Name: isolation, culture, and adipogenic induction of neural crest original adipose-derived stem cells from periaortic adipose tissue
Uploaded: 2020-03-02T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation, Culture, and Adipogenic Induction of Neural Crest Original Adipose-Derived Stem Cells from Periaortic Adipose Tissue at JoVE.com

Programa Nacional de P&D da China (2018YFC1312504), Fundação Nacional de Ciência Natural da China (81970378, 81670360, 81870293) e Comissão de Ciência e Tecnologia do Município de Xangai (17411971000, 17140902402) forneceram os fundos para este estudo .

O protocolo animal foi revisto e aprovado pelo Comitê de Cuidados com Animais da Universidade de Xangai Jiao Tong.
1. Geração de Wnt-1 Cre+/-; Ratos Rosa26RFP/+
<ol><li>Cross Wnt-1 Cre+/- mouses16 com rosnado Rosa26RFP/+ 18 para gerar Wnt-1 Cre+/-; Rostou rosa26RFP/+. Ratos domésticos um ciclo claro/escuro de 12h em uma instalação livre de patógenos a 25 °C e 45% de umida...

<ol>
	<li>Afshin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Health+Effects+of+Overweight+and+Obesity+in+195+Countries+over+25+Years.">Health Effects of Overweight and Obesity in 195 Countries over 25 Years.</a> New England Journal of Medicine. 377 (1), 13-27 (2017).</li><li>Brown, N. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perivascular+adipose+tissue+in+vascular+function+and+disease:+a+review+of+current+research+and+animal+models.">Perivascular adipose tissue in vascular function and disease: a review of current research and animal models.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 34 (8), 1621-1630 (2014).</li><li>Britton, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevalence,+distribution,+and+risk+factor+correlates+of+high+thoracic+periaortic+fat+in+the+Framingham+Heart+Study.">Prevalence, distribution, and risk factor correlates of high thoracic periaortic fat in the Framingham Heart Study.</a> Journal of the American Heart Association. 1 (6), 004200 (2012).</li><li>Police, S. B., Thatcher, S. E., Charnigo, R., Daugherty, A., Cassis, L. 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L., Ruiz, L., Kajimura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+differentiation+of+stromal+vascular+cells+to+beige/brite+cells.">Isolation and differentiation of stromal vascular cells to beige/brite cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (73), e50191 (2013).</li><li>Ruan, H., Zarnowski, M. J., Cushman, S. W., Lodish, H. 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S., Birsoy, K., Friedman, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+white+adipocyte+progenitor+cells+in+vivo.">Identification of white adipocyte progenitor cells in vivo.</a> Cell. 135 (2), 240-249 (2008).</li><li>Church, C. D., Berry, R., Rodeheffer, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+study+of+adipocyte+precursors.">Isolation and study of adipocyte precursors.</a> Methods in Enzymology. 537, 31-46 (2014).</li><li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Differentiation+of+Adipose-Derived+Stem+Cells+from+Porcine+Subcutaneous+Adipose+Tissues.">Isolation and Differentiation of Adipose-Derived Stem Cells from Porcine Subcutaneous Adipose Tissues.</a> Journal of Visualized Experiments. (109), e53886 (2016).</li><li>Ye, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+and+functional+characteristics+of+the+thoracic+aorta+perivascular+adipocyte.">Developmental and functional characteristics of the thoracic aorta perivascular adipocyte.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 76 (4), 777-789 (2019).