China)</td>
			<td>MR-H121A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oil Red O solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>O1516</td>
			<td>0.3% working concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (Phosphate buffered saline)</td>
			<td>ABCONE (China)</td>
			<td>P41970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrimeScript RT reagent Kit</td>
			<td>TAKARA</td>
			<td>RR047A</td>
			<td>Lot #: AK4802</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy kit</td>
			<td>TAKARA</td>
			<td>9767</td>
			<td>Lot #: AHF1991D</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rosa26RFP/+ mice</td>
			<td>JAX</td>
			<td>No.007909</td>
			<td>C57BL/6 backgroud; male and female</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rosiglitazone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R2408</td>
			<td>1 &#956;M working concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard forceps</td>
			<td>Suzhou Mingren Medical Equipment Co.,Ltd. (China)</td>
			<td>MR-F424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical scissor</td>
			<td>Suzhou Mingren Medical Equipment Co.,Ltd. (China)</td>
			<td>MR-S231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Premix Ex Taq</td>
			<td>TAKARA</td>
			<td>RR420A</td>
			<td>Lot #: AK9003</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triiodothyronine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T2877</td>
			<td>10 nM working concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wnt1-Cre+;PPAR&#947;flox/flox mice</td>
			<td>JAX</td>
			<td>No.009107</td>
			<td>C57BL/6 backgroud; male and female</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation, culture, and adipogenic induction of neural crest original adipose-derived stem cells from periaortic adipose tissue

혈관을 둘러싼 지방 조직의 과도 한 금액 (주위 지방 조직, 일컬어 PVAT) 심혈 관 질환의 높은 위험과 관련 된. 상이한 지방 조직에서 유래한 ADSC는 뚜렷한 특징을 나타내며, PVAT로부터의 특징은 잘 특성화되지 않았다. 최근 연구에서, 우리는 periaortic 아치 지방 조직에 있는 몇몇 ADSCs가 보고했습니다 (PAAT) 신경 문장 세포에서 내려 (NCC), ectoderm에서 유래하는 철새 세포의 일시적인 인구.
이 백서에서는 Wnt-1 Cre+/-PAAT로부터 적색 형광 단백질(RFP)으로 표지된 NCC를 분리하기 위한 프로토콜을 설명합니다. Rosa26RFP/+ 마우스 및 시험관내에서 그들의 지방분화 분화를 유도한다. 간략하게, 기질 혈관 분획(SVF)은 PAAT로부터 효소적으로 해리되고,RFP+ 신경 문장 유래 ADSCs(NCADSCs)는 형광 활성화 세포 선별(FACS)에 의해 단리된다. NCADSCs는 갈색과 흰색 지방 세포로 분화하고, 저온 보존 될 수 있으며 , ~ 3-5 구절에 대한 지경 잠재력을 유지합니다. 우리의 프로토콜은 시험관 내 PVAT 지질 발생 또는 지방 형성을 모델링하기 위한 PVAT로부터 풍부한 ADSC를 생성할 수 있다. 따라서, 이러한 NCADSCs는 PVAT 분화에 관여하는 분자 스위치를 연구하기 위한 귀중한 시스템을 제공할 수 있다.

위에서 설명한 프로토콜을 사용하여 5-6 Wnt-1 Cre+/-에서~ 0.5-1.0 x 106 ADSC를 얻었습니다. Rosa26RFP/+ 마우스 (48 주 오래 된, 남성 또는 여성).
마우스에서 PAAT 컬렉션의 흐름도는 그림 1에표시됩니다. NCADSCs의 형태는 다른 마우스 지방 조직으로부터의 ADSC와 유사하였다. 배양된 NCADSCs는 7-8일 의 배양 후 80-90%의 동률에 도달했으며, NCADSCs는 ...

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Isolation, Culture, and Adipogenic Induction of Neural Crest Original Adipose-Derived Stem Cells from Periaortic Adipose Tissue

우리는 Wnt-1 Cre+/-의경피적 지방 조직으로부터 신경 문장 유래 지방 유래 줄기 세포(NCADSCs)의 분리, 배양 및 지방 흡입을 위한 프로토콜을 제시한다. Rosa26RFP/+ 마우스. NCADSCs는 시험관내 지질 발생 또는 지방 형성을 모델링하기 위한 ADSC의 쉽게 접근할 수 있는 공급원이 될 수 있다.

