Name: isolation, culture, and adipogenic induction of neural crest original adipose-derived stem cells from periaortic adipose tissue
Uploaded: 2020-03-02T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation, Culture, and Adipogenic Induction of Neural Crest Original Adipose-Derived Stem Cells from Periaortic Adipose Tissue at JoVE.com

National Key R&D Program of China (2018YFC1312504), National Natural Science Foundation of China (81970378, 81670360, 81870293), og Science and Technology Commission of Shanghai Municipality (17411971000, 17140902402) ga midler til denne studien .

Dyreprotokollen er gjennomgått og godkjent av Dyreomsorgskomiteen ved Shanghai Jiao Tong University.
1. Generasjon av Wnt-1 Cre+/-; Rosa26RFP/+ Mus
<ol><li>Kryss Wnt-1 Cre+/- mus16 med Rosa26RFP/+ mus18 for å generere Wnt-1 Cre+/-; Rosa26RFP/+ mus. Husmus under en 12 t lys /mørk syklus i et patogenfritt anlegg ved 25 °C og 45 % fuktighet til de er 4–8 uker gamle.</li>
</ol>...

<ol>
	<li>Afshin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Health+Effects+of+Overweight+and+Obesity+in+195+Countries+over+25+Years.">Health Effects of Overweight and Obesity in 195 Countries over 25 Years.</a> New England Journal of Medicine. 377 (1), 13-27 (2017).</li><li>Brown, N. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perivascular+adipose+tissue+in+vascular+function+and+disease:+a+review+of+current+research+and+animal+models.">Perivascular adipose tissue in vascular function and disease: a review of current research and animal models.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 34 (8), 1621-1630 (2014).</li><li>Britton, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevalence,+distribution,+and+risk+factor+correlates+of+high+thoracic+periaortic+fat+in+the+Framingham+Heart+Study.">Prevalence, distribution, and risk factor correlates of high thoracic periaortic fat in the Framingham Heart Study.</a> Journal of the American Heart Association. 1 (6), 004200 (2012).</li><li>Police, S. B., Thatcher, S. E., Charnigo, R., Daugherty, A., Cassis, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obesity+promotes+inflammation+in+periaortic+adipose+tissue+and+angiotensin+II-induced+abdominal+aortic+aneurysm+formation.">Obesity promotes inflammation in periaortic adipose tissue and angiotensin II-induced abdominal aortic aneurysm formation.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 29 (10), 1458-1464 (2009).</li><li>Farmer, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+control+of+adipocyte+formation.">Transcriptional control of adipocyte formation.</a> Cell Metabolism. 4 (4), 263-273 (2006).</li><li>Aune, U. L., Ruiz, L., Kajimura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+differentiation+of+stromal+vascular+cells+to+beige/brite+cells.">Isolation and differentiation of stromal vascular cells to beige/brite cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (73), e50191 (2013).</li><li>Ruan, H., Zarnowski, M. J., Cushman, S. W., Lodish, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standard+isolation+of+primary+adipose+cells+from+mouse+epididymal+fat+pads+induces+inflammatory+mediators+and+down-regulates+adipocyte+genes.">Standard isolation of primary adipose cells from mouse epididymal fat pads induces inflammatory mediators and down-regulates adipocyte genes.</a> Journal of Biological Chemistry. 278 (48), 47585-47593 (2003).</li><li>Cinti, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Between+brown+and+white:+novel+aspects+of+adipocyte+differentiation.">Between brown and white: novel aspects of adipocyte differentiation.</a> Annals of Medicine. 43 (2), 104-115 (2011).</li><li>Van Harmelen, V., Rohrig, K., Hauner, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+proliferation+and+differentiation+capacity+of+human+adipocyte+precursor+cells+from+the+omental+and+subcutaneous+adipose+tissue+depot+of+obese+subjects.">Comparison of proliferation and differentiation capacity of human adipocyte precursor cells from the omental and subcutaneous adipose tissue depot of obese subjects.</a> Metabolism. 53 (5), 632-637 (2004).</li><li>Rodeheffer, M. S., Birsoy, K., Friedman, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+white+adipocyte+progenitor+cells+in+vivo.">Identification of white adipocyte progenitor cells in vivo.</a> Cell. 135 (2), 240-249 (2008).