Name: isolation, culture, and adipogenic induction of neural crest original adipose-derived stem cells from periaortic adipose tissue
Uploaded: 2020-03-02T12:30:00
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National Key R&D Program of China (2018YFC1312504), National Natural Science Foundation of China (81970378, 81670360, 81870293), y la Comisión de Ciencia y Tecnología del Municipio de Shanghái (17411971000, 17140902402) proporcionó los fondos para este estudio .

El protocolo animal ha sido revisado y aprobado por el Comité de Cuidado de Animales de la Universidad Jiao Tong de Shanghái.
1. Generación de Wnt-1 Cre+/-; Rosa26RFP/+ Ratones
<ol><li>Cross Wnt-1 Cre+/- ratones16 con ratones Rosa26RFP/+ 18 para generar Wnt-1 Cre+/-; Ratones Rosa26RFP/+. Los ratones domésticos bajo un ciclo de luz/oscuridad de 12 h en una instalación libre d...

<ol>
	<li>Afshin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Health+Effects+of+Overweight+and+Obesity+in+195+Countries+over+25+Years.">Health Effects of Overweight and Obesity in 195 Countries over 25 Years.</a> New England Journal of Medicine. 377 (1), 13-27 (2017).</li><li>Brown, N. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perivascular+adipose+tissue+in+vascular+function+and+disease:+a+review+of+current+research+and+animal+models.">Perivascular adipose tissue in vascular function and disease: a review of current research and animal models.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 34 (8), 1621-1630 (2014).</li><li>Britton, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevalence,+distribution,+and+risk+factor+correlates+of+high+thoracic+periaortic+fat+in+the+Framingham+Heart+Study.">Prevalence, distribution, and risk factor correlates of high thoracic periaortic fat in the Framingham Heart Study.</a> Journal of the American Heart Association. 1 (6), 004200 (2012).</li><li>Police, S. B., Thatcher, S. E., Charnigo, R., Daugherty, A., Cassis, L. 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L., Ruiz, L., Kajimura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+differentiation+of+stromal+vascular+cells+to+beige/brite+cells.">Isolation and differentiation of stromal vascular cells to beige/brite cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (73), e50191 (2013).</li><li>Ruan, H., Zarnowski, M. J., Cushman, S. W., Lodish, H. 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S., Birsoy, K., Friedman, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+white+adipocyte+progenitor+cells+in+vivo.">Identification of white adipocyte progenitor cells in vivo.</a> Cell. 135 (2), 240-249 (2008).</li><li>Church, C. D., Berry, R., Rodeheffer, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+study+of+adipocyte+precursors.">Isolation and study of adipocyte precursors.</a> Methods in Enzymology. 537, 31-46 (2014).</li><li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Differentiation+of+Adipose-Derived+Stem+Cells+from+Porcine+Subcutaneous+Adipose+Tissues.">Isolation and Differentiation of Adipose-Derived Stem Cells from Porcine Subcutaneous Adipose Tissues.</a> Journal of Visualized Experiments. (109), e53886 (2016).</li><li>Ye, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+and+functional+characteristics+of+the+thoracic+aorta+perivascular+adipocyte.">Developmental and functional characteristics of the thoracic aorta perivascular adipocyte.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 76 (4), 777-789 (2019).</li><li>Medeiros, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+evolution+of+the+neural+crest:+new+perspectives+from+lamprey+and+invertebrate+neural+crest-like+cells.">The evolution of the neural crest: new perspectives from lamprey and invertebrate neural crest-like cells.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews. Developmental Biology. 2 (1), 1-15 (2013).</li><li>Fu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+Crest+Cells+Differentiate+Into+Brown+Adipocytes+and+Contribute+to+Periaortic+Arch+Adipose+Tissue+Formation.">Neural Crest Cells Differentiate Into Brown Adipocytes and Contribute to Periaortic Arch Adipose Tissue Formation.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. , (2019).</li><li>Danielian, P. S., Muccino, D., Rowitch, D. H., Michael, S. K., McMahon, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modification+of+gene+activity+in+mouse+embryos+in+utero+by+a+tamoxifen-inducible+form+of+Cre+recombinase.">Modification of gene activity in mouse embryos in utero by a tamoxifen-inducible form of Cre recombinase.</a> Current Biology. 8 (24), 1323-1326 (1998).</li><li>Tamura, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+crest-derived+stem+cells+migrate+and+differentiate+into+cardiomyocytes+after+myocardial+infarction.">Neural crest-derived stem cells migrate and differentiate into cardiomyocytes after myocardial infarction.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 31 (3), 582-589 (2011).</li><li>Madisen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+robust+and+high-throughput+Cre+reporting+and+characterization+system+for+the+whole+mouse+brain.">A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain.</a> Nature Neuroscience. 13 (1), 133-140 (2010).</li><li>Tan, P., Pepin, &. #. 2. 0. 1. ;., Lavoie, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+Adipose+Tissue+Collection+and+Processing+for+RNA+Analysis.">Mouse Adipose Tissue Collection and Processing for RNA Analysis.</a> Journal of Visualized Experiments. (131), e57026 (2018).</li><li>Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+specific+cell+population+by+fluorescence+activated+cell+sorting+(FACS).">Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS).</a> Journal of Visualized Experiments. (41), e1546 (2010).</li><li>Gupta, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zfp423+expression+identifies+committed+preadipocytes+and+localizes+to+adipose+endothelial+and+perivascular+cells.">Zfp423 expression identifies committed preadipocytes and localizes to adipose endothelial and perivascular cells.</a> Cell Metabolism. 15 (2), 230-239 (2012).</li><li>Sowa, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose+stromal+cells+contain+phenotypically+distinct+adipogenic+progenitors+derived+from+neural+crest.">Adipose stromal cells contain phenotypically distinct adipogenic progenitors derived from neural crest.</a> PLoS One. 8 (12), 84206 (2013).</li><li>Billo, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+generation+of+adipocytes+by+the+neural+crest.">The generation of adipocytes by the neural crest.</a> Development. 134 (12), 2283-2292 (2007).</li><li>Thelen, K., Ayala-Lopez, N., Watts, S. W., Contreras, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+and+Adipogenesis+Induction+of+Adipocyte+Progenitors+from+Perivascular+Adipose+Tissue+Isolated+by+Magnetic+Activated+Cell+Sorting.">Expansion and Adipogenesis Induction of Adipocyte Progenitors from Perivascular Adipose Tissue Isolated by Magnetic Activated Cell Sorting.</a> Journal of Visualized Experiments. (124), e55818 (2017).</li></ol>