신경 문장 원래 지방 유래 줄기 세포의 격리, 문화 및 지방 유도는 periaortic 지방 조직에서

An excessive amount of adipose tissue surrounding the blood vessels (perivascular adipose tissue, also known as PVAT) is associated with a high risk of ...

우리의 간단하고 실용적인 방법론은 체외에서 PVAT 분리 발생을 연구하고 비만 및 관련 심혈관 질환에 대한 정상적인 약물을 테스트하기 위해 풍부한 ADSCS를 얻는 데 사용할 수 있습니다. 이 방법의 장점은 FACS, 또는 자기 활성화 세포 분류에 대한 플루 크롬 공주 항체로 세포를 라벨링할 필요가 있는 비오틴의 NCADS의 내재된 형광이다. 이 방법은 ECtoderm에서 신경 문장 세포로부터 유래된 풍부한 ADSC를 획득하여 PVAT 증분 발생, 또는 시험관내 리포발생을 연구하는 데 사용될 수 있다.젊은 마우스를 사용하고 소작과 유도 된 송포 발생을 경험하는 것은 3T3 세포가이 프로토콜의 성공에 중요하다는 것을 의미합니다. 절차를 시연하는 것은 대학원 생인 이딩 치(Yiding Qi)와 제 실험실의 기술자인 Lian Xu가 될 것입니다. PAAT 해부의 경우 마우스 시체를 75%에탄올로 5분간 살균한 후 가위를 사용하여 복부에 피부를 잘라내고 분리합니다.복부 중간선을 골반에서 목으로 자르고 복부를 엽니다. 간을 움직이면 다이어프램을 노출시키고, 중간선 양쪽의 다이어프램과 갈비뼈를 잘라냅니다. 갈비뼈를 벗겨서 심장과 폐를 노출시합니다.그리고 폐와 흉구를 제거합니다. 대자와 하트와 함께 PAAT를 페트리 접시에 넣습니다. 그리고 대동맥 뿌리에서 대동맥을 잘라 심장을 제거합니다.그런 다음 대동맥 아치와 내림차순 대동맥 사이에 잘라냅니다. 두 구조를 둘러싼 지방 조직과 왼쪽과 오른쪽 공통 경동맥을 후방 가슴 벽에서 조심스럽게 분리합니다. PAAT를 뿌리에서 분리하고 더 큰 혈관 혈관으로서 신중하게 분리하는 것이 중요하며, 혈관 벽 세포의 존재는 FACS 효율성에 영향을 미칠 수 있다.얼음 차가운 HBSS 버퍼를 포함하는 페트리 접시에 조직을 놓습니다. 그리고 멸균 집게를 사용하여 가능한 한 많은 혈관과 근막을 제거하십시오. 그런 다음, 얼음에 얼음 차가운 HBSS 버퍼의 포인트 5 밀리리터를 포함하는 2 밀리리터 Eppendorf 튜브로 지방 조직을 전송합니다.PAAT가 모두 수집되면 수확한 지방 조직을 새로 준비된 소화 매체 1밀리리터를 포함하는 새로운 2밀리리터 마이크로 원심분리기 튜브로 이송합니다. 그리고 조직을 다진 외과 가위를 사용합니다. 조직 슬러리를 신선한 소화 배지9밀리리터를 포함하는 50mm 튜브로 옮기.그리고 조직을 10 번 세트리술하기 위해 1 밀리리터 파이펫을 사용합니다. 균질한 용액을 얻었을 때, 튜브를 섭씨 37도에서 30~45분, 분당 100회 회전으로 배양하여 5~10분간격으로 과다소화를 방지합니다. 가벼운 노란색 균질 성 지방 조직 용액이 튜브의 부드러운 소용돌이시 관찰 할 수 있을 때, 10 %의 태아 소 혈청으로 보충 된 HDMEM의 5 밀리리터로 소화를 중지합니다.철저한 혼합 후, 원심분리기는 지방 조직 샘플을 원심분리합니다. 기질 혈관 세포 분수는 갈색 펠릿으로 볼 수 있습니다. 배양 배지의 10 밀리리터에서 펠릿을 다시 중단하고, 70 마이크로미터 세포 여과기를 통해 세포 현탁액을 필터링한다.다른 원심 분리에 의해 세포를 수집합니다. 그리고 적혈구 용해 버퍼의 5 밀리리터에서 펠릿을 부드럽게 다시 중단합니다. 