</li><li>Church, C. D., Berry, R., Rodeheffer, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+study+of+adipocyte+precursors.">Isolation and study of adipocyte precursors.</a> Methods in Enzymology. 537, 31-46 (2014).</li><li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Differentiation+of+Adipose-Derived+Stem+Cells+from+Porcine+Subcutaneous+Adipose+Tissues.">Isolation and Differentiation of Adipose-Derived Stem Cells from Porcine Subcutaneous Adipose Tissues.</a> Journal of Visualized Experiments. (109), e53886 (2016).</li><li>Ye, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+and+functional+characteristics+of+the+thoracic+aorta+perivascular+adipocyte.">Developmental and functional characteristics of the thoracic aorta perivascular adipocyte.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 76 (4), 777-789 (2019).</li><li>Medeiros, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+evolution+of+the+neural+crest:+new+perspectives+from+lamprey+and+invertebrate+neural+crest-like+cells.">The evolution of the neural crest: new perspectives from lamprey and invertebrate neural crest-like cells.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews. Developmental Biology. 2 (1), 1-15 (2013).</li><li>Fu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+Crest+Cells+Differentiate+Into+Brown+Adipocytes+and+Contribute+to+Periaortic+Arch+Adipose+Tissue+Formation.">Neural Crest Cells Differentiate Into Brown Adipocytes and Contribute to Periaortic Arch Adipose Tissue Formation.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. , (2019).</li><li>Danielian, P. S., Muccino, D., Rowitch, D. H., Michael, S. K., McMahon, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modification+of+gene+activity+in+mouse+embryos+in+utero+by+a+tamoxifen-inducible+form+of+Cre+recombinase.">Modification of gene activity in mouse embryos in utero by a tamoxifen-inducible form of Cre recombinase.</a> Current Biology. 8 (24), 1323-1326 (1998).</li><li>Tamura, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+crest-derived+stem+cells+migrate+and+differentiate+into+cardiomyocytes+after+myocardial+infarction.">Neural crest-derived stem cells migrate and differentiate into cardiomyocytes after myocardial infarction.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 31 (3), 582-589 (2011).</li><li>Madisen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+robust+and+high-throughput+Cre+reporting+and+characterization+system+for+the+whole+mouse+brain.">A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain.</a> Nature Neuroscience. 13 (1), 133-140 (2010).</li><li>Tan, P., Pepin, &. #. 2. 0. 1. ;., Lavoie, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+Adipose+Tissue+Collection+and+Processing+for+RNA+Analysis.">Mouse Adipose Tissue Collection and Processing for RNA Analysis.</a> Journal of Visualized Experiments. (131), e57026 (2018).</li><li>Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+specific+cell+population+by+fluorescence+activated+cell+sorting+(FACS).">Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS).</a> Journal of Visualized Experiments. (41), e1546 (2010).</li><li>Gupta, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zfp423+expression+identifies+committed+preadipocytes+and+localizes+to+adipose+endothelial+and+perivascular+cells.">Zfp423 expression identifies committed preadipocytes and localizes to adipose endothelial and perivascular cells.</a> Cell Metabolism. 15 (2), 230-239 (2012).</li><li>Sowa, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose+stromal+cells+contain+phenotypically+distinct+adipogenic+progenitors+derived+from+neural+crest.">Adipose stromal cells contain phenotypically distinct adipogenic progenitors derived from neural crest.</a> PLoS One. 8 (12), 84206 (2013).</li><li>Billo, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+generation+of+adipocytes+by+the+neural+crest.">The generation of adipocytes by the neural crest.</a> Development. 134 (12), 2283-2292 (2007).</li><li>Thelen, K., Ayala-Lopez, N., Watts, S. W., Contreras, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+and+Adipogenesis+Induction+of+Adipocyte+Progenitors+from+Perivascular+Adipose+Tissue+Isolated+by+Magnetic+Activated+Cell+Sorting.">Expansion and Adipogenesis Induction of Adipocyte Progenitors from Perivascular Adipose Tissue Isolated by Magnetic Activated Cell Sorting.</a> Journal of Visualized Experiments. (124), e55818 (2017).</li></ol>

