Name: isolation, culture, and adipogenic induction of neural crest original adipose-derived stem cells from periaortic adipose tissue
Uploaded: 2020-03-02T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation, Culture, and Adipogenic Induction of Neural Crest Original Adipose-Derived Stem Cells from Periaortic Adipose Tissue at JoVE.com

Национальная программа исследований и разбивки по естественным исследованиям Китая (2018YFC1312504), Национальный фонд естественных наук Китая (81970378, 81670360, 81870293) и Научно-техническое управление муниципалитета Шанхая (17411971000, 17140902402) предоставили средства для этого исследования .

Протокол о животных был рассмотрен и одобрен Комитетом по уходу за животными Шанхайского университета Цзяо Тонг.
1. Поколение Wnt-1Cre Rosa26RFP/' Мыши
<ol><li>Крест Wnt-1 CreNo /- мышей16 с Rosa26RFP / мышей 18 для создания Wnt-1Cre Мышей Rosa26R...

<ol>
	<li>Afshin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Health+Effects+of+Overweight+and+Obesity+in+195+Countries+over+25+Years.">Health Effects of Overweight and Obesity in 195 Countries over 25 Years.</a> New England Journal of Medicine. 377 (1), 13-27 (2017).</li><li>Brown, N. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perivascular+adipose+tissue+in+vascular+function+and+disease:+a+review+of+current+research+and+animal+models.">Perivascular adipose tissue in vascular function and disease: a review of current research and animal models.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 34 (8), 1621-1630 (2014).</li><li>Britton, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevalence,+distribution,+and+risk+factor+correlates+of+high+thoracic+periaortic+fat+in+the+Framingham+Heart+Study.">Prevalence, distribution, and risk factor correlates of high thoracic periaortic fat in the Framingham Heart Study.</a> Journal of the American Heart Association. 1 (6), 004200 (2012).</li><li>Police, S. B., Thatcher, S. E., Charnigo, R., Daugherty, A., Cassis, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obesity+promotes+inflammation+in+periaortic+adipose+tissue+and+angiotensin+II-induced+abdominal+aortic+aneurysm+formation.">Obesity promotes inflammation in periaortic adipose tissue and angiotensin II-induced abdominal aortic aneurysm formation.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 29 (10), 1458-1464 (2009).</li><li>Farmer, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+control+of+adipocyte+formation.">Transcriptional control of adipocyte formation.</a> Cell Metabolism. 4 (4), 263-273 (2006).</li><li>Aune, U. L., Ruiz, L., Kajimura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+differentiation+of+stromal+vascular+cells+to+beige/brite+cells.">Isolation and differentiation of stromal vascular cells to beige/brite cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (73), e50191 (2013).</li><li>Ruan, H., Zarnowski, M. J., Cushman, S. W., Lodish, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standard+isolation+of+primary+adipose+cells+from+mouse+epididymal+fat+pads+induces+inflammatory+mediators+and+down-regulates+adipocyte+genes.">Standard isolation of primary adipose cells from mouse epididymal fat pads induces inflammatory mediators and down-regulates adipocyte genes.</a> Journal of Biological Chemistry. 278 (48), 47585-47593 (2003).</li><li>Cinti, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Between+brown+and+white:+novel+aspects+of+adipocyte+differentiation.">Between brown and white: novel aspects of adipocyte differentiation.</a> Annals of Medicine. 43 (2), 104-115 (2011).</li><li>Van Harmelen, V., Rohrig, K., Hauner, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+proliferation+and+differentiation+capacity+of+human+adipocyte+precursor+cells+from+the+omental+and+subcutaneous+adipose+tissue+depot+of+obese+subjects.">Comparison of proliferation and differentiation capacity of human adipocyte precursor cells from the omental and subcutaneous adipose tissue depot of obese subjects.</a> Metabolism. 53 (5), 632-637 (2004).</li><li>Rodeheffer, M. S., Birsoy, K., Friedman, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+white+adipocyte+progenitor+cells+in+vivo.">Identification of white adipocyte progenitor cells in vivo.</a> Cell. 135 (2), 240-249 (2008).</li><li>Church, C. D., Berry, R., Rodeheffer, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+study+of+adipocyte+precursors.">Isolation and study of adipocyte precursors.</a> Methods in Enzymology. 537, 31-46 (2014).