Name: isolation, culture, and adipogenic induction of neural crest original adipose-derived stem cells from periaortic adipose tissue
Uploaded: 2020-03-02T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation, Culture, and Adipogenic Induction of Neural Crest Original Adipose-Derived Stem Cells from Periaortic Adipose Tissue at JoVE.com

National Key FoU Program of China (2018YFC1312504), National Natural Science Foundation of China (81970378, 81670360, 81870293) och Vetenskaps- och teknikkommissionen i Shanghai kommun (17411971000, 17140902402) tillhandahöll medlen för denna studie .

Djurprotokollet har granskats och godkänts av Animal Care Committee i Shanghai Jiao Tong University.
1. Generation av Wnt-1 Cre+/-; Rosa26RFP/+ Möss
<ol><li>Cross Wnt-1 Cre+/- möss16 med Rosa26RFP/+ möss18 för att generera Wnt-1 Cre+/-; Rosa26RFP/+ möss. Husmöss under en 12 h ljus/mörk cykel i en patogenfri anläggning vid 25 °C och 45 % luftfuktighet tills de är 4–8 ...

<ol>
	<li>Afshin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Health+Effects+of+Overweight+and+Obesity+in+195+Countries+over+25+Years.">Health Effects of Overweight and Obesity in 195 Countries over 25 Years.</a> New England Journal of Medicine. 377 (1), 13-27 (2017).</li><li>Brown, N. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perivascular+adipose+tissue+in+vascular+function+and+disease:+a+review+of+current+research+and+animal+models.">Perivascular adipose tissue in vascular function and disease: a review of current research and animal models.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 34 (8), 1621-1630 (2014).</li><li>Britton, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevalence,+distribution,+and+risk+factor+correlates+of+high+thoracic+periaortic+fat+in+the+Framingham+Heart+Study.">Prevalence, distribution, and risk factor correlates of high thoracic periaortic fat in the Framingham Heart Study.</a> Journal of the American Heart Association. 1 (6), 004200 (2012).</li><li>Police, S. B., Thatcher, S. E., Charnigo, R., Daugherty, A., Cassis, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obesity+promotes+inflammation+in+periaortic+adipose+tissue+and+angiotensin+II-induced+abdominal+aortic+aneurysm+formation.">Obesity promotes inflammation in periaortic adipose tissue and angiotensin II-induced abdominal aortic aneurysm formation.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 29 (10), 1458-1464 (2009).</li><li>Farmer, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+control+of+adipocyte+formation.">Transcriptional control of adipocyte formation.</a> Cell Metabolism. 4 (4), 263-273 (2006).</li><li>Aune, U. L., Ruiz, L., Kajimura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+differentiation+of+stromal+vascular+cells+to+beige/brite+cells.">Isolation and differentiation of stromal vascular cells to beige/brite cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (73), e50191 (2013).</li><li>Ruan, H., Zarnowski, M. J., Cushman, S. W., Lodish, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standard+isolation+of+primary+adipose+cells+from+mouse+epididymal+fat+pads+induces+inflammatory+mediators+and+down-regulates+adipocyte+genes.">Standard isolation of primary adipose cells from mouse epididymal fat pads induces inflammatory mediators and down-regulates adipocyte genes.</a> Journal of Biological Chemistry. 278 (48), 47585-47593 (2003).</li><li>Cinti, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Between+brown+and+white:+novel+aspects+of+adipocyte+differentiation.">Between brown and white: novel aspects of adipocyte differentiation.</a> Annals of Medicine. 43 (2), 104-115 (2011).</li><li>Van Harmelen, V., Rohrig, K., Hauner, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+proliferation+and+differentiation+capacity+of+human+adipocyte+precursor+cells+from+the+omental+and+subcutaneous+adipose+tissue+depot+of+obese+subjects.">Comparison of proliferation and differentiation capacity of human adipocyte precursor cells from the omental and subcutaneous adipose tissue depot of obese subjects.</a> Metabolism. 53 (5), 632-637 (2004).</li><li>Rodeheffer, M. S., Birsoy, K., Friedman, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+white+adipocyte+progenitor+cells+in+vivo.">Identification of white adipocyte progenitor cells in vivo.</a> Cell. 135 (2), 240-249 (2008).