I denne studien presenterer vi en pålitelig metode for isolasjon, kultur og adipogen induksjon av NCADSCs hentet fra PVAT av Wnt-1 Cre+/-; Rosa26RFP/+ transgene mus designet for å produsere RFP+ ADSCer. Tidligere rapporter viser at det ikke er noen signifikant forskjell i uttrykket av generelle multipotente mesenchymale stamceller (MSCer) markører i NCADSCs og ikke NCADSCs22, og at NCADSCs har et sterkt potensial til å skille seg inn i adipocytes in vitro<sup c...

Forekomsten av fedme øker over hele verden, noe som øker risikoen for relaterte kroniske sykdommer, inkludert kardiovaskulær sykdom og diabetes1. PVAT omgir blodkar og er en viktig kilde til endokrine og paracrine faktorer involvert i vaskulaturfunksjon. Kliniske studier viser at høyt PVAT-innhold er en uavhengig risikofaktor for kardiovaskulær sykdom2,3, og dens patologiske funksjon avhenger av fenotypen til bestanddelene avstolper avledede stamceller (ADSCer)4.
Selv om ADSC cellelinjer som murine 3T3-L1, 3T3-F442A og OP9 er nyttige cellulære modeller for å studere adipogenese eller lipogenesis5, er regulatoriske mekanismer for adipogenese forskjellig mellom cellelinjer og primære celler. ADSCs i stromal vaskulær celle fraksjon (SVF) isolert direkte fra fettvev og indusert til å skille seg inn i adipocytes mest sannsynlig rekapitulere in vivo adipogenesis og lipogenesis6. Men skjørhet, oppdrift og variasjonene i størrelse og immunfenotyper av ADSCs gjør deres direkte isolasjon utfordrende. I tillegg kan de ulike isolasjonsprosedyrene også påvirke fenotypen og adipogen potensiale til disse cellene7betydelig, og dermed understreke behovet for en protokoll som opprettholder ADSC-integritet.
Fettvev er vanligvis klassifisert som enten morfologisk og funksjonelt distinkt hvitt fettvev (WAT), eller det brune fettvevet (BAT)8, som har forskjellige ADSCs9. Mens ADSCs isolert fra perigonadal og inguinal subkutane WATs har vært preget i tidligere studier9,10,11,12, mindre er kjent om ADSCs fra PVAT som hovedsakelig består av BAT13.
I en nylig studie fant vi at en del av de bosatte ADSCene i periaortisk buefettvev (PAAT) er avledet fra nevrale crestceller (NCCer), en forbigående populasjon av trekkstamceller som stammer fra ektoderm14,15. Wnt1-Cre transgene mus ble brukt til sporing neural crest celle utvikling16,17. Vi krysset Wnt1-Cre+ mus med Rosa26RFP / + mus for å generere Wnt-1 Cre+/-; Rosa26RFP/+ mus, der NCCer og deres etterkommere er merket med rødt fluorescerende protein (RFP) og spores lett in vivo og in vitro15. Her beskriver vi en metode for å isolere nevrale crest avledede ADSCer (NC-avledede ADSCer eller NCADSCs) fra muse-PAAT og indusere NCADSCs til å skille seg inn i hvite adipocytter eller brune adipocytter.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>4% PFA</td>
			<td>BBI life sciences</td>
			<td>E672002-0500</td>
			<td>Lot #: EC11FA0001</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>ABCONE (China)</td>
			<td>A47902</td>
			<td>1% working concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-cebp/&#945;</td>
			<td>ABclonal</td>
			<td>A0904</td>
			<td>1:1000 working concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse IgG, HRP-linked</td>
			<td>CST</td>
			<td>7076</td>
			<td>1:5000 working concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-perilipin</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>AB61682</td>
			<td>1 &#956;g/mL working concentration; lot #: GR66486-54</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-PPARy</td>
			<td>SANTA CRUZ</td>
			<td>sc-7273</td>
			<td>0.2 &#956;g/mL working concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-rabbit IgG, HRP-linked</td>
			<td>CST</td>
			<td>7074</td>
			<td>1:5000 working concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-&#946;-Tubulin</td>
			<td>CST</td>
			<td>2146</td>
			<td>1:1000 working concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>VWR life sciences</td>
			<td>0332-100G</td>
			<td>50 mg/mL working concentration; lot #: 0536C008</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase, Type I</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17018029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D4902</td>
			<td>0.1 &#181;M working concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erythrocyte Lysis Buffer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>00-4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Corning</td>
			<td>R35-076-CV</td>
			<td>50 mg/mL working concentration; lot #: R2040212FBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14025092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HDMEM</td>
			<td>Gelifesciences</td>
			<td>SH30243.01</td>
			<td>Lot #: AD20813268</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IBMX</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I7018</td>
			<td>0.5 mM working concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I3536</td>
			<td>1 &#956;g/mL working concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsurgical forceps</td>
			<td>Suzhou Mingren Medical Equipment Co.,Ltd. (China)</td>
			<td>MR-F201A-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsurgical scissor</td>
			<td>Suzhou Mingren Medical Equipment Co.,Ltd. (China)</td>
			<td>MR-H121A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oil Red O solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>O1516</td>
			<td>0.3% working concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (Phosphate buffered saline)</td>
			<td>ABCONE (China)</td>
			<td>P41970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrimeScript RT reagent Kit</td>
			<td>TAKARA</td>
			<td>RR047A</td>
			<td>Lot #: AK4802</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy kit</td>
			<td>TAKARA</td>
			<td>9767</td>
			<td>Lot #: AHF1991D</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rosa26RFP/+ mice</td>
			<td>JAX</td>
			<td>No.007909</td>
			<td>C57BL/6 backgroud; male and female</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rosiglitazone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R2408</td>
			<td>1 &#956;M working concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard forceps</td>
			<td>Suzhou Mingren Medical Equipment Co.,Ltd. (China)</td>
			<td>MR-F424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical scissor</td>
			<td>Suzhou Mingren Medical Equipment Co.,Ltd. (China)</td>
			<td>MR-S231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Premix Ex Taq</td>
			<td>TAKARA</td>
			<td>RR420A</td>
			<td>Lot #: AK9003</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triiodothyronine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T2877</td>
			<td>10 nM working concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wnt1-Cre+;PPAR&#947;flox/flox mice</td>
			<td>JAX</td>
			<td>No.009107</td>
			<td>C57BL/6 backgroud; male and female</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation, culture, and adipogenic induction of neural crest original adipose-derived stem cells from periaortic adipose tissue