En este estudio, presentamos un método fiable para el aislamiento, cultivo e inducción adipogénica de NCADSC extraídos del PVAT de Wnt-1 Cre+/-; Ratones transgénicos Rosa26RFP/+ diseñados para producir RFP+ ADSC. Los informes anteriores muestran que no hay ninguna diferencia significativa en la expresión de marcadores generales de células madre mesenquimales multipotentes (MSC) en NCADSCs y no NCADSCs22, y que los NCADSC tienen un fuerte potencial para dife...

La prevalencia de la obesidad está aumentando en todo el mundo, lo que aumenta el riesgo de enfermedades crónicas relacionadas, incluidas las enfermedades cardiovasculares y la diabetes1. PVAT rodea los vasos sanguíneos y es una fuente importante de factores endocrinos y paracrinos involucrados en la función de la vasculatura. Los estudios clínicos muestran que el alto contenido de PVAT es un factor de riesgo independiente de enfermedad cardiovascular2,3, y su función patológica depende del fenotipo de las células madre derivadas de la adiposa constituyente (ADSC)4.
Aunque las líneas celulares ADSC como la murino 3T3-L1, 3T3-F442A y OP9 son modelos celulares útiles para estudiar la adipogénesis o lipogénesis5, los mecanismos reguladores de la adipogénesis difieren entre las líneas celulares y las células primarias. Los ADSC en la fracción de células vasculares estromales (SVF) se aislaron directamente de los tejidos adiposos e indujeron a diferenciarse en adipocitos probablemente recapitulan in vivo adipogénesis y lipogénesis6. Sin embargo, la fragilidad, la flotabilidad y las variaciones en el tamaño y los inmunofenotipos de los ADSC hacen que su aislamiento directo sea un reto. Además, los diferentes procedimientos de aislamiento también pueden afectar significativamente el fenotipo y la capacidad potencial adipogénica de estas células7,haciendo hincapié así en la necesidad de un protocolo que mantenga la integridad ADSC.
El tejido adiposo se clasifica típicamente como el tejido adiposo blanco morfológica y funcionalmente distinto (WAT), o el tejido adiposo marrón (BAT)8,que alberga distintos ADSC9. Mientras que los ADSC aislados de WAT subcutáneos perigonadal e inguinales se han caracterizado en estudios anteriores9,10,11,12, menos se sabe con respecto a los ADSC de PVAT que se compone principalmente de BAT13.
En un estudio reciente, encontramos que una parte de los ADSC residentes en el tejido adiposo del arco periaortico (PAAT) se derivan de las células de la cresta neural (NCC), una población transitoria de células progenitoras migratorias que se originan en el ectoderm14,15. Los ratones transgénicos Wnt1-Cre se utilizaron para rastrear el desarrollo de células de cresta neural16,17. Cruzamos Wnt1-Cre+ ratones con ratones Rosa26RFP/+ para generar Wnt-1 Cre+/-; Ratones Rosa26RFP/+, en los que los CNC y sus descendientes están etiquetados con proteína fluorescente roja (RFP) y se rastrean fácilmente in vivo e in vitro15. Aquí, describimos un método para aislar los ADSC derivados de cresta neural (ADSC derivados de NC, o NCADSC) del PAAT del ratón e inducen a los NCADSC a diferenciarse en adipocitos blancos o adipocitos marrones.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>4% PFA</td>
			<td>BBI life sciences</td>
			<td>E672002-0500</td>
			<td>Lot #: EC11FA0001</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>ABCONE (China)</td>
			<td>A47902</td>
			<td>1% working concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-cebp/&#945;</td>
			<td>ABclonal</td>
			<td>A0904</td>
			<td>1:1000 working concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse IgG, HRP-linked</td>
			<td>CST</td>
			<td>7076</td>
			<td>1:5000 working concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-perilipin</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>AB61682</td>