</li><li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Differentiation+of+Adipose-Derived+Stem+Cells+from+Porcine+Subcutaneous+Adipose+Tissues.">Isolation and Differentiation of Adipose-Derived Stem Cells from Porcine Subcutaneous Adipose Tissues.</a> Journal of Visualized Experiments. (109), e53886 (2016).</li><li>Ye, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+and+functional+characteristics+of+the+thoracic+aorta+perivascular+adipocyte.">Developmental and functional characteristics of the thoracic aorta perivascular adipocyte.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 76 (4), 777-789 (2019).</li><li>Medeiros, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+evolution+of+the+neural+crest:+new+perspectives+from+lamprey+and+invertebrate+neural+crest-like+cells.">The evolution of the neural crest: new perspectives from lamprey and invertebrate neural crest-like cells.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews. Developmental Biology. 2 (1), 1-15 (2013).</li><li>Fu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+Crest+Cells+Differentiate+Into+Brown+Adipocytes+and+Contribute+to+Periaortic+Arch+Adipose+Tissue+Formation.">Neural Crest Cells Differentiate Into Brown Adipocytes and Contribute to Periaortic Arch Adipose Tissue Formation.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. , (2019).</li><li>Danielian, P. S., Muccino, D., Rowitch, D. H., Michael, S. K., McMahon, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modification+of+gene+activity+in+mouse+embryos+in+utero+by+a+tamoxifen-inducible+form+of+Cre+recombinase.">Modification of gene activity in mouse embryos in utero by a tamoxifen-inducible form of Cre recombinase.</a> Current Biology. 8 (24), 1323-1326 (1998).</li><li>Tamura, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+crest-derived+stem+cells+migrate+and+differentiate+into+cardiomyocytes+after+myocardial+infarction.">Neural crest-derived stem cells migrate and differentiate into cardiomyocytes after myocardial infarction.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 31 (3), 582-589 (2011).</li><li>Madisen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+robust+and+high-throughput+Cre+reporting+and+characterization+system+for+the+whole+mouse+brain.">A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain.</a> Nature Neuroscience. 13 (1), 133-140 (2010).</li><li>Tan, P., Pepin, &. #. 2. 0. 1. ;., Lavoie, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+Adipose+Tissue+Collection+and+Processing+for+RNA+Analysis.">Mouse Adipose Tissue Collection and Processing for RNA Analysis.</a> Journal of Visualized Experiments. (131), e57026 (2018).</li><li>Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+specific+cell+population+by+fluorescence+activated+cell+sorting+(FACS).">Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS).</a> Journal of Visualized Experiments. (41), e1546 (2010).</li><li>Gupta, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zfp423+expression+identifies+committed+preadipocytes+and+localizes+to+adipose+endothelial+and+perivascular+cells.">Zfp423 expression identifies committed preadipocytes and localizes to adipose endothelial and perivascular cells.</a> Cell Metabolism. 15 (2), 230-239 (2012).</li><li>Sowa, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose+stromal+cells+contain+phenotypically+distinct+adipogenic+progenitors+derived+from+neural+crest.">Adipose stromal cells contain phenotypically distinct adipogenic progenitors derived from neural crest.</a> PLoS One. 8 (12), 84206 (2013).</li><li>Billo, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+generation+of+adipocytes+by+the+neural+crest.">The generation of adipocytes by the neural crest.</a> Development. 134 (12), 2283-2292 (2007).</li><li>Thelen, K., Ayala-Lopez, N., Watts, S. W., Contreras, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+and+Adipogenesis+Induction+of+Adipocyte+Progenitors+from+Perivascular+Adipose+Tissue+Isolated+by+Magnetic+Activated+Cell+Sorting.">Expansion and Adipogenesis Induction of Adipocyte Progenitors from Perivascular Adipose Tissue Isolated by Magnetic Activated Cell Sorting.</a> Journal of Visualized Experiments. (124), e55818 (2017).</li></ol>

В этом исследовании мы представляем надежный метод изоляции, культуры и адипогенной индукции NCADSCs, извлеченных из PVAT Wnt-1Cre Трансгенные мыши Rosa26RFP/', предназначенные для производства РППи ADSC. Предыдущие доклады показывают, что нет существенной разницы в выражении общих ?...