En overdreven mengde fettvev rundt blodårene (perivaskulærfettvev, også kjent som PVAT) er forbundet med høy risiko for kardiovaskulær sykdom. ADSCer avledet fra forskjellige fettvev viser forskjellige funksjoner, og de fra PVAT har ikke vært godt karakterisert. I en nylig studie rapporterte vi at noen ADSCer i periaortisk buefettvev (PAAT) stammer fra nevrale crestceller (NCCer), en forbigående populasjon av trekkceller som stammer fra ektodermen.
I dette papiret beskriver vi en protokoll for å isolere rødt fluorescerende protein (RFP)-merkede NCCer fra PAAT av Wnt-1 Cre+/-; Rosa26RFP/+ mus og indusere deres adipogenic differensiering in vitro. Kort sagt, stromal vaskulær fraksjon (SVF) er enzymatically dissosiert fra PAAT, og RFP+ neural crest avledede ADSCs (NCADSCs) er isolert av fluorescens aktivert celle sortering (FACS). NCADSCs differensiere til både brune og hvite adipocytter, kan kryokonservert, og beholde sitt adipogene potensial for ~ 3-5 passasjer. Vår protokoll kan generere rikelig ADSCer fra PVAT for modellering PVAT adipogenesis eller lipogenesis in vitro. Dermed kan disse NCADSCs gi et verdifullt system for å studere molekylære brytere som er involvert i PVAT-differensiering.