			<td>1 &#956;g/mL working concentration; lot #: GR66486-54</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-PPARy</td>
			<td>SANTA CRUZ</td>
			<td>sc-7273</td>
			<td>0.2 &#956;g/mL working concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-rabbit IgG, HRP-linked</td>
			<td>CST</td>
			<td>7074</td>
			<td>1:5000 working concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-&#946;-Tubulin</td>
			<td>CST</td>
			<td>2146</td>
			<td>1:1000 working concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>VWR life sciences</td>
			<td>0332-100G</td>
			<td>50 mg/mL working concentration; lot #: 0536C008</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase, Type I</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17018029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D4902</td>
			<td>0.1 &#181;M working concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erythrocyte Lysis Buffer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>00-4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Corning</td>
			<td>R35-076-CV</td>
			<td>50 mg/mL working concentration; lot #: R2040212FBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14025092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HDMEM</td>
			<td>Gelifesciences</td>
			<td>SH30243.01</td>
			<td>Lot #: AD20813268</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IBMX</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I7018</td>
			<td>0.5 mM working concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I3536</td>
			<td>1 &#956;g/mL working concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsurgical forceps</td>
			<td>Suzhou Mingren Medical Equipment Co.,Ltd. (China)</td>
			<td>MR-F201A-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsurgical scissor</td>
			<td>Suzhou Mingren Medical Equipment Co.,Ltd. (China)</td>
			<td>MR-H121A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oil Red O solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>O1516</td>
			<td>0.3% working concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (Phosphate buffered saline)</td>
			<td>ABCONE (China)</td>
			<td>P41970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrimeScript RT reagent Kit</td>
			<td>TAKARA</td>
			<td>RR047A</td>
			<td>Lot #: AK4802</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy kit</td>
			<td>TAKARA</td>
			<td>9767</td>
			<td>Lot #: AHF1991D</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rosa26RFP/+ mice</td>
			<td>JAX</td>
			<td>No.007909</td>
			<td>C57BL/6 backgroud; male and female</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rosiglitazone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R2408</td>
			<td>1 &#956;M working concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard forceps</td>
			<td>Suzhou Mingren Medical Equipment Co.,Ltd. (China)</td>
			<td>MR-F424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical scissor</td>
			<td>Suzhou Mingren Medical Equipment Co.,Ltd. (China)</td>
			<td>MR-S231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Premix Ex Taq</td>
			<td>TAKARA</td>
			<td>RR420A</td>
			<td>Lot #: AK9003</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triiodothyronine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T2877</td>
			<td>10 nM working concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wnt1-Cre+;PPAR&#947;flox/flox mice</td>
			<td>JAX</td>
			<td>No.009107</td>
			<td>C57BL/6 backgroud; male and female</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation, culture, and adipogenic induction of neural crest original adipose-derived stem cells from periaortic adipose tissue

