Name: isolation, culture, and adipogenic induction of neural crest original adipose-derived stem cells from periaortic adipose tissue
Uploaded: 2020-03-02T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation, Culture, and Adipogenic Induction of Neural Crest Original Adipose-Derived Stem Cells from Periaortic Adipose Tissue at JoVE.com

Çin Ulusal Anahtar Ar-Ge Programı (2018YFC1312504), Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (81970378, 81670360, 81870293) ve Şangay Belediyesi Bilim ve Teknoloji Komisyonu (174119710000, 17140902402) bu çalışmanın fonlarını sağladı. .

Hayvan protokolü gözden geçirildi ve Şangay Jiao Tong Üniversitesi Hayvan Bakım Komitesi tarafından onaylandı.
1. Wnt-1 Cre+/-Üretimi ; Rosa26RFP/+ Fareler
<ol><li>Çapraz Wnt-1 Cre+/- fareler16 Rosa26RFP / + fareler18 Wnt-1 Cre+/-oluşturmak için; Rosa26RFP/+ fareler. Ev fareleri 25 °C'de patojensiz bir tesiste 12 saat açık/karanlık bir döngü altında ve 4-8 haft...

<ol>
	<li>Afshin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Health+Effects+of+Overweight+and+Obesity+in+195+Countries+over+25+Years.">Health Effects of Overweight and Obesity in 195 Countries over 25 Years.</a> New England Journal of Medicine. 377 (1), 13-27 (2017).</li><li>Brown, N. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perivascular+adipose+tissue+in+vascular+function+and+disease:+a+review+of+current+research+and+animal+models.">Perivascular adipose tissue in vascular function and disease: a review of current research and animal models.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 34 (8), 1621-1630 (2014).</li><li>Britton, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevalence,+distribution,+and+risk+factor+correlates+of+high+thoracic+periaortic+fat+in+the+Framingham+Heart+Study.">Prevalence, distribution, and risk factor correlates of high thoracic periaortic fat in the Framingham Heart Study.</a> Journal of the American Heart Association. 1 (6), 004200 (2012).</li><li>Police, S. B., Thatcher, S. E., Charnigo, R., Daugherty, A., Cassis, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obesity+promotes+inflammation+in+periaortic+adipose+tissue+and+angiotensin+II-induced+abdominal+aortic+aneurysm+formation.">Obesity promotes inflammation in periaortic adipose tissue and angiotensin II-induced abdominal aortic aneurysm formation.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 29 (10), 1458-1464 (2009).</li><li>Farmer, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+control+of+adipocyte+formation.">Transcriptional control of adipocyte formation.</a> Cell Metabolism. 4 (4), 263-273 (2006).</li><li>Aune, U. L., Ruiz, L., Kajimura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+differentiation+of+stromal+vascular+cells+to+beige/brite+cells.">Isolation and differentiation of stromal vascular cells to beige/brite cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (73), e50191 (2013).</li><li>Ruan, H., Zarnowski, M. J., Cushman, S. W., Lodish, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standard+isolation+of+primary+adipose+cells+from+mouse+epididymal+fat+pads+induces+inflammatory+mediators+and+down-regulates+adipocyte+genes.">Standard isolation of primary adipose cells from mouse epididymal fat pads induces inflammatory mediators and down-regulates adipocyte genes.</a> Journal of Biological Chemistry. 278 (48), 47585-47593 (2003).</li><li>Cinti, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Between+brown+and+white:+novel+aspects+of+adipocyte+differentiation.">Between brown and white: novel aspects of adipocyte differentiation.</a> Annals of Medicine. 43 (2), 104-115 (2011).</li><li>Van Harmelen, V., Rohrig, K., Hauner, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+proliferation+and+differentiation+capacity+of+human+adipocyte+precursor+cells+from+the+omental+and+subcutaneous+adipose+tissue+depot+of+obese+subjects.">Comparison of proliferation and differentiation capacity of human adipocyte precursor cells from the omental and subcutaneous adipose tissue depot of obese subjects.</a> Metabolism. 53 (5), 632-637 (2004).</li><li>Rodeheffer, M. S., Birsoy, K., Friedman, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+white+adipocyte+progenitor+cells+in+vivo.">Identification of white adipocyte progenitor cells in vivo.</a> Cell. 135 (2), 240-249 (2008).</li><li>Church, C. D., Berry, R., Rodeheffer, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+study+of+adipocyte+precursors.">Isolation and study of adipocyte precursors.</a> Methods in Enzymology. 537, 31-46 (2014).