Ved hjelp av protokollen som er beskrevet ovenfor, fikk vi ~0,5–1,0 x 106 ANNONSEANNONSER fra 5–6 Wnt-1 Cre+/-; Rosa26RFP/+ mus (48 uker gammel, mann eller kvinne).
Flytskjemaet for samling av PAAT fra mus presenteres i figur 1. Morfologien til NCADSCs var lik ADSC fra andre mus fett vev. De kultiverte NCADSCs nådde 80–90% samflyt etter 7-8 dager med kultur, og NCADSCs hadde en utvidet fibroblast-lignende morfologi (<strong ...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation, Culture, and Adipogenic Induction of Neural Crest Original Adipose-Derived Stem Cells from Periaortic Adipose Tissue at JoVE.com

Isolation, Culture, and Adipogenic Induction of Neural Crest Original Adipose-Derived Stem Cells from Periaortic Adipose Tissue

Vi presenterer en protokoll for isolasjon, kultur og adipogen induksjon av neural crest avledet fettavledede stamceller (NCADSCs) fra periaortisk fettvev av Wnt-1 Cre+/-; Rosa26RFP/+ mus. NCADSCs kan være en lett tilgjengelig kilde til ADSCs for modellering av adipogenese eller lipogenesis in vitro.

Isolasjon, kultur og adipogen induksjon av Neural Crest Original Adipose-Avledet stamceller fra periaortisk fettvev

An excessive amount of adipose tissue surrounding the blood vessels (perivascular adipose tissue, also known as PVAT) is associated with a high risk of ...