</li><li>Church, C. D., Berry, R., Rodeheffer, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+study+of+adipocyte+precursors.">Isolation and study of adipocyte precursors.</a> Methods in Enzymology. 537, 31-46 (2014).</li><li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Differentiation+of+Adipose-Derived+Stem+Cells+from+Porcine+Subcutaneous+Adipose+Tissues.">Isolation and Differentiation of Adipose-Derived Stem Cells from Porcine Subcutaneous Adipose Tissues.</a> Journal of Visualized Experiments. (109), e53886 (2016).</li><li>Ye, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+and+functional+characteristics+of+the+thoracic+aorta+perivascular+adipocyte.">Developmental and functional characteristics of the thoracic aorta perivascular adipocyte.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 76 (4), 777-789 (2019).</li><li>Medeiros, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+evolution+of+the+neural+crest:+new+perspectives+from+lamprey+and+invertebrate+neural+crest-like+cells.">The evolution of the neural crest: new perspectives from lamprey and invertebrate neural crest-like cells.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews. Developmental Biology. 2 (1), 1-15 (2013).</li><li>Fu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+Crest+Cells+Differentiate+Into+Brown+Adipocytes+and+Contribute+to+Periaortic+Arch+Adipose+Tissue+Formation.">Neural Crest Cells Differentiate Into Brown Adipocytes and Contribute to Periaortic Arch Adipose Tissue Formation.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. , (2019).</li><li>Danielian, P. S., Muccino, D., Rowitch, D. H., Michael, S. K., McMahon, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modification+of+gene+activity+in+mouse+embryos+in+utero+by+a+tamoxifen-inducible+form+of+Cre+recombinase.">Modification of gene activity in mouse embryos in utero by a tamoxifen-inducible form of Cre recombinase.</a> Current Biology. 8 (24), 1323-1326 (1998).</li><li>Tamura, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+crest-derived+stem+cells+migrate+and+differentiate+into+cardiomyocytes+after+myocardial+infarction.">Neural crest-derived stem cells migrate and differentiate into cardiomyocytes after myocardial infarction.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 31 (3), 582-589 (2011).</li><li>Madisen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+robust+and+high-throughput+Cre+reporting+and+characterization+system+for+the+whole+mouse+brain.">A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain.</a> Nature Neuroscience. 13 (1), 133-140 (2010).</li><li>Tan, P., Pepin, &. #. 2. 0. 1. ;., Lavoie, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+Adipose+Tissue+Collection+and+Processing+for+RNA+Analysis.">Mouse Adipose Tissue Collection and Processing for RNA Analysis.</a> Journal of Visualized Experiments. (131), e57026 (2018).</li><li>Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+specific+cell+population+by+fluorescence+activated+cell+sorting+(FACS).">Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS).</a> Journal of Visualized Experiments. (41), e1546 (2010).</li><li>Gupta, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zfp423+expression+identifies+committed+preadipocytes+and+localizes+to+adipose+endothelial+and+perivascular+cells.">Zfp423 expression identifies committed preadipocytes and localizes to adipose endothelial and perivascular cells.</a> Cell Metabolism. 15 (2), 230-239 (2012).</li><li>Sowa, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose+stromal+cells+contain+phenotypically+distinct+adipogenic+progenitors+derived+from+neural+crest.">Adipose stromal cells contain phenotypically distinct adipogenic progenitors derived from neural crest.</a> PLoS One. 8 (12), 84206 (2013).</li><li>Billo, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+generation+of+adipocytes+by+the+neural+crest.">The generation of adipocytes by the neural crest.</a> Development. 134 (12), 2283-2292 (2007).</li><li>Thelen, K., Ayala-Lopez, N., Watts, S. W., Contreras, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+and+Adipogenesis+Induction+of+Adipocyte+Progenitors+from+Perivascular+Adipose+Tissue+Isolated+by+Magnetic+Activated+Cell+Sorting.">Expansion and Adipogenesis Induction of Adipocyte Progenitors from Perivascular Adipose Tissue Isolated by Magnetic Activated Cell Sorting.</a> Journal of Visualized Experiments. (124), e55818 (2017).</li></ol>