Распространенность ожирения растет во всем мире, что увеличивает риск связанных с ними хронических заболеваний, включая сердечно-сосудистые заболевания и диабет1. PVAT окружает кровеносные сосуды и является основным источником эндокринных и паракринных факторов, участвующих в функции сосудов. Клинические исследования показывают, что высокое содержание PVAT является независимым фактором риска сердечно-сосудистых заболеваний2,3, и его патологическая функция зависит от фенотипа составных жирового стволовых клеток (ADSCs)4.
Хотя линии клеток ADSC, такие как murine 3T3-L1, 3T3-F442A и OP9, являются полезными клеточными моделями для изучения адипогенеза или липогенеза5, регулирующие механизмы адипогенеза различаются между клеточными линиями и первичными клетками. ADSCs в стромальной сосудистой клетки фракции (SVF) изолированы непосредственно из жировой ткани и индуцированных дифференцировать в адипоциты, скорее всего, резюмировать in vivo адипогенез и липогенез6. Тем не менее, хрупкость, плавучесть, и различия в размерах и иммунофенотипов ADSCs сделать их прямой изоляции сложной задачей. Кроме того, различные процедуры изоляции может также существенно повлиять на фенотип и адипогенной потенциальной способности этих клеток7, таким образом подчеркивая необходимость протокола, который поддерживает целостность ADSC.
Жировая ткань, как правило, классифицируется как либо морфологически и функционально различные белые жировой ткани (WAT), или коричневой жировой ткани (BAT)8, который гавани различных ADSCs9. В то время как ADSCs изолированы от perigonadal и паховой подкожной WATs были охарактеризованы в предыдущих исследованиях9,10,11,12, меньше известно в отношении ADSCs от PVAT, который в основном состоит из BAT13.
В недавнем исследовании, мы обнаружили, что часть резидентов ADSCs в периаортной арки жировой ткани (PAAT) являются производными от нервных клеток гребня (NCCs), переходной популяции мигрирующих клеток-прародителей, которые происходят из эктодерма14,15. Wnt1-Cre трансгенных мышей были использованы для отслеживания развития нервных гребня клеток16,17. Мы пересекли Wnt1-Creмышей с Rosa26RFP / мышей для создания Wnt-1 Cre/-; Мышей Rosa26RFP/, в которых НКК и их потомки помечены красным флуоресцентным белком (RFP) и легко отслеживаются в vivo и in vitro15. Здесь мы описываем метод изоляции нервного гребня производных ADSCs (NC-производных ADSCs, или NCADSCs) от мыши PAAT и побудить NCADSCs дифференцировать в белые адипоциты или коричневые адипоциты.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>4% PFA</td>
			<td>BBI life sciences</td>
			<td>E672002-0500</td>
			<td>Lot #: EC11FA0001</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>ABCONE (China)</td>
			<td>A47902</td>
			<td>1% working concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-cebp/&#945;</td>
			<td>ABclonal</td>
			<td>A0904</td>
			<td>1:1000 working concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse IgG, HRP-linked</td>
			<td>CST</td>
			<td>7076</td>
			<td>1:5000 working concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-perilipin</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>AB61682</td>
			<td>1 &#956;g/mL working concentration; lot #: GR66486-54</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-PPARy</td>
			<td>SANTA CRUZ</td>
			<td>sc-7273</td>
			<td>0.2 &#956;g/mL working concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-rabbit IgG, HRP-linked</td>
			<td>CST</td>
			<td>7074</td>
			<td>1:5000 working concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-&#946;-Tubulin</td>
			<td>CST</td>
			<td>2146</td>
			<td>1:1000 working concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>VWR life sciences</td>
			<td>0332-100G</td>
			<td>50 mg/mL working concentration; lot #: 0536C008</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase, Type I</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17018029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D4902</td>
			<td>0.1 &#181;M working concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erythrocyte Lysis Buffer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>00-4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Corning</td>
			<td>R35-076-CV</td>
			<td>50 mg/mL working concentration; lot #: R2040212FBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14025092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HDMEM</td>
			<td>Gelifesciences</td>
			<td>SH30243.01</td>
			<td>Lot #: AD20813268</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IBMX</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I7018</td>
			<td>0.5 mM working concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I3536</td>
			<td>1 &#956;g/mL working concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsurgical forceps</td>
			<td>Suzhou Mingren Medical Equipment Co.,Ltd. (China)</td>
			<td>MR-F201A-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsurgical scissor</td>
			<td>Suzhou Mingren Medical Equipment Co.,Ltd. (China)</td>
			<td>MR-H121A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oil Red O solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>O1516</td>
			<td>0.3% working concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (Phosphate buffered saline)</td>
			<td>ABCONE (China)</td>
			<td>P41970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrimeScript RT reagent Kit</td>
			<td>TAKARA</td>
			<td>RR047A</td>
			<td>Lot #: AK4802</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy kit</td>
			<td>TAKARA</td>
			<td>9767</td>
			<td>Lot #: AHF1991D</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rosa26RFP/+ mice</td>
			<td>JAX</td>
			<td>No.007909</td>
			<td>C57BL/6 backgroud; male and female</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rosiglitazone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R2408</td>
			<td>1 &#956;M working concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard forceps</td>
			<td>Suzhou Mingren Medical Equipment Co.,Ltd. (China)</td>
			<td>MR-F424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical scissor</td>
			<td>Suzhou Mingren Medical Equipment Co.,Ltd. (China)</td>
			<td>MR-S231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Premix Ex Taq</td>
			<td>TAKARA</td>
			<td>RR420A</td>
			<td>Lot #: AK9003</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triiodothyronine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T2877</td>
			<td>10 nM working concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wnt1-Cre+;PPAR&#947;flox/flox mice</td>
			<td>JAX</td>
			<td>No.009107</td>
			<td>C57BL/6 backgroud; male and female</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation, culture, and adipogenic induction of neural crest original adipose-derived stem cells from periaortic adipose tissue