서스펜션을 15 밀리리터 튜브로 옮기십시오.10 분 후, PBS의 10 밀리리터에서 두 개의 원심 분리로 반응을 중지, 1 %의 태아 소 혈청으로 보충. 두 번째 원심 분리 후, 얼음에 문화 배지의 다섯 밀리리터에 펠릿을 다시 중단. 그리고 최종 원심분리로 세포를 수집한다.그런 다음, 계산을 위해 FACS 버퍼의 5밀리리터에서 세포를 다시 일시 중단합니다. 표준 프로토콜에 따라 FACS에 의해 격리된 후, NCADSC 배양을 설정하려면 세포를 각 우물에서 3센티미터 제곱농도로 5배 10에 배치하여 12개의 잘 배양플레이트를 배치한다. 불완전한 배양 배지는 섭씨 37도, 이산화탄소 5%에서 20~24시간 동안 가능합니다.다음 날, 37섭씨 PBS로 세포를 씻고, 신선한 배양 배지로 배양에 먹이를 주세요. 배양이 80~90%에 도달하면 섭씨 37도에서 3~5분 동안 잘 하면 0.25%의 트립신 EDTA2밀리리터로 세포를 치료한다. 세포가 플레이트의 바닥에서 분리되었을 때, 배양 된 배지의 2 밀리리터로 효소를 중화시키고 원심 분리에 의해 수확 된 세포를 수집합니다.계산을 위한 신선한 배양 매체의 1 밀리리터에서 펠릿을 다시 중단합니다. 그리고 새로운 12 개의 잘 배양 플레이트에서 세포를 5 회 10 내지 제3 세포에 제곱 농도로 시드한다. 이어서, 액체 질소의 냉동 저장을 위해 10%디메틸 설옥산화물으로 보충된 배양 배지에서 남은 세포를 다시 중단한다.세포가 80~ 90%의 합류에 도달하면, 세포가 80~90%의 합류에 도달하면, 적절한 2일 동안 갈색 또는 백색 증식 유도 배지로 세포를 치료한다. 인큐베이션이 끝나면, PBS로 세포를 두 번 부드럽게 세척한 후 적절한 신선한 흡착 유도 배지를 각 우물에 추가하고, 세포를 추가로 3~5일 동안 세포 배양 인큐베이터로 되돌려 보냅니다. 배양 된 NCADS는 문화의 7 ~ 8 일 후 80 ~ 90 %의 합류에 도달합니다.그리고 형태와 같은 확장 된 유리 섬유를 시연합니다. 그들의 비대화 잠재력을 더욱 확인하기 위해, 차별화된 NCADS의 오일 레드 스테인링은 성숙한 지방세포들을 검출하기 위해 수행될 수 있다. 전형적으로, 성숙한 지방세포는 NCADSC의 60% 이상이 선화분화를 나타내는 백색 또는 갈색 유도8일 후에 관찰된다.NCADS는 합격 후 크게 감소 된 성포성 잠재력을 보여줍니다. 면역 블로팅 및 정량적 실시간 PCR은 백색 아디포겐성 유도8일 후에 인디포겐화 특이적 인 NCADSCs에서 지방분화 특이적 상대 단백질 및 유전자의 발현이 현저하게 증가한다는 것을 밝힙습니다. 유사하게, 지방세포 특이적 유전자의 발현, 및 갈색 지방세포 특이적 유전자는, 또한 갈색 아디포겐성 유도의 8일 후에 현저하게 증가합니다.대부분의 NCADSC 격리 프로토콜은 간단하고 경제적이며 항체의 사용을 요구하지 않기 때문에 IFP의 강력한 유체 강도는 FACS 영양 효율을 향상시킬 수 있습니다.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Isolation and Enrichment of Human Adipose-derived Stromal Cells for Enhanced Osteogenesis

분리 및 인간의 농축 향상된 골 연장술에 대한 기질 세포를 지방이 유래

Bone marrow-derived mesenchymal stromal cells (BM-MSCs) are considered the gold standard for stem cell-based tissue engineering applications. However, the ...