I denna studie presenterar vi en tillförlitlig metod för isolering, kultur och adipogenic induktion av NCADSCs utvinns ur PVAT av Wnt-1 Cre+/-; Rosa26RFP/+ transgena möss som är utformade för att producera RFP+ ADSCs. Tidigare rapporter visar att det inte finns någon signifikant skillnad i uttrycket av allmänna multipotenta mesenchymal stamceller (MSCs) markörer i NCADSCs och icke NCADSCs22, och att NCADSCs har en stark potential att skilja till adipocyter ...

Förekomsten av fetma ökar över hela världen, vilket ökar risken för relaterade kroniska sjukdomar, inklusive hjärt-kärlsjukdom och diabetes1. PVAT omger blodkärl och är en viktig källa till endokrina och paracrine faktorer som deltar i vaskulatur funktion. Kliniska studier visar att hög PVAT-innehåll är en oberoende riskfaktor för hjärt-kärlsjukdom2,3, och dess patologiska funktion beror på fenotypen av den konstituerande fetthärledda stamceller (ADSCs)4.
Även ADSC cellinjer som murine 3T3-L1, 3T3-F442A och OP9 är användbara cellulära modeller för att studera adipogenesis eller lipogenesis5, reglerande mekanismer för adipogenesis skiljer sig mellan cellinjer och primära celler. ADSCs i stromal vaskulär cell fraktion (SVF) isolerade direkt från fettvävnad och inducerad att skilja till adipocyter troligen rekapitulate in vivo adipogenesis och lipogenesis6. Men bräcklighet, flytkraft, och variationer i storlek och immunophenotypes av ADSCs gör deras direkta isolering utmanande. Dessutom kan de olika isoleringsförfarandena också avsevärt påverka fenotyp och adipogen adrisk adrisk adriska potentiella förmåga för dessa celler7, vilket betonar behovet av ett protokoll som upprätthåller ADSC integritet.
Fettvävnad klassificeras vanligtvis som antingen morfologiskt och funktionellt distinkt vit fettvävnad (WAT), eller den bruna fettvävnaden (BAT)8, som hyser olika ADSCs9. Medan ADSCs isolerade från perigonadal och inguinal subkutana WATs har karakteriserats i tidigare studier9,10,11,12, mindre är känt när det gäller ADSCs från PVAT som huvudsakligen består av BAT13.
I en färsk studie fann vi att en del av de bosatta ADSCs i periaortic arch fettvävnad (PAAT) härrör från neurala crest celler (NCCs), en övergående population av flyttande stamceller som kommer från ektoderm14,15. Wnt1-Cre transgena möss användes för att spåra neurala crest cell utveckling16,17. Vi korsade Wnt1-Cre+ möss med Rosa26RFP /+ möss för att generera Wnt-1 Cre+/-; Rosa26RFP/+ möss, där NCCs och deras ättlingar är märkta med rött fluorescerande protein (RFP) och är lätt spåras in vivo och in vitro15. Här beskriver vi en metod för att isolera neurala crest härledda ADSCs (NC-härledda ADSCs, eller NCADSCs) från musen PAAT och förmå NCADSCs att skilja sig till vita adipocyter eller bruna adipocyter.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>4% PFA</td>
			<td>BBI life sciences</td>
			<td>E672002-0500</td>
			<td>Lot #: EC11FA0001</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>ABCONE (China)</td>
			<td>A47902</td>
			<td>1% working concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-cebp/&#945;</td>
			<td>ABclonal</td>
			<td>A0904</td>
			<td>1:1000 working concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse IgG, HRP-linked</td>
			<td>CST</td>
			<td>7076</td>
			<td>1:5000 working concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-perilipin</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>AB61682</td>
			<td>1 &#956;g/mL working concentration; lot #: GR66486-54</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-PPARy</td>
			<td>SANTA CRUZ</td>
			<td>sc-7273</td>
			<td>0.2 &#956;g/mL working concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-rabbit IgG, HRP-linked</td>
			<td>CST</td>
			<td>7074</td>
			<td>1:5000 working concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-&#946;-Tubulin</td>
			<td>CST</td>
			<td>2146</td>
			<td>1:1000 working concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>VWR life sciences</td>
			<td>0332-100G</td>
			<td>50 mg/mL working concentration; lot #: 0536C008</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase, Type I</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17018029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D4902</td>
			<td>0.1 &#181;M working concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erythrocyte Lysis Buffer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>00-4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Corning</td>
			<td>R35-076-CV</td>
			<td>50 mg/mL working concentration; lot #: R2040212FBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14025092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HDMEM</td>
			<td>Gelifesciences</td>
			<td>SH30243.01</td>
			<td>Lot #: AD20813268</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IBMX</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I7018</td>
			<td>0.5 mM working concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I3536</td>
			<td>1 &#956;g/mL working concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsurgical forceps</td>
			<td>Suzhou Mingren Medical Equipment Co.,Ltd. (China)</td>
			<td>MR-F201A-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsurgical scissor</td>
			<td>Suzhou Mingren Medical Equipment Co.,Ltd. (China)</td>
			<td>MR-H121A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oil Red O solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>O1516</td>
			<td>0.3% working concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (Phosphate buffered saline)</td>
			<td>ABCONE (China)</td>
			<td>P41970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrimeScript RT reagent Kit</td>
			<td>TAKARA</td>
			<td>RR047A</td>
			<td>Lot #: AK4802</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy kit</td>
			<td>TAKARA</td>
			<td>9767</td>
			<td>Lot #: AHF1991D</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rosa26RFP/+ mice</td>
			<td>JAX</td>
			<td>No.007909</td>
			<td>C57BL/6 backgroud; male and female</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rosiglitazone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R2408</td>
			<td>1 &#956;M working concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard forceps</td>
			<td>Suzhou Mingren Medical Equipment Co.,Ltd. (China)</td>
			<td>MR-F424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical scissor</td>
			<td>Suzhou Mingren Medical Equipment Co.,Ltd. (China)</td>
			<td>MR-S231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Premix Ex Taq</td>
			<td>TAKARA</td>
			<td>RR420A</td>
			<td>Lot #: AK9003</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triiodothyronine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T2877</td>
			<td>10 nM working concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wnt1-Cre+;PPAR&#947;flox/flox mice</td>
			<td>JAX</td>
			<td>No.009107</td>
			<td>C57BL/6 backgroud; male and female</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation, culture, and adipogenic induction of neural crest original adipose-derived stem cells from periaortic adipose tissue