Чрезмерное количество жировой ткани, окружающих кровеносные сосуды (периваскулярная жировая ткань, также известная как PVAT) связано с высоким риском сердечно-сосудистых заболеваний. ADSCs, полученные из различных жировые ткани показывают различные особенности, и те из PVAT не были хорошо охарактеризованы. В недавнем исследовании, мы сообщили, что некоторые ADSCs в периаортной арки жировой ткани (PAAT) спуститься из нервных клеток гребня (NCCs), переходной популяции мигрирующих клеток, происходящих из эктодерма.
В этой работе мы описываем протокол для изоляции красного флуоресцентного белка (RFP) с маркировкой NCCs от PAAT Wnt-1Cre Мышей Rosa26RFP/' и индуцирование их адипогенной дифференциации in vitro. Вкратце, стромальная сосудистая фракция (SVF) ферментативно отделена от PAAT, а RFPи нервный гребень, полученный ADSCs (NCADSCs), изолированы флуоресценцией активированной сортировки клеток (FACS). NCADSCs дифференцировать в коричневые и белые адипоциты, могут быть криоконсервированы, и сохранить их адипогенный потенциал для 3-5 проходов. Наш протокол может генерировать обильные ADSCs из PVAT для моделирования PVAT адипогенез или липогенез в пробирке. Таким образом, эти NCADSCs могут обеспечить ценную систему для изучения молекулярных переключателей, участвующих в дифференциации PVAT.