</li><li>Medeiros, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+evolution+of+the+neural+crest:+new+perspectives+from+lamprey+and+invertebrate+neural+crest-like+cells.">The evolution of the neural crest: new perspectives from lamprey and invertebrate neural crest-like cells.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews. Developmental Biology. 2 (1), 1-15 (2013).</li><li>Fu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+Crest+Cells+Differentiate+Into+Brown+Adipocytes+and+Contribute+to+Periaortic+Arch+Adipose+Tissue+Formation.">Neural Crest Cells Differentiate Into Brown Adipocytes and Contribute to Periaortic Arch Adipose Tissue Formation.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. , (2019).</li><li>Danielian, P. S., Muccino, D., Rowitch, D. H., Michael, S. K., McMahon, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modification+of+gene+activity+in+mouse+embryos+in+utero+by+a+tamoxifen-inducible+form+of+Cre+recombinase.">Modification of gene activity in mouse embryos in utero by a tamoxifen-inducible form of Cre recombinase.</a> Current Biology. 8 (24), 1323-1326 (1998).</li><li>Tamura, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+crest-derived+stem+cells+migrate+and+differentiate+into+cardiomyocytes+after+myocardial+infarction.">Neural crest-derived stem cells migrate and differentiate into cardiomyocytes after myocardial infarction.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 31 (3), 582-589 (2011).</li><li>Madisen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+robust+and+high-throughput+Cre+reporting+and+characterization+system+for+the+whole+mouse+brain.">A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain.</a> Nature Neuroscience. 13 (1), 133-140 (2010).</li><li>Tan, P., Pepin, &. #. 2. 0. 1. ;., Lavoie, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+Adipose+Tissue+Collection+and+Processing+for+RNA+Analysis.">Mouse Adipose Tissue Collection and Processing for RNA Analysis.</a> Journal of Visualized Experiments. (131), e57026 (2018).</li><li>Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+specific+cell+population+by+fluorescence+activated+cell+sorting+(FACS).">Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS).</a> Journal of Visualized Experiments. (41), e1546 (2010).</li><li>Gupta, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zfp423+expression+identifies+committed+preadipocytes+and+localizes+to+adipose+endothelial+and+perivascular+cells.">Zfp423 expression identifies committed preadipocytes and localizes to adipose endothelial and perivascular cells.</a> Cell Metabolism. 15 (2), 230-239 (2012).</li><li>Sowa, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose+stromal+cells+contain+phenotypically+distinct+adipogenic+progenitors+derived+from+neural+crest.">Adipose stromal cells contain phenotypically distinct adipogenic progenitors derived from neural crest.</a> PLoS One. 8 (12), 84206 (2013).</li><li>Billo, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+generation+of+adipocytes+by+the+neural+crest.">The generation of adipocytes by the neural crest.</a> Development. 134 (12), 2283-2292 (2007).</li><li>Thelen, K., Ayala-Lopez, N., Watts, S. W., Contreras, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+and+Adipogenesis+Induction+of+Adipocyte+Progenitors+from+Perivascular+Adipose+Tissue+Isolated+by+Magnetic+Activated+Cell+Sorting.">Expansion and Adipogenesis Induction of Adipocyte Progenitors from Perivascular Adipose Tissue Isolated by Magnetic Activated Cell Sorting.</a> Journal of Visualized Experiments. (124), e55818 (2017).</li></ol>