En överdriven mängd fettvävnad som omger blodkärlen (perikulär fettvävnad, även känd som PVAT) är associerad med en hög risk för hjärt-kärlsjukdom. ADSCs som härrör från olika fettvävnader visar olika funktioner, och de från PVAT har inte varit väl karakteriserade. I en färsk studie rapporterade vi att vissa ADSCs i periaortic arch fettvävnad (PAAT) härstammar från neurala crest celler (NCCs), en övergående population av flyttande celler som härrör från ektoderm.
I detta dokument beskriver vi ett protokoll för isolerande rött fluorescerande protein (RFP)-märkta NCCs från PAAT av Wnt-1 Cre+/-; Rosa26RFP/+ möss och inducerande deras adipogena differentiering in vitro. Kort är stromal vaskulär fraktion (SVF) enzymatically separeras från PAAT, och RFP+ neurala crest härledda ADSCs (NCADSCs) är isolerade av fluorescens aktiverad cell sortering (FACS). NCADSCs skiljer sig åt både bruna och vita adipocyter, kan kryobevaras, och behålla sin adipogenic potential för ~ 3-5 passager. Vårt protokoll kan generera rikliga ADSCs från PVAT för modellering PVAT adipogenesis eller lipogenesis in vitro. Således kan dessa NCADSCs ge ett värdefullt system för att studera de molekylära växlar som deltar i PVAT differentiering.