Используя описанный выше протокол, мы получили 0,5-1,0 х 106 ADSCs от 5-6 Wnt-1 Cre/-; Мышей Rosa26RFP/) (48 недель, мужчины или женщины).
Диаграмма потока сбора PAAT от мышей представлена на рисунке 1. Морфология NCADSCs была похожа на ADSC от других мышей жировой ткан...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation, Culture, and Adipogenic Induction of Neural Crest Original Adipose-Derived Stem Cells from Periaortic Adipose Tissue at JoVE.com

Isolation, Culture, and Adipogenic Induction of Neural Crest Original Adipose-Derived Stem Cells from Periaortic Adipose Tissue

Мы представляем протокол для изоляции, культуры и адипогенной индукции нервного гребня полученных жировые стволовые клетки (NCADSCs) из периаортной жировой ткани Wnt-1 Cre/-; Мышей Rosa26RFP/'. NCADSCs может быть легко доступным источником ADSCs для моделирования адипогенеза или липогенеза в пробирке.

Изоляция, Культура и адипогенная индукция нейронных Креста Оригинальные жировые стволовые клетки из периаортных жировой ткани

An excessive amount of adipose tissue surrounding the blood vessels (perivascular adipose tissue, also known as PVAT) is associated with a high risk of ...

Наша простая и практичная методология может быть использована для получения обильных ADSCS для изучения PVAT adipogenesis in vitro и для тестирования нормальных препаратов против ожирения и связанных с ним сердечно-сосудистых заболеваний. Преимуществом этого метода является присущая флуоресценции NCADSCs биотина вам нужно пометить клетки с flou-хромом конъюгированных антител для FACS, или магнитной активированной сортировки клеток. Этот метод может быть использован для приобретения обильных ADSC, полученных из нейронных клеток гребня из эктодерма для изучения PVAT адипогенез, или липогенез в пробирке.Использование молодых мышей и наличие опыта работы с прижиганием и индуцированным адипогенезом означает, что клетки 3T3 имеют решающее значение для успеха этого протокола. Демонстрация процедуры будет Yiding Ци, аспирант, и Лиан Сюй, техник из моей лаборатории. Для вскрытия PAAT, после стерилизации туши мыши в 75% этанола в течение пяти минут, используйте ножницы, чтобы отрезать и отделить кожу на животе.Вырезать вдоль брюшной средней линии от таза до шеи, и открыть живот. Перемести печень, чтобы разоблачить диафрагму, и вырезать диафрагму и ребра по обе стороны от средней линии. Очистите ребра, чтобы разоблачить сердце и легкие.И удалить легкие и тимус. Извлекайте PAAT вместе с аортой и сердцем в чашку Петри. И отрезать аорту у корня аорты, чтобы удалить сердце.Затем сделайте разрез между аркой аорты и нисходящей аортой. Тщательно отделить жировой ткани, окружающие обе структуры, и левой и правой общих сонных артерий от задней стенки грудной клетки. Важно отделить PAAT от корня и, как большие сосудистые сосуды тщательно, является наличие сосудистых клеток стенки может повлиять на эффективность FACS.Поместите ткань в чашку Петри, содержащую ледяной буфер HBSS. И использовать стерильные типсы, чтобы удалить как можно больше сосудов и фасции, как это возможно. Затем перенесите жировую ткань в двухми миллилитровую трубку Эппендорфа, содержащую пять миллилитров ледяного буфера HBSS на льду.Когда все PAAT были собраны, передать собранные жировой ткани в новый два миллилитров микро-центрифуги трубки, содержащей один миллилитр свежеприготовленной среды пищеварения. И использовать хирургические ножницы, чтобы фарш тканей. Перенесите навоз ткани в 50-миллиметровую трубку, содержащую девять миллилитров свежей среды пищеварения.И использовать один миллилитр пипетки тритурировать ткани 10 раз. Когда однородный раствор был получен, инкубировать трубку в течение 30 до 45 минут при 37 градусов по Цельсию и 100 оборотов в минуту, проверяя каждые пять-десять минут, чтобы предотвратить переварение желудка. Когда светло-желтый однородный раствор жировой ткани можно наблюдать при нежном закручении трубки, остановите пищеварение с пятью миллилитров HDMEM, дополненными 10%фетальной сывороткой крупного рогатого скота.