Neste estudo, apresentamos um método confiável para o isolamento, cultura e indução adipogênica de NCADSCs extraídos do PVAT do Wnt-1 Cre+/-; Rosa26RFP/+ camundongos transgênicos projetados para produzir RFP+ ADSCs. Relatórios anteriores mostram que não há diferença significativa na expressão de marcadores de células-tronco mesenquinais multipotentes gerais (MSCs) em NCADSCs e não NCADSCs22, e que os NCADSCs têm um forte potencial para diferenciar em...

A prevalência de obesidade está aumentando em todo o mundo, o que aumenta o risco de doenças crônicas relacionadas, incluindo doenças cardiovasculares e diabetes1. PvAT envolve vasos sanguíneos e é uma das principais fontes de fatores endócrinos e paracrinos envolvidos na função vasculatura. Estudos clínicos mostram que o alto teor de PVAT é um fator de risco independente de doenças cardiovasculares2,3, e sua função patológica depende do fenótipo das células-tronco derivadas de adiposos constituintes (ADSCs)4.
Embora linhas celulares ADSC como a murina 3T3-L1, 3T3-F442A e OP9 sejam modelos celulares úteis para estudar adipogênese ou lipogênese5,os mecanismos regulatórios para adipogênese diferem entre linhas celulares e células primárias. Os ADSCs na fração de célulavascular estrônita (SVF) isolaram-se diretamente dos tecidos adippose e induzidos a diferenciar em adipócitos provavelmente recapitulando na adipogênese vivo e lipogênese6. No entanto, a fragilidade, a flutuação e as variações de tamanho e imunofenótipos dos ADSCs tornam seu isolamento direto desafiador. Além disso, os diferentes procedimentos de isolamento também podem afetar significativamente a capacidade potencial fenótipo e adipogênica dessas células7,enfatizando assim a necessidade de um protocolo que mantenha a integridade do ADSC.
O tecido adiposo é tipicamente classificado como o tecido adiposo branco morfologicamente e funcionalmente distinto (WAT), ou o tecido adiposo marrom (BAT)8, que abriga ADSCs distintos9. Embora as ADSCs isoladas de WATs subcutâneos e subcutâneos foram caracterizadas em estudos anteriores9,10,11,12, menos se sabe em relação aos ADSCs da PVAT que é composto principalmente por BAT13.
Em um estudo recente, descobrimos que uma parte dos ADSCs residentes no tecido adiposo do arco periártico (PAAT) são derivados de células de crista neural (NCCs), uma população transitória de células progenitoras migratórias que se originam do ectoderm14,15. Os camundongos transgênicos Wnt1-Cre foram usados para rastrear o desenvolvimento de células de crista neural16,17. Cruzamos os mouses Wnt1-Cre+ com ratos Rosa26RFP/+ para gerar O Cre Wnt-1+/-; Os camundongos Rosa26RFP/+, nos quais as NCCs e seus descendentes são rotulados com proteína fluorescente vermelha (RFP) e são facilmente rastreados in vivo e in vitro15. Aqui, descrevemos um método para isolar adsCs derivados da crista neural (ADSCs derivados de NC, ou NCADSCs) do PAAT do mouse e induzir os NCADSCs a diferenciar em adipócitos brancos ou adipócitos marrons.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>4% PFA</td>
			<td>BBI life sciences</td>
			<td>E672002-0500</td>
			<td>Lot #: EC11FA0001</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>ABCONE (China)</td>
			<td>A47902</td>
			<td>1% working concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-cebp/&#945;</td>
			<td>ABclonal</td>
			<td>A0904</td>
			<td>1:1000 working concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse IgG, HRP-linked</td>
			<td>CST</td>
			<td>7076</td>
			<td>1:5000 working concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-perilipin</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>AB61682</td>
			<td>1 &#956;g/mL working concentration; lot #: GR66486-54</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-PPARy</td>
			<td>SANTA CRUZ</td>
			<td>sc-7273</td>
			<td>0.2 &#956;g/mL working concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-rabbit IgG, HRP-linked</td>
			<td>CST</td>
			<td>7074</td>
			<td>1:5000 working concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-&#946;-Tubulin</td>
			<td>CST</td>
			<td>2146</td>
			<td>1:1000 working concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>VWR life sciences</td>
			<td>0332-100G</td>
			<td>50 mg/mL working concentration; lot #: 0536C008</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase, Type I</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17018029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D4902</td>
			<td>0.1 &#181;M working concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erythrocyte Lysis Buffer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>00-4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Corning</td>
			<td>R35-076-CV</td>
			<td>50 mg/mL working concentration; lot #: R2040212FBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14025092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HDMEM</td>
			<td>Gelifesciences</td>
			<td>SH30243.01</td>
			<td>Lot #: AD20813268</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IBMX</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I7018</td>
			<td>0.5 mM working concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I3536</td>
			<td>1 &#956;g/mL working concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsurgical forceps</td>
			<td>Suzhou Mingren Medical Equipment Co.,Ltd. (China)</td>
			<td>MR-F201A-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsurgical scissor</td>
			<td>Suzhou Mingren Medical Equipment Co.,Ltd. (China)</td>
			<td>MR-H121A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oil Red O solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>O1516</td>
			<td>0.3% working concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (Phosphate buffered saline)</td>
			<td>ABCONE (China)</td>
			<td>P41970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrimeScript RT reagent Kit</td>
			<td>TAKARA</td>
			<td>RR047A</td>
			<td>Lot #: AK4802</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy kit</td>
			<td>TAKARA</td>
			<td>9767</td>
			<td>Lot #: AHF1991D</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rosa26RFP/+ mice</td>
			<td>JAX</td>
			<td>No.007909</td>
			<td>C57BL/6 backgroud; male and female</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rosiglitazone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R2408</td>
			<td>1 &#956;M working concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard forceps</td>
			<td>Suzhou Mingren Medical Equipment Co.,Ltd. (China)</td>
			<td>MR-F424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical scissor</td>
			<td>Suzhou Mingren Medical Equipment Co.,Ltd. (China)</td>
			<td>MR-S231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Premix Ex Taq</td>
			<td>TAKARA</td>
			<td>RR420A</td>
			<td>Lot #: AK9003</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triiodothyronine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T2877</td>
			<td>10 nM working concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wnt1-Cre+;PPAR&#947;flox/flox mice</td>
			<td>JAX</td>
			<td>No.009107</td>
			<td>C57BL/6 backgroud; male and female</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation, culture, and adipogenic induction of neural crest original adipose-derived stem cells from periaortic adipose tissue