Med hjälp av det protokoll som beskrivs ovan fick vi ~0,5–1,0 x 106 ADSCs från 5–6 Wnt-1 Cre+/-; Rosa26RFP/+ möss (48 veckor gamla, manliga eller kvinnliga).
Flödesschemat för insamling av PAAT från möss presenteras i figur 1. Morfologi nCADSCs liknade ADSC från andra möss fettvävnader. De odlade NCADSCs nådde 80-90% confluency efter 7-8 dagars kultur, och NCADSCs hade en utökad fibroblast-liknande morfologi (<stron...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation, Culture, and Adipogenic Induction of Neural Crest Original Adipose-Derived Stem Cells from Periaortic Adipose Tissue at JoVE.com

Isolation, Culture, and Adipogenic Induction of Neural Crest Original Adipose-Derived Stem Cells from Periaortic Adipose Tissue

Vi presenterar ett protokoll för isolering, kultur och adipogenic induktion av neurala crest härledda fett-härledda stamceller (NCADSCs) från periaortic fettvävnad wnt-1 Cre+/-; Rosa26RFP/+ möss. NCADSCs kan vara en lättillgänglig källa till ADSCs för modellering adipogenesis eller lipogenesis in vitro.

Isolering, kultur och adipogenic Induktion av neurala Crest Original Fett-Härledda stamceller från periaorektisk fettvävnad

An excessive amount of adipose tissue surrounding the blood vessels (perivascular adipose tissue, also known as PVAT) is associated with a high risk of ...