Una cantidad excesiva de tejido adiposo que rodea los vasos sanguíneos (tejido adiposo perivascular, también conocido como PVAT) se asocia con un alto riesgo de enfermedad cardiovascular. Los ADSC derivados de diferentes tejidos adiposos muestran características distintas, y los del PVAT no han sido bien caracterizados. En un estudio reciente, informamos que algunos ADSC en el tejido adiposo del arco periaortico (PAAT) descienden de las células de la cresta neural (NCC), una población transitoria de células migratorias que se originan en el ectodermo.
En este artículo, describimos un protocolo para aislar los CNC etiquetados con proteína fluorescente roja (RFP) del PAAT de Wnt-1 Cre+/-; Rosa26RFP/+ ratones e inducir su diferenciación adipogénica in vitro. Brevemente, la fracción vascular estromal (SVF) se disocia enzimáticamente del PAAT, y los ADSC derivados de cresta neural RFP+ (NCADSC) se aíslan por la clasificación celular activada por fluorescencia (FACS). Los NCADSC se diferencian en adipocitos marrones y blancos, pueden ser crioconservados, y conservan su potencial adipogénico para pasajes de 3-5 euros. Nuestro protocolo puede generar abundantes ADSC del PVAT para modelar la adipogénesis PVAT o la lipogénesis in vitro. Por lo tanto, estos NCADSC pueden proporcionar un sistema valioso para el estudio de los interruptores moleculares involucrados en la diferenciación PVAT.

Usando el protocolo descrito anteriormente, obtuvimos .0.5–1.0 x 106 ADSC de 5–6 Wnt-1 Cre+/-; Rosa26RFP/+ ratones (48 semanas de edad, hombres o mujeres).
El diagrama de flujo de la colección de PAAT de ratones se presenta en la Figura 1. La morfología de los NCADSC era similar a la ADSC de otros ratones tejidos adiposos. Los NCADSC cultivados alcanzaron una confluencia del 80-90% después de 7-8 días de cultivo, y los NCAD...