Uma quantidade excessiva de tecido adiposo ao redor dos vasos sanguíneos (tecido adiposo perivascular, também conhecido como PVAT) está associada a um alto risco de doenças cardiovasculares. Os ADSCs derivados de diferentes tecidos adiposos apresentam características distintas, e os do PVAT não foram bem caracterizados. Em um estudo recente, relatamos que alguns ADSCs no tecido adiposo do arco periártico (PAAT) descendem das células da crista neural (NCCs), uma população passageira de células migratórias originárias do ectoderm.
Neste artigo, descrevemos um protocolo para isolar AS NCCs vermelhas fluorescentes (RFP) rotuladas pelo PAAT do Wnt-1 Cre+/-; Rosa26RFP/+ camundongos e indução de sua diferenciação adipogênica in vitro. Resumidamente, a fração vascular estromal (SVF) é enzimáticamente dissociada do PAAT, e os ADSCs derivados da crista neural RFP+ neural (NCADSCs) são isolados pela classificação celular ativada por fluorescência (FACS). Os NCADSCs se diferenciam tanto em adipócitos marrons quanto brancos, podem ser crioreservadoss e manter seu potencial adipogênico para ~3-5 passagens. Nosso protocolo pode gerar ADSCs abundantes a partir do PVAT para modelar adipogênese PVAT ou lipogênese in vitro. Assim, esses NCADSCs podem fornecer um sistema valioso para estudar os interruptores moleculares envolvidos na diferenciação de PVAT.

Usando o protocolo descrito acima, obtivemos ~0,5-1.0 x 106 ADSCs de 5-6 Wnt-1 Cre+/-; Rostou rosa26RFP/+ (48 semanas, homem ou mulher).
O fluxo grama de coleta de PAAT de camundongos é apresentado na Figura 1. A morfologia dos NCADSCs era semelhante ao ADSC de outros tecidos adiposos de camundongos. As NCADSCs cultivadas atingiram 80-90% de confluência após 7-8 dias de cultura, e os NCADSCs tiveram uma morfologia expandida seme...

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Isolation, Culture, and Adipogenic Induction of Neural Crest Original Adipose-Derived Stem Cells from Periaortic Adipose Tissue

Apresentamos um protocolo para o isolamento, cultura e indução adipogênica de células-tronco derivadas de adipose derivados da crista neural (NCADSCs) do tecido periártico adiposo de Wnt-1 Cre+/-; Rostou rosa26RFP/+. Os NCADSCs podem ser uma fonte de ADSCs facilmente acessível para modelar adipogênese ou lipogênese in vitro.

Isolamento, cultura e indução adipogênica de células-tronco originais de adipose da crista neural do tecido adipogênico periaorótico

An excessive amount of adipose tissue surrounding the blood vessels (perivascular adipose tissue, also known as PVAT) is associated with a high risk of ...