Vår enkla och praktiska metodik kan användas för att erhålla rikliga ADSCS för att studera PVAT adipogenesis in vitro och för att testa normala läkemedel mot fetma och relaterade hjärt-kärlsjukdomar. Fördelen med denna metod är den inneboende fluorescensen av NCADSCs av biotin du behöver för att märka cellerna med flou-krom konjugerade antikroppar för FACS, eller magnetiska aktiverad cellsortering. Denna metod kan användas för att förvärva rikliga ADSC härrör från neurala crest celler från ectoderm att studera PVAT adipogenesis, eller lipogenes in vitro.Använda unga möss och ha erfarenhet av kauteri och inducerad adipogenesis innebär 3T3 celler är avgörande för framgången för detta protokoll. Demonstrera förfarandet kommer att Yiding Qi, en grad student, och Lian Xu, en tekniker från mitt laboratorium. För PAAT dissektion, efter sterilisering av muskadaver i 75%etanol i fem minuter, använd sax för att klippa och separera huden på buken.Skär längs den ventrala mittlinjen från bäcken till halsen, och öppna buken. Flytta levern för att exponera membranet, och skär membranet och revbenen på båda sidor av mittlinjen. Skala tillbaka revbenen för att exponera hjärtat och lungorna.Och ta bort lungorna och brässen. Extrahera PAAT tillsammans med aorta och hjärta i en petriskål. Och skär av aorta vid aorta roten för att ta bort hjärtat.Gör sedan ett snitt mellan aortabågen och fallande aorta. Försiktigt separera fettvävnaden som omger båda strukturerna, och vänster och höger gemensamma halspulsådern från den bakre bröstväggen. Det är viktigt att skilja PAAT från roten och som en större kärlkärl försiktigt, är närvaron av kärlväggceller kan påverka FACS effektivitet.Placera vävnaden i en petriskål som innehåller iskall HBSS-buffert. Och använd sterila tång för att ta bort så mycket av vasculature och fascia som möjligt. Sedan överför du fettvävnaden till ett två milliliter Eppendorf-rör, som innehåller punkt fem milliliter iskall HBSS-buffert på is.När hela PAAT har samlats in, överför den skördade fettvävnaden till ett nytt två milliliter mikrocentrifugrör som innehåller en milliliter nyberedda digestionsmedium. Och använd kirurgisk sax för att finhacka vävnaderna. Överför vävnadsslammet till ett 50 millimeters rör som innehåller nio milliliter färskt matsmältningsmedium.Och använd en en milliliterpipett för att triturtera vävnaderna 10 gånger. När en homogen lösning har erhållits, inkubera röret i 30 till 45 minuter vid 37 grader Celsius och 100 varv per minut, kontrollera var femte till 10 minuter för att förhindra översmältning. När en ljusgul homogen fettvävnad lösning kan observeras vid skonsam virvlande av röret, stoppa matsmältningen med fem milliliter HDMEM kompletteras med 10%fetala nötkreatur serum.Efter en grundlig blandning centrifugera fettvävnadsprovet. Den stromala kärlcellsfraktionen kommer att synas som en brunaktig pellet. Åter upphäva pelleten i 10 milliliter odlingsmedium, och filtrera cellupphängningen genom en 70 mikrometercellsil.Samla in cellerna genom en annan centrifugering. Och försiktigt åter upphäva pelleten i fem milliliter erytrocyter lysis buffert. Överför suspensionen till ett 15 milliliterrör.Efter 10 minuter, stoppa reaktionen med två centrifugeringar i 10 milliliter PBS, kompletterat med 1%fetala nötkreatur serum. Efter den andra centrifugeringen, åter upphäva pelleten i fem milliliter av odlingsmedium på is. Och samla in cellerna med en slutlig centrifugering.Sedan, åter upphäva cellerna i fem milliliter FACS buffert för räkning. För att ställa in en NCADSC kultur, efter deras isolering av FACS enligt standardprotokoll, placera cellerna på en fem gånger 10 till de tredje cellerna per centimeter kvadratkoncentration i varje brunn, en tolv väl kultur tallrik. Ofullständigt odlingsmedium vid 37 grader Celsius och 5 %koldioxid i 20 till 24 timmar.Nästa dag, tvätta cellerna med 37 grader Celsius PBS, och mata kulturen med färskt odlingsmedium. När kulturen når 80 till 90%konfluency, behandla cellerna med två milliliter på 0,25%trypsin EDTA per brunn i tre till fem minuter vid 37 grader Celsius. När cellerna har lossnat från botten av plattan, neutralisera enzymerna med två milliliter av odlade medium, och samla de skördade cellerna genom centrifugeringen.Åter upphäva pelleten i en milliliter av färskt odlingsmedium för räkning. Och utsäde cellerna i en ny 12 väl kultur tallrik i en fem gånger 10 till de tredje cellerna per centimeter kvadrat koncentration. Sedan, åter upphäva de återstående cellerna i odlingsmedium kompletteras med 10%dimetylsulfoxid för fryst lagring i flytande kväve.För att inducera adipogenic differentiering, när cellerna når en 80 till 90%konfluency, behandla cellerna med brunt eller vitt adipogenic induktionsmedium i två dagar på lämpligt sätt. I slutet av inkubationen tvättar du försiktigt cellerna två gånger med PBS innan du lägger till lämpligt färskt adipogent induktionsmedium till varje brunn, och returnerar cellerna till cellodlingsinkubatorn i ytterligare tre till fem dagars inkubation. Odlade NCADSCs nå en 80 till 90%konfluency efter sju till åtta dagar av kultur.Och demonstrera en expanderad glasfiber som morfologi. För att ytterligare bekräfta deras adipogenic potential, olja röd färgning av de differentierade NCADSCs kan utföras för att upptäcka mogna adipocyter. Typiskt, mogna adipocyter observeras efter åtta dagar av vita eller bruna adipogenic induktion med över 60%av de NCADSCs uppvisar adipogenic differentiering.Observera att NCADSCs uppvisar en kraftigt reducerad adipogenic potential efter passaging. Immunoblotting och kvantitativ realtid PCR avslöja att uttryck av adipocyte specifika relativa proteiner och gener avsevärt ökar i adipogenically differentierade NCADSCs efter åtta dagar av vit adipogenic induktion. På samma sätt ökar uttryck av adipocyte specifika gener, och brun adipocyte specifika gener, också signifikant efter åtta dagar av brun adipogenic induktion.Eftersom de flesta NCADSC isoleringsprotokoll är enkel, ekonomisk, och inte kräver användning av antikroppar, för det, den starka vätska skäl intensitet IFP kan förbättra FACS näring effektivitet.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Isolation and Enrichment of Human Adipose-derived Stromal Cells for Enhanced Osteogenesis

Isolering och anrikning av humant Fett-stromala celler för Enhanced Osteogenesis

Bone marrow-derived mesenchymal stromal cells (BM-MSCs) are considered the gold standard for stem cell-based tissue engineering applications. However, the ...