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Isolation, Culture, and Adipogenic Induction of Neural Crest Original Adipose-Derived Stem Cells from Periaortic Adipose Tissue

Presentamos un protocolo para el aislamiento, el cultivo y la inducción adipogénica de células madre derivadas de cresta neural derivadas de la cresta adiposa (NCADSC) del tejido adiposorio periaortico de Wnt-1 Cre+/-; Ratones Rosa26RFP/+. Los NCADSC pueden ser una fuente de aXenatos de fácil acceso para modelar adipogénesis o lipogénesis in vitro.

Aislamiento, cultivo e inducción adipogénica de células madre originales adiposas de raíz de la cresta neuronal del tejido adiposorio

An excessive amount of adipose tissue surrounding the blood vessels (perivascular adipose tissue, also known as PVAT) is associated with a high risk of ...

Nuestra metodología simple y práctica se puede utilizar para obtener abundante ADSCS para el estudio de la adipogénesis PVAT in vitro y para la prueba de fármacos normales contra la obesidad y enfermedades cardiovasculares relacionadas. La ventaja de este método es la fluorescencia inherente de los NCADSC de biotina que necesita para etiquetar las células con anticuerpos conjugados de cromo flou para FACS, o clasificación de células activadas magnéticas. Este método se puede utilizar para adquirir abundante ADSC derivado de las células de la cresta neural del ectodermo para estudiar la adipogénesis PVAT, o lipogénesis in vitro.El uso de ratones jóvenes y tener experiencia con cautesis e adipogénesis inducida significa que las células 3T3 son fundamentales para el éxito de este protocolo. Demostrando el procedimiento estarán Yiding Qi, un estudiante de posgrado, y Lian Xu, un técnico de mi laboratorio. Para la disección PAAT, después de esterilizar la carcasa del ratón en 75%etanol durante cinco minutos, use tijeras para cortar y separar la piel en el abdomen.Corte a lo largo de la línea media ventral desde la pelvis hasta el cuello, y abra el abdomen. Mueva el hígado para exponer el diafragma y corte el diafragma y las costillas a ambos lados de la línea media. Pelar hacia atrás las costillas para exponer el corazón y los pulmones.Y quita los pulmones y el timo. Extraiga el PAAT junto con la aorta y el corazón en un plato de petri. Y corta la aorta en la raíz aórtica para eliminar el corazón.Luego, haz un corte entre el arco aórtico y la aorta descendente. Separe cuidadosamente el tejido adiposo que rodea ambas estructuras, y las arterias carótidas comunes izquierda y derecha de la pared torácica posterior. Es importante separar el PAAT de la raíz y como un vaso vascular más grande cuidadosamente, es la presencia de células de pared vascular puede afectar la eficiencia de FACS.Coloque el tejido en una placa de petri que contenga un tampón HBSS helado. Y usa fórceps estériles para eliminar la mayor cantidad posible de vasculatura y fascia. A continuación, transfiera el tejido adiposo a un tubo Eppendorf de dos mililitros, que contiene cinco mililitros de tamampón HBSS helado sobre hielo.Una vez recogido todo el PAAT, transfiera el tejido adiposo cosechado a un nuevo tubo de micro centrífuga de dos mililitros que contenga un mililitro de medio de digestión recién preparado. Y usa tijeras quirúrgicas para picar los tejidos. Transfiera la suspensión tisular a un tubo de 50 milímetros que contenga nueve mililitros de medio de digestión fresca.Y usa una pipeta de un mililitro para triturar los tejidos 10 veces. Cuando se haya obtenido una solución homogénea, incuba el tubo durante 30 a 45 minutos a 37 grados centígrados y 100 revoluciones por minuto, comprobando cada cinco a 10 minutos para evitar la sobredigestión. Cuando se pueda observar una solución de tejido adiposo homogénea de color amarillo claro al agitar suavemente el tubo, detenga la digestión con cinco mililitros de HDMEM complementados con un 10% de suero bovino fetal.Después de una mezcla exhaustiva, centrifugar la muestra de tejido adiposo. La fracción de célula vascular estromal será visible como un pellet pardón. Vuelva a suspender el pellet en 10 mililitros de medio de cultivo y filtre la suspensión