Nossa metodologia simples e prática pode ser usada para obter ADSCS abundante para estudar adipogênese PVAT in vitro e para testar drogas normais contra a obesidade e doenças cardiovasculares relacionadas. A vantagem deste método é a fluorescência inerente dos NCADSCs de biotina que você precisa para rotular as células com anticorpos conjugados flou-cromados para FACS, ou classificação celular ativada magnética. Este método pode ser usado para adquirir ADSC abundante derivado de células de crista neural do ectoderme para estudar adipogênese PVAT, ou lipogênese in vitro.Usar camundongos jovens e ter experiência com cauterrorismo e adipogênese induzida significa que as células 3T3 são fundamentais para o sucesso deste protocolo. Demonstrando o procedimento estarão Yiding Qi, um estudante de pós-graduação, e Lian Xu, um técnico do meu laboratório. Para dissecção PAAT, depois de esterilizar a carcaça do rato em 75% de etanol por cinco minutos, use uma tesoura para cortar e separar a pele no abdômen.Corte ao longo da linha média ventral da pelve até o pescoço, e abra o abdômen. Mova o fígado para expor o diafragma, e corte o diafragma e as costelas em ambos os lados da linha média. Descasque as costelas para expor o coração e os pulmões.E remova os pulmões e o timo. Extrair o PAAT junto com a aorta e o coração em uma placa de petri. E corte a aorta na raiz aórtica para remover o coração.Então, faça um corte entre o arco aórtico e a aorta descendente. Separe cuidadosamente o tecido adiposo ao redor de ambas as estruturas, e as artérias carótidas comuns e ortodidas da parede torácica posterior. É importante separar o PAAT da raiz e, como um vaso vascular maior com cuidado, é que a presença de células de parede vascular pode afetar a eficiência do FACS.Coloque o tecido em uma placa de petri contendo tampão HBSS gelado. E use fórceps estéreis para remover o máximo possível da vasculatura e fáscia. Em seguida, transfira o tecido adiposo para um tubo Eppendorf de dois mililitros, contendo cinco mililitros de tampão HBSS gelado no gelo.Quando todo o PAAT tiver sido coletado, transfira o tecido adiposo colhido para um novo tubo microcentrífugo de dois mililitros contendo um mililitro de meio de digestão recém-preparado. E use uma tesoura cirúrgica para picadinho dos tecidos. Transfira o chorume de tecido para um tubo de 50 milímetros contendo nove mililitros de meio de digestão fresco.E use uma pipeta de um mililitro para triturar os tecidos 10 vezes. Quando uma solução homogênea for obtida, incubar o tubo por 30 a 45 minutos a 37 graus Celsius e 100 revoluções por minuto, verificando a cada cinco a 10 minutos para evitar a superdigestão. Quando uma solução de tecido adiposo amarelo claro pode ser observada sobre o giro suave do tubo, pare a digestão com cinco mililitros de HDMEM suplementados com soro bovino 10%.Após uma mistura completa, centrifugar a amostra de tecido adiposo. A fração de célula vascular estromica será visível como uma pelota marrom. Suspenda a pelota em 10 mililitros de meio de cultura e filtre a suspensão celular através de um filtro de célula de 70 micrômetros.Colete as células por outra centrifugação. E suspenda suavemente a pelota em cinco mililitros de tampão de lise de eritrócitos. Transfira a suspensão para um tubo de 15 mililitros.Após 10 minutos, pare a reação com duas centrífugas em 10 mililitros de PBS, suplementados com soro bovino fetal de 1%. Após a segunda centrifugação, suspenda a pelota em cinco mililitros de cultura no gelo. E coletar as células com uma centrifugação final.Em seguida, suspenda novamente as células em cinco mililitros de tampão FACS para contagem. Para criar uma cultura NCADSC, após seu isolamento pela FACS de acordo com os protocolos padrão, coloque as células em cinco vezes 10 a 10 células por cento centímetros de concentração quadrada em cada poço, uma placa de doze poços de cultura. Cultura incompleta média a 37 graus Celsius e 5% dióxido de carbono por 20 a 24 horas.No dia seguinte, lave as células com 37 graus Celsius PBS, e alimente a cultura com meio de cultura fresca. Quando a cultura atingir 80 a 90% de confluência, trate as células com dois mililitros de 0,25% de trippsina EDTA por poço por poço por três a cinco minutos a 37 graus Celsius. Quando as células tiverem sido separadas da parte inferior da placa, neutralizar as enzimas com dois mililitros de meio culto, e coletar as células colhidas por centrifugação.Suspenda a pelota em um mililitro de meio de cultura fresca para contar. E semeou as células em uma nova placa de cultura de 12 poços em cinco vezes 10 a terceira células por centímetros de concentração quadrada. Em seguida, suspenda novamente as células remanescentes em meio de cultura suplementadas com sulfóxido de 10% de dimetil para armazenamento congelado em nitrogênio líquido.Para induzir a diferenciação adipogênica, quando as células atingem uma confluência de 80 a 90%, trate as células com meio de indução adipogênica marrom ou branca por dois dias, conforme apropriado. No final da incubação, lave suavemente as células duas vezes com PBS antes de adicionar o meio de indução adipogênica fresco apropriado para cada poço, e devolver as células à incubadora de cultura celular para mais três a cinco dias de incubação. Os NCADSCs cultivados atingem uma confluência de 80 a 90% após sete a oito dias de cultura.E demonstrar uma fibra de vidro expandida como morfologia. Para confirmar ainda mais seu potencial adipogênico, a coloração vermelha do óleo dos NCADSCs diferenciados pode ser realizada para detectar adipócitos maduros. Tipicamente, adipócitos maduros são observados após oito dias de indução adipogênica branca ou marrom com mais de 60% dos NCADSCs exibindo diferenciação adipogênica.Observe que os NCADSCs demonstram um potencial adipogênico muito reduzido após a passagem. Imunoblotting e PCR quantitativo em tempo real revelam que a expressão de proteínas e genes relativos específicos adipócitos aumenta significativamente em NCADSCs adipogenicamente diferenciados após oito dias de indução adipogênica branca. Da mesma forma, a expressão de genes específicos de adipócito, e genes específicos de adipócito marrom, também aumenta significativamente após oito dias de indução adipogênica marrom.Uma vez que a maioria do protocolo de isolamento NCADSC é simples, econômico e não requer o uso de anticorpos, para isso, a intensidade forte dos fluidos do IFP pode melhorar a eficiência alimentar facs.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Isolation and Enrichment of Human Adipose-derived Stromal Cells for Enhanced Osteogenesis