연구

발생학

Direct Induction of Human Neural Stem Cells from Peripheral Blood Hematopoietic Progenitor Cells

말초 혈액 조혈 전구 세포에서 인간 신경 줄기 세포의 직접 유도

Human disease specific neuronal cultures are essential for generating in vitro models for human neurological diseases. However, the lack of access to ...

Culturing Human Pluripotent and Neural Stem Cells in an Enclosed Cell Culture System for Basic and Preclinical Research

기본 및 전임상 연구 밀폐 세포 배양 시스템에서 인간 다 능성 및 신경 줄기 세포를 배양

This paper describes how to use a custom manufactured, commercially available enclosed cell culture system for basic and preclinical research. Biosafety ...

Isolation and Differentiation of Adipose-Derived Stem Cells from Porcine Subcutaneous Adipose Tissues

돼지 피하 지방이 조직에서 분리 및 지방이 유래 줄기 세포의 분화

Obesity is an unconstrained worldwide epidemic. Unraveling molecular controls in adipose tissue development holds promise to treat obesity or diabetes. ...

Immunomagnetic Separation of Fat Depot-specific Sca1high Adipose-derived Stem Cells (ASCs)

Immunomagnetic Separation of Fat Depot-specific Sca1high Adipose-derived Stem Cells ASCs

지방 창고 별 SCA1의 면역 자기 분리<sup&gt; 높은</sup&gt; 지방이 유래 줄기 세포 (의 ASC)

The isolation of adipose-derived stem cells (ASCs) is an important method in the field of adipose tissue biology, adipogenesis, and extracellular matrix ...

Isolation and Expansion of Mesenchymal Stem/Stromal Cells Derived from Human Placenta Tissue

인간 태반 조직에서 추출 분리 및 중간 엽 줄기의 확장 / 기질 세포

Mesenchymal stem/stromal cells (MSC) are promising candidates for use in cell-based therapies. In most cases, therapeutic response appears to be cell-dose ...

Large-Scale Production of Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells Using a Highly Reproducible Small Molecule-Based Differentiation Protocol

고도의 재현 작은 분자 기반의 차별화 프로토콜을 사용하여 인간 다 능성 줄기 세포로부터 심근 세포의 대규모 생산

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust ...

Chondrogenic Differentiation Induction of Adipose-derived Stem Cells by Centrifugal Gravity

원심 중력에 의해 지방이 유래 줄기 세포의 연골 분화 유도

Impaired cartilage cannot heal naturally. Currently, the most advanced therapy for defects in cartilage is the transplantation of chondrocytes ...

Rapid Isolation of BMPR-IB+ Adipose-Derived Stromal Cells for Use in a Calvarial Defect Healing Model

BMPR-IB +의 신속한 격리 두개골 결함 치유 모델에서 사용을위한 기질 세포를 지방이는 유래

Invasive cancers, major injuries, and infection can cause bone defects that are too large to be reconstructed with preexisting bone from the patient's own ...

In Vivo Tracking of Human Adipose-derived Mesenchymal Stem Cells in a Rat Knee Osteoarthritis Model with Fluorescent Lipophilic Membrane Dye

In Vivo Tracking of Human Adipose-derived Mesenchymal Stem Cells in a Rat Knee Osteoarthritis Model with Fluorescent Lipophilic Membrane Dye

Vivo에서 인간 지방 유래 중간 엽 줄기 세포 형광 질 성 막 염료와 쥐 무릎 관절염 모델에서의 추적

In order to support the clinical application of human adipose-derived mesenchymal stem cell (haMSC) therapy for knee osteoarthritis (KOA), we examined the ...