Vår enkle og praktiske metodikk kan brukes til å oppnå rikelig ADSCS for å studere PVAT adipogenese in vitro og for å teste normale legemidler mot fedme og relaterte kardiovaskulære sykdommer. Fordelen med denne metoden er den iboende fluorescensen til NCADSCs av biotin du trenger for å merke cellene med flou-krom konjugert antistoffer for FACS, eller magnetisk aktivert cellesortering. Denne metoden kan brukes til å skaffe rikelig ADSC avledet fra neural crest celler fra ectoderm å studere PVAT adipogenese, eller lipogenese in vitro.Bruk av unge mus og har erfaring med cautery og indusert adipogenese betyr 3T3 celler er avgjørende for suksessen til denne protokollen. Å demonstrere prosedyren vil være Yiding Qi, en grad student, og Lian Xu, en tekniker fra laboratoriet mitt. For PAAT-disseksjon, etter sterilisering av musekadaveret i 75% etanol i fem minutter, bruk saks til å klippe og skille huden på magen.Klipp langs ventral midtlinjen fra bekkenet til nakken, og åpne magen. Flytt leveren for å eksponere membranen, og kutt membranen og ribbeina på begge sider av midtlinjen. Skrell ribbeina tilbake for å eksponere hjertet og lungene.Og fjern lungene og thymus. Trekk ut PAAT sammen med aorta og hjerte i en petriskål. Og kutt av aorta ved aortaroten for å fjerne hjertet.Deretter gjør et kutt mellom aortabuen og synkende aorta. Separer fettvevet forsiktig rundt begge strukturene, og venstre og høyre vanlige halspulsårerier fra den bakre brystveggen. Det er viktig å skille PAAT fra roten og som en større vaskulære kar nøye, er tilstedeværelsen av vaskulære veggceller kan påvirke FACS effektivitet.Legg vevet i en petriskål som inneholder iskald HBSS-buffer. Og bruk sterile tang for å fjerne så mye av vaskulaturen og fascia som mulig. Deretter overfører du fettvevet til et to milliliter Eppendorf-rør, som inneholder punkt fem milliliter iskald HBSS-buffer på is.Når hele PAAT er samlet, overføre høstet fettvev til en ny to milliliter mikro-sentrifuge rør som inneholder en milliliter nylaget fordøyelse medium. Og bruk kirurgisk saks for å hakke vevet. Overfør vevsslurmen til et 50 millimeter rør som inneholder ni milliliter frisk fordøyelsesmedium.Og bruk en en milliliter pipette for å triturere vevet 10 ganger. Når en homogen løsning er oppnådd, inkubere røret i 30 til 45 minutter ved 37 grader Celsius og 100 omdreininger per minutt, og kontroller hvert femte til 10 minutt for å forhindre overbesvær. Når en lys gul homogen fettvevsløsning kan observeres ved skånsom virvlende av røret, stopp fordøyelsen med fem milliliter HDMEM supplert med 10% fosterbovinserum.Etter en grundig blanding sentrifugerer fettvevsprøven. Den stromale vaskulære cellefraksjonen vil være synlig som en brunaktig pellet. Re-suspendere pellet i 10 milliliter kultur medium, og filtrere celle suspensjon gjennom en 70 mikrometer celle sil.Samle cellene ved en annen sentrifugering. Og forsiktig re-suspendere pellet i fem milliliter av erytrocytter lysis buffer. Overfør suspensjonen til et 15 milliliter rør.Etter 10 minutter, stopp reaksjonen med to sentrifugasjoner i 10 milliliter PBS, supplert med 1% fosterbovin serum. Etter den andre sentrifugeringen, re-suspendere pellet i fem milliliter kultur medium på is. Og samle cellene med en endelig sentrifugering.Deretter, re-suspendere cellene i fem milliliter facs buffer for telling. For å sette opp en NCADSC kultur, etter deres isolasjon av FACS i henhold til standardprotokoller, plasser cellene på en fem ganger 10 til de tredje cellene per centimeter kvadrert konsentrasjon i hver brønn, en tolv brønn kulturplate. Ufullstendig kulturmedium ved 37 grader Celsius og 5% karbondioksid i 20 til 24 timer.Neste dag, vask cellene med 37 grader Celsius PBS, og mate kulturen med frisk kultur medium. Når kulturen når 80 til 90% samløpet, behandle cellene med to milliliter på 0,25% trypsin EDTA per brønn i tre til fem minutter ved 37 grader Celsius. Når cellene har blitt løsrevet fra bunnen av platen, nøytralisere enzymene med to milliliter av kultivert medium, og samle de høstede cellene ved sentrifugering.Re-suspendere pellet i en milliliter av frisk kultur medium for telling. Og frø cellene i en ny 12 brønn kulturplate i en fem ganger 10 til de tredje cellene per centimeter kvadrert konsentrasjon. Deretter, re-suspendere de gjenværende cellene i kultur medium supplert med 10% dimetylsulfoksid for frossen lagring i flytende nitrogen.For å indusere adipogenic differensiering, når cellene når en 80 til 90% samløpet, behandle cellene med brun eller hvit adipogenic induksjon medium i to dager etter behov. På slutten av inkubasjonen, vask forsiktig cellene to ganger med PBS før du legger til riktig friskt adipogenic induksjonsmedium til hver brønn, og returnerer cellene til cellekulturinkubatoren i ytterligere tre til fem dager med inkubasjon. Kultiverte NCADSCer når en 80 til 90% samløpet etter syv til åtte dager med kultur.Og demonstrere en utvidet glassfiber som morfologi. For ytterligere å bekrefte sitt adipogenic potensial, oljerød farging av differensierte NCADSCs kan utføres for å oppdage modne adipocytter. Vanligvis observeres modne adipocytter etter åtte dager med hvit eller brun adipogenic induksjon med over 60% av NCADSCs som viser adipogenic differensiering.Vær oppmerksom på at NCADSCer viser et sterkt redusert adipogenic potensial etter passaging. Immunoblotting og kvantitativ sanntid PCR avslører at uttrykket av adipocytt spesifikke relative proteiner og gener øker betydelig i adipogenisk differensierte NCADSCer etter åtte dager med hvit adipogenic induksjon. På samme måte øker uttrykket av adipocyttspesifikke gener og brune adipocyttspesifikke gener, også betydelig etter åtte dager med brun adipogenic induksjon.Siden de fleste NCADSC-isolasjonsprotokoller er enkle, økonomiske og ikke krever bruk av antistoffer, kan den sterke væsken forårsaker intensiteten av IFP forbedre FACS næringseffektivitet.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Isolation and Enrichment of Human Adipose-derived Stromal Cells for Enhanced Osteogenesis

Isolasjon og berikelse av menneskelige Adipose-avledet stromalceller for Enhanced Osteogenesis

Bone marrow-derived mesenchymal stromal cells (BM-MSCs) are considered the gold standard for stem cell-based tissue engineering applications. However, the ...