</li><li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Differentiation+of+Adipose-Derived+Stem+Cells+from+Porcine+Subcutaneous+Adipose+Tissues.">Isolation and Differentiation of Adipose-Derived Stem Cells from Porcine Subcutaneous Adipose Tissues.</a> Journal of Visualized Experiments. (109), e53886 (2016).</li><li>Ye, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+and+functional+characteristics+of+the+thoracic+aorta+perivascular+adipocyte.">Developmental and functional characteristics of the thoracic aorta perivascular adipocyte.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 76 (4), 777-789 (2019).</li><li>Medeiros, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+evolution+of+the+neural+crest:+new+perspectives+from+lamprey+and+invertebrate+neural+crest-like+cells.">The evolution of the neural crest: new perspectives from lamprey and invertebrate neural crest-like cells.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews. Developmental Biology. 2 (1), 1-15 (2013).</li><li>Fu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+Crest+Cells+Differentiate+Into+Brown+Adipocytes+and+Contribute+to+Periaortic+Arch+Adipose+Tissue+Formation.">Neural Crest Cells Differentiate Into Brown Adipocytes and Contribute to Periaortic Arch Adipose Tissue Formation.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. , (2019).</li><li>Danielian, P. S., Muccino, D., Rowitch, D. H., Michael, S. K., McMahon, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modification+of+gene+activity+in+mouse+embryos+in+utero+by+a+tamoxifen-inducible+form+of+Cre+recombinase.">Modification of gene activity in mouse embryos in utero by a tamoxifen-inducible form of Cre recombinase.</a> Current Biology. 8 (24), 1323-1326 (1998).</li><li>Tamura, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+crest-derived+stem+cells+migrate+and+differentiate+into+cardiomyocytes+after+myocardial+infarction.">Neural crest-derived stem cells migrate and differentiate into cardiomyocytes after myocardial infarction.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 31 (3), 582-589 (2011).</li><li>Madisen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+robust+and+high-throughput+Cre+reporting+and+characterization+system+for+the+whole+mouse+brain.">A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain.</a> Nature Neuroscience. 13 (1), 133-140 (2010).</li><li>Tan, P., Pepin, &. #. 2. 0. 1. ;., Lavoie, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+Adipose+Tissue+Collection+and+Processing+for+RNA+Analysis.">Mouse Adipose Tissue Collection and Processing for RNA Analysis.</a> Journal of Visualized Experiments. (131), e57026 (2018).</li><li>Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+specific+cell+population+by+fluorescence+activated+cell+sorting+(FACS).">Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS).</a> Journal of Visualized Experiments. (41), e1546 (2010).</li><li>Gupta, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zfp423+expression+identifies+committed+preadipocytes+and+localizes+to+adipose+endothelial+and+perivascular+cells.">Zfp423 expression identifies committed preadipocytes and localizes to adipose endothelial and perivascular cells.</a> Cell Metabolism. 15 (2), 230-239 (2012).</li><li>Sowa, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose+stromal+cells+contain+phenotypically+distinct+adipogenic+progenitors+derived+from+neural+crest.">Adipose stromal cells contain phenotypically distinct adipogenic progenitors derived from neural crest.</a> PLoS One. 8 (12), 84206 (2013).</li><li>Billo, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+generation+of+adipocytes+by+the+neural+crest.">The generation of adipocytes by the neural crest.</a> Development. 134 (12), 2283-2292 (2007).</li><li>Thelen, K., Ayala-Lopez, N., Watts, S. W., Contreras, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+and+Adipogenesis+Induction+of+Adipocyte+Progenitors+from+Perivascular+Adipose+Tissue+Isolated+by+Magnetic+Activated+Cell+Sorting.">Expansion and Adipogenesis Induction of Adipocyte Progenitors from Perivascular Adipose Tissue Isolated by Magnetic Activated Cell Sorting.</a> Journal of Visualized Experiments. (124), e55818 (2017).</li></ol>

Bu çalışmada Wnt-1 Cre+/-PVAT'ından çıkarılan NCADSC'lerin izolasyonu, kültürü ve adipojenik indüksiyonu için güvenilir bir yöntem sayılmaktadır. RFP+ ADSC üretmek için tasarlanmış Rosa26RFP/+ transgenik fareler. Önceki raporlar, NCADSCs ve non NCADSCs22genel multipotent mezenkimal kök hücre (MSCs) belirteçlerinin ekspresyonunda anlamlı bir fark olmadığını ve NCADSCs in vitro15,22</su...