Isolamento e Enriquecimento da Human adiposo-derivadas células estromais para Osteogenesis Aprimorado

Bone marrow-derived mesenchymal stromal cells (BM-MSCs) are considered the gold standard for stem cell-based tissue engineering applications. However, the ...

Biologia do Desenvolvimento

Direct Induction of Human Neural Stem Cells from Peripheral Blood Hematopoietic Progenitor Cells

Indução direta de Neurais Human células-tronco de sangue periférico células progenitoras hematopoéticas

Human disease specific neuronal cultures are essential for generating in vitro models for human neurological diseases. However, the lack of access to ...

Culturing Human Pluripotent and Neural Stem Cells in an Enclosed Cell Culture System for Basic and Preclinical Research

Cultura pluripotentes humanas e células-tronco neurais em um sistema de cultura celular fechado de Pesquisa Básica e pré-clínica

This paper describes how to use a custom manufactured, commercially available enclosed cell culture system for basic and preclinical research. Biosafety ...

Isolation and Differentiation of Adipose-Derived Stem Cells from Porcine Subcutaneous Adipose Tissues

Isolamento e diferenciação de células tronco derivadas de tecido adiposo de Suínos Subcutânea tecidos adiposos

Obesity is an unconstrained worldwide epidemic. Unraveling molecular controls in adipose tissue development holds promise to treat obesity or diabetes. ...

Immunomagnetic Separation of Fat Depot-specific Sca1high Adipose-derived Stem Cells (ASCs)

Immunomagnetic Separation of Fat Depot-specific Sca1high Adipose-derived Stem Cells ASCs

A separação imunomagnética Sca1 de gordura Depot-específica<sup&gt; alta</sup&gt; células-tronco derivadas de tecido adiposo (ASC)

The isolation of adipose-derived stem cells (ASCs) is an important method in the field of adipose tissue biology, adipogenesis, and extracellular matrix ...

Isolation and Expansion of Mesenchymal Stem/Stromal Cells Derived from Human Placenta Tissue

Isolamento e expansão de CTM / células estromais derivadas de placenta humana Tissue

Mesenchymal stem/stromal cells (MSC) are promising candidates for use in cell-based therapies. In most cases, therapeutic response appears to be cell-dose ...

Large-Scale Production of Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells Using a Highly Reproducible Small Molecule-Based Differentiation Protocol

Produção em larga escala de cardiomiócitos a partir de células-tronco pluripotentes humanas utilizando um altamente reprodutível pequeno-Based Molecule Protocolo de Diferenciação

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust ...

Chondrogenic Differentiation Induction of Adipose-derived Stem Cells by Centrifugal Gravity

Condrogênica Diferenciação indução de células-tronco derivadas de tecido adiposo por gravidade centrífugas

Impaired cartilage cannot heal naturally. Currently, the most advanced therapy for defects in cartilage is the transplantation of chondrocytes ...

Rapid Isolation of BMPR-IB+ Adipose-Derived Stromal Cells for Use in a Calvarial Defect Healing Model

Isolamento rápido de BMPR-IB + adiposo-derivados de células estromais para uso em um Defeito Modelo Cura calota craniana

Invasive cancers, major injuries, and infection can cause bone defects that are too large to be reconstructed with preexisting bone from the patient's own ...

In Vivo Tracking of Human Adipose-derived Mesenchymal Stem Cells in a Rat Knee Osteoarthritis Model with Fluorescent Lipophilic Membrane Dye

In Vivo Tracking of Human Adipose-derived Mesenchymal Stem Cells in a Rat Knee Osteoarthritis Model with Fluorescent Lipophilic Membrane Dye

Na Vivo Rastreamento de adiposo-derivados mesenquimais células estaminais humanas em um modelo de osteoartrite do joelho de rato com corante fluorescente membrana lipofílico

In order to support the clinical application of human adipose-derived mesenchymal stem cell (haMSC) therapy for knee osteoarthritis (KOA), we examined the ...