Direct Induction of Human Neural Stem Cells from Peripheral Blood Hematopoietic Progenitor Cells

Direkte Induction of Human Neural stamceller fra perifert blod Hematopoietiske stamceller

Human disease specific neuronal cultures are essential for generating in vitro models for human neurological diseases. However, the lack of access to ...

Culturing Human Pluripotent and Neural Stem Cells in an Enclosed Cell Culture System for Basic and Preclinical Research

Dyrking Menneskelig Pluripotent og Neural stamceller i et lukket cellekultur System for Basic og Preklinisk Forskning

This paper describes how to use a custom manufactured, commercially available enclosed cell culture system for basic and preclinical research. Biosafety ...

Isolation and Differentiation of Adipose-Derived Stem Cells from Porcine Subcutaneous Adipose Tissues

Isolasjon og Differensiering av adipose-avledet stamceller fra svine Subkutan fettvev

Obesity is an unconstrained worldwide epidemic. Unraveling molecular controls in adipose tissue development holds promise to treat obesity or diabetes. ...

Immunomagnetic Separation of Fat Depot-specific Sca1high Adipose-derived Stem Cells (ASCs)

Immunomagnetic Separation of Fat Depot-specific Sca1high Adipose-derived Stem Cells ASCs

Immunomagnetisk Separasjon av Fat Depot spesifikke Sca1<sup&gt; høy</sup&gt; adipose-avledet stamceller (ASC)

The isolation of adipose-derived stem cells (ASCs) is an important method in the field of adipose tissue biology, adipogenesis, and extracellular matrix ...

Isolation and Expansion of Mesenchymal Stem/Stromal Cells Derived from Human Placenta Tissue

Isolasjon og utvidelse av Mesenchymale Stem / stromal celler avledet fra human placenta Tissue

Mesenchymal stem/stromal cells (MSC) are promising candidates for use in cell-based therapies. In most cases, therapeutic response appears to be cell-dose ...

Large-Scale Production of Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells Using a Highly Reproducible Small Molecule-Based Differentiation Protocol

Storskala produksjon av cardiomyocytes fra Menneskelig Pluripotent stamceller ved hjelp av en meget reproduserbar lite molekyl-Based Differensiering Protocol

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust ...

Chondrogenic Differentiation Induction of Adipose-derived Stem Cells by Centrifugal Gravity

Chondrogenic Differensiering Induksjon av adipose-avledet stamceller ved Sentrifugal Gravity

Impaired cartilage cannot heal naturally. Currently, the most advanced therapy for defects in cartilage is the transplantation of chondrocytes ...

Rapid Isolation of BMPR-IB+ Adipose-Derived Stromal Cells for Use in a Calvarial Defect Healing Model

Rapid Isolering av BMPR-IB + adipose-avledet stromale celler for bruk i en Calvarial Defect Healing Model

Invasive cancers, major injuries, and infection can cause bone defects that are too large to be reconstructed with preexisting bone from the patient's own ...

In Vivo Tracking of Human Adipose-derived Mesenchymal Stem Cells in a Rat Knee Osteoarthritis Model with Fluorescent Lipophilic Membrane Dye

In Vivo Tracking of Human Adipose-derived Mesenchymal Stem Cells in a Rat Knee Osteoarthritis Model with Fluorescent Lipophilic Membrane Dye

I Vivo Sporing av menneskelig liggende under Adipose-avledet Mesenchymal stamceller i en rotte kneet slitasjegikt modell med fluorescerende lipofile membran fargestoff

In order to support the clinical application of human adipose-derived mesenchymal stem cell (haMSC) therapy for knee osteoarthritis (KOA), we examined the ...