После тщательного смешивания центрифуга образца жировой ткани. Стромальная сосудистая клеточная фракция будет видна как коричневатые гранулы. Повторно приостанавливайте гранулы в 10 миллилитров среды культуры и фильтруйте подвеску клетки через 70-метровый клеточный ситечко.Соберите клетки другой центрифугации. И осторожно повторно приостановить гранулы в пять миллилитров эритроцитов лиза буфера. Перенесите подвеску на 15-миллилитровую трубку.Через 10 минут прекратите реакцию двумя центрифугами в 10 миллилитров PBS, дополненных сывороткой из крупного рогатого скота 1%. После второй центрифугации, повторно приостановить гранулы в пять миллилитров культуры среды на льду. И собирать клетки с окончательной центрифугации.Затем повторно приостанавливают ячейки в пяти миллилитров буфера FACS для подсчета. Чтобы создать культуру NCADSC, после их изоляции FACS в соответствии со стандартными протоколами, поместите клетки в пять раз от 10 до третьих клеток на сантиметр в квадрате концентрации в каждой хорошо, двенадцать хорошо культуры пластины. Неполная среда культуры при 37 градусах По Цельсию и 5%углекислый газ в течение 20-24 часов.На следующий день, мыть клетки с 37 градусов по Цельсию PBS, и кормить культуру со свежей среде культуры. Когда культура достигает 80 до 90% слияния, лечить клетки с двумя миллилитров 0,25%трипсина ЭДТА на колодец в течение трех-пяти минут при 37 градусов по Цельсию. Когда клетки были отделены от нижней части пластины, нейтрализовать ферменты с двумя миллилитров культурной среды, и собирать собранные клетки центрифугации.Повторно приостанавливайте гранулы в один миллилитр свежей культуры среды для подсчета. И семян клеток в новой 12 хорошо культуры пластины в пять раз от 10 до третьих клеток на сантиметры в квадрате концентрации. Затем повторно приостанавливать оставшиеся клетки в среде культуры, дополненные 10%диметилсульфоксидом для замороженного хранения в жидком азоте.Чтобы вызвать адипогенную дифференциацию, когда клетки достигают 80 до 90% слияния, лечить клетки с коричневой или белой адипогенной индукционной среды в течение двух дней по мере необходимости. В конце инкубации, аккуратно мыть клетки два раза с PBS, прежде чем добавить соответствующие свежие адипогенные индукции среды для каждого хорошо, и возвращение клеток в инкубатор культуры клеток в течение дополнительных трех-пяти дней инкубации. Культурные NCADSCs достичь 80 до 90% слияния после семи-восьми дней культуры.И продемонстрировать расширенный стекловолокна, как морфология. Для дальнейшего подтверждения их адипогенного потенциала, масляное красное окрашивание дифференцированных NCADSCs может быть выполнено для обнаружения зрелых адипоцитов. Как правило, зрелые адипоциты наблюдаются после восьми дней белой или коричневой адипогенной индукции с более чем 60% NCADSCs выставке адипогенной дифференциации.Обратите внимание, что NCADSCs демонстрируют значительно сниженный адипогенный потенциал после прохода. Иммуноблоттинг и количественные ПЦР в реальном времени показывают, что экспрессия адипоцитов специфических относительных белков и генов значительно увеличивается в адипогенически дифференцированных NCADSCs после восьми дней белой адипогенной индукции. Аналогичным образом, экспрессия адипоцитов конкретных генов, и коричневый адипоцитов конкретных генов, также значительно увеличивается после восьми дней коричневой адипогенной индукции.Поскольку большинство протоколов изоляции NCADSC прост, экономичен и не требует использования антител, для этого, сильная интенсивность жидкости причин IFP может улучшить эффективность питания FACS.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Isolation and Enrichment of Human Adipose-derived Stromal Cells for Enhanced Osteogenesis

Выделение и Обогащение жировой ткани стромальных клеток для расширенной остеогенеза

Bone marrow-derived mesenchymal stromal cells (BM-MSCs) are considered the gold standard for stem cell-based tissue engineering applications. However, the ...