Direct Induction of Human Neural Stem Cells from Peripheral Blood Hematopoietic Progenitor Cells

Direkt Induktion av humana neurala stamceller från perifert blod hematopoetiska progenitorceller

Human disease specific neuronal cultures are essential for generating in vitro models for human neurological diseases. However, the lack of access to ...

Culturing Human Pluripotent and Neural Stem Cells in an Enclosed Cell Culture System for Basic and Preclinical Research

Odling av humana pluripotenta och neurala stamceller i en sluten cellodlingssystem för Basic och preklinisk forskning

This paper describes how to use a custom manufactured, commercially available enclosed cell culture system for basic and preclinical research. Biosafety ...

Isolation and Differentiation of Adipose-Derived Stem Cells from Porcine Subcutaneous Adipose Tissues

Isolering och differentiering av Fett-Derived stamceller från svin subkutan fettvävnad

Obesity is an unconstrained worldwide epidemic. Unraveling molecular controls in adipose tissue development holds promise to treat obesity or diabetes. ...

Immunomagnetic Separation of Fat Depot-specific Sca1high Adipose-derived Stem Cells (ASCs)

Immunomagnetic Separation of Fat Depot-specific Sca1high Adipose-derived Stem Cells ASCs

Immunomagnetiska separation av fett Depot specifika Sca1<sup&gt; hög</sup&gt; Fetthärledda stamceller (ASC: er)

The isolation of adipose-derived stem cells (ASCs) is an important method in the field of adipose tissue biology, adipogenesis, and extracellular matrix ...

Isolation and Expansion of Mesenchymal Stem/Stromal Cells Derived from Human Placenta Tissue

Isolering och Expansion av mesenkymala stam / stromaceller celler från Human Placenta Tissue

Mesenchymal stem/stromal cells (MSC) are promising candidates for use in cell-based therapies. In most cases, therapeutic response appears to be cell-dose ...

Large-Scale Production of Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells Using a Highly Reproducible Small Molecule-Based Differentiation Protocol

Storskalig produktion av Cardiomyocytes från Human pluripotenta stamceller med hjälp av en mycket reproducerbar liten molekyl baserad differentiering protokoll

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust ...

Chondrogenic Differentiation Induction of Adipose-derived Stem Cells by Centrifugal Gravity

Kondrogena Differentiering Induktion av Fett härrörande stamceller genom Radial Gravity

Impaired cartilage cannot heal naturally. Currently, the most advanced therapy for defects in cartilage is the transplantation of chondrocytes ...

Rapid Isolation of BMPR-IB+ Adipose-Derived Stromal Cells for Use in a Calvarial Defect Healing Model

Snabb Isolering av BMPR-IB + Fett-stromala celler för användning i en calvarial defekt Healing Modell

Invasive cancers, major injuries, and infection can cause bone defects that are too large to be reconstructed with preexisting bone from the patient's own ...

In Vivo Tracking of Human Adipose-derived Mesenchymal Stem Cells in a Rat Knee Osteoarthritis Model with Fluorescent Lipophilic Membrane Dye

In Vivo Tracking of Human Adipose-derived Mesenchymal Stem Cells in a Rat Knee Osteoarthritis Model with Fluorescent Lipophilic Membrane Dye

In Vivo Spårning av mänskliga Adipose-derived mesenkymala stamceller i en råtta knä artros modell med fluorescerande lipofila membran färgämne

In order to support the clinical application of human adipose-derived mesenchymal stem cell (haMSC) therapy for knee osteoarthritis (KOA), we examined the ...