celular a través de un colador celular de 70 micrómetros.Recoger las células por otra centrifugación. Y re-suspende suavemente el pellet en cinco mililitros de tórculo de eritrocitos tampón de lysis. Transfiera la suspensión a un tubo de 15 mililitros.Después de 10 minutos, detener la reacción con dos centrifugaciones en 10 mililitros de PBS, complementado con 1%de suero bovino fetal. Después de la segunda centrifugación, re-suspender el pellet en cinco mililitros de medio de cultivo sobre hielo. Y recoger las células con una centrifugación final.Entonces, vuelva a suspender las células en cinco mililitros del buffer FACS para contar. Para configurar un cultivo NCADSC, después de su aislamiento por FACS de acuerdo con los protocolos estándar, coloque las células en cinco veces 10 a las terceras celdas por centímetros de concentración cuadrada en cada pozo, una placa de cultivo de doce pozos. Medio de cultivo incompleto a 37 grados centígrados y 5% dióxido de carbono durante 20 a 24 horas.Al día siguiente, lave las células con 37 grados Celsius PBS, y alimente el cultivo con medio de cultivo fresco. Cuando el cultivo alcance entre el 80 y el 90% de confluencia, trate las células con dos mililitros de 0,25% de trippsina EDTA por pozo durante tres a cinco minutos a 37 grados centígrados. Cuando las células se han separado de la parte inferior de la placa, neutralizar las enzimas con dos mililitros de medio cultivado, y recoger las células cosechadas por centrifugación.Re-suspender el pellet en un mililitro de medio de cultivo fresco para el conteo. Y sembrar las células en una nueva placa de cultivo de 12 pozos en una concentración de cinco veces 10 a las terceras celdas por centímetros al cuadrado. Luego, re-suspenda las células restantes en medio de cultivo complementado con 10%dimetil sulfóxido para el almacenamiento congelado en nitrógeno líquido.Para inducir la diferenciación adipogénica, cuando las células alcanzan una confluencia del 80 al 90%, trate las células con medio de inducción adipogénico marrón o blanco durante dos días según corresponda. Al final de la incubación, lave suavemente las células dos veces con PBS antes de agregar el medio de inducción adipogénico fresco apropiado a cada pocóptil, y devolver las células a la incubadora de cultivo celular durante tres a cinco días adicionales de incubación. Los NCADSC cultivados alcanzan una confluencia de 80 a 90% después de siete a ocho días de cultura.Y demostrar una fibra de vidrio expandida como morfología. Para confirmar aún más su potencial adipogénico, se puede realizar la tinción roja de aceite de los NCADSC diferenciados para detectar adipocitos maduros. Típicamente, los adipocitos maduros se observan después de ocho días de inducción adipogénica blanca o marrón con más del 60% de los NCADSC que presentan diferenciación adipogénica.Tenga en cuenta que los NCADSC demuestran un potencial adipogénico muy reducido después de la translación. La inmunoblotting y la PCR cuantitativa cuantitativa en tiempo real revelan que la expresión de proteínas y genes relativos específicos de adipocitos aumenta significativamente en NCADSC diferenciados adipogénicamente después de ocho días de inducción adipogénica blanca. Del mismo modo, la expresión de genes específicos de adipocitos, y genes específicos de adipocitos marrones, también aumenta significativamente después de ocho días de inducción adipogénica marrón.Dado que la mayoría del protocolo de aislamiento NCADSC es simple, económico y no requiere el uso de anticuerpos, por lo que la fuerte intensidad fluida de IFP puede mejorar la eficiencia de nutrición de FACS.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

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Bone marrow-derived mesenchymal stromal cells (BM-MSCs) are considered the gold standard for stem cell-based tissue engineering applications. However, the ...

Investigación

Biología del Desarrollo

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Immunomagnetic Separation of Fat Depot-specific Sca1high Adipose-derived Stem Cells (ASCs)

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