Direct Induction of Human Neural Stem Cells from Peripheral Blood Hematopoietic Progenitor Cells

Прямая индукция человеческих нервных стволовых клеток из периферической крови гемопоэтических клеток-предшественников

Human disease specific neuronal cultures are essential for generating in vitro models for human neurological diseases. However, the lack of access to ...

Culturing Human Pluripotent and Neural Stem Cells in an Enclosed Cell Culture System for Basic and Preclinical Research

Культивирование Человеческий плюрипотентных и нервные стволовые клетки в замкнутой системе клеточной культуре фундаментальных и доклинических исследований

This paper describes how to use a custom manufactured, commercially available enclosed cell culture system for basic and preclinical research. Biosafety ...

Isolation and Differentiation of Adipose-Derived Stem Cells from Porcine Subcutaneous Adipose Tissues

Выделение и дифференциация полученных из жировой ткани стволовые клетки из свиных подкожного жирового ТКАНЕЙ

Obesity is an unconstrained worldwide epidemic. Unraveling molecular controls in adipose tissue development holds promise to treat obesity or diabetes. ...

Immunomagnetic Separation of Fat Depot-specific Sca1high Adipose-derived Stem Cells (ASCs)

Immunomagnetic Separation of Fat Depot-specific Sca1high Adipose-derived Stem Cells ASCs

Иммуномагнитного Разделение жировое депо-специфической СЦА1<sup&gt; высокая</sup&gt; Полученные из жировой ткани стволовые клетки (ИСС)

The isolation of adipose-derived stem cells (ASCs) is an important method in the field of adipose tissue biology, adipogenesis, and extracellular matrix ...

Isolation and Expansion of Mesenchymal Stem/Stromal Cells Derived from Human Placenta Tissue

Выделение и расширения мезенхимальных стволовых / стромальные клетки, полученные из плаценты человека ткани

Mesenchymal stem/stromal cells (MSC) are promising candidates for use in cell-based therapies. In most cases, therapeutic response appears to be cell-dose ...

Large-Scale Production of Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells Using a Highly Reproducible Small Molecule-Based Differentiation Protocol

Крупномасштабное производство кардиомиоцитов из человеческих плюрипотентных стволовых клеток с использованием высокой воспроизводимостью Малый протокол Дифференциация Molecule на основе

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust ...

Chondrogenic Differentiation Induction of Adipose-derived Stem Cells by Centrifugal Gravity

Хондрогенный Дифференциация Индукционная полученных из жировой ткани стволовых клеток под действием центробежной силы тяжести

Impaired cartilage cannot heal naturally. Currently, the most advanced therapy for defects in cartilage is the transplantation of chondrocytes ...

Rapid Isolation of BMPR-IB+ Adipose-Derived Stromal Cells for Use in a Calvarial Defect Healing Model

Быстрое Выделение BMPR-IB + жировая стромальных клеток, полученных для использования в костный дефект модели заживления

Invasive cancers, major injuries, and infection can cause bone defects that are too large to be reconstructed with preexisting bone from the patient's own ...

In Vivo Tracking of Human Adipose-derived Mesenchymal Stem Cells in a Rat Knee Osteoarthritis Model with Fluorescent Lipophilic Membrane Dye

In Vivo Tracking of Human Adipose-derived Mesenchymal Stem Cells in a Rat Knee Osteoarthritis Model with Fluorescent Lipophilic Membrane Dye

В естественных условиях Отслеживание человека жировой производные мезенхимальных стволовых клеток в мышиной модели артроз колена с красителем липофильных флуоресцентных мембраны

In order to support the clinical application of human adipose-derived mesenchymal stem cell (haMSC) therapy for knee osteoarthritis (KOA), we examined the ...