Obezite prevalansı dünya çapında artmaktadır, hangi kardiyovasküler hastalık ve diyabet de dahil olmak üzere ilgili kronik hastalıkların riskini artırır1. PVAT kan damarlarını çevreler ve vaskülatür fonksiyonunda rol oynayan endokrin ve parakrin faktörlerin önemli bir kaynağıdır. Klinik çalışmalar, yüksek PVAT içeriğinin kardiyovasküler hastalık2,3bağımsız bir risk faktörü olduğunu ve patolojik fonksiyonu kurucu yağ türetilmiş kök hücrelerin fenotip bağlıdır göstermektedir (ADSCs)4.
Murine 3T3-L1, 3T3-F442A ve OP9 gibi ADSC hücre hatları adipogenez veya lipogenez5'iincelemek için yararlı hücresel modeller olmasına rağmen, adipogenez için düzenleyici mekanizmalar hücre hatları ile birincil hücreler arasında farklılık gösterir. Stromal vasküler hücre fraksiyonundaki (SVF) ADSK'lar doğrudan yağ dokularından izole edilmiş ve adipositlere ayırt etmek için indüklenen adipositler büyük olasılıkla vivo adipogenez ve lipogenezde recapitulate6. Ancak, kırılganlık, yüzdürme ve ADSC'lerin boyut ve immünofenotiplerindeki farklılıklar doğrudan izolasyonlarını zora sokuyor. Buna ek olarak, farklı izolasyon prosedürleri de önemli ölçüde bu hücrelerin fenotip ve adipojenik potansiyel yeteneğini etkileyebilir7,böylece ADSC bütünlüğünü koruyan bir protokol ihtiyacını vurgulayarak.
Yağ dokusu genellikle morfolojik ve işlevsel olarak farklı beyaz yağ dokusu (WAT) veya kahverengi yağ dokusu (BAT)8olarak sınıflandırılır, hangi farklı ADSCs barındıran9. Perigonadal ve inguinal subkutan WATs izole ADSCs önceki çalışmalarda karakterize edilmiş iken9,10,11,12, daha az ağırlıklı olarak BAT oluşur PVAT gelen ADSCs ile ilgili olarak bilinmektedir13.
Yakın tarihli bir çalışmada, periaortik ark yağ dokusunda yerleşik ADSC'lerin bir kısmının (PAAT) nöral krest hücrelerinden (NCD) türediğini bulduk, ektoderm den kaynaklanan göçmen progenitor hücreleringeçici bir popülasyon14,15. Wnt1-Cre transgenik fareler nöral krest hücre gelişimini izlemek için kullanılmıştır16,17. Biz Wnt-1 Cre+/-oluşturmak için Rosa26RFP / + fareler ile Wnt1-Cre+ fareler geçti; Rosa26RFP / + fareler, hangi NCCs ve onların torunları kırmızı floresan protein (RFP) ile etiketlenir ve kolayca in vivo ve in vitro15izlenir . Burada, fare PAAT'tan nöral krest türetilmiş ADSC'leri (NC türetilmiş ADSC'ler veya NCADSC'ler) yalıtmak için bir yöntem açıklıyoruz ve NCADSC'leri beyaz adipositler veya kahverengi adipositler olarak ayırt etmeye ikna ediyoruz.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>4% PFA</td>
			<td>BBI life sciences</td>
			<td>E672002-0500</td>
			<td>Lot #: EC11FA0001</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>ABCONE (China)</td>
			<td>A47902</td>
			<td>1% working concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-cebp/&#945;</td>
			<td>ABclonal</td>
			<td>A0904</td>
			<td>1:1000 working concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse IgG, HRP-linked</td>
			<td>CST</td>
			<td>7076</td>
			<td>1:5000 working concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-perilipin</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>AB61682</td>
			<td>1 &#956;g/mL working concentration; lot #: GR66486-54</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-PPARy</td>
			<td>SANTA CRUZ</td>
			<td>sc-7273</td>
			<td>0.2 &#956;g/mL working concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-rabbit IgG, HRP-linked</td>
			<td>CST</td>
			<td>7074</td>
			<td>1:5000 working concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-&#946;-Tubulin</td>
			<td>CST</td>
			<td>2146</td>
			<td>1:1000 working concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>VWR life sciences</td>
			<td>0332-100G</td>
			<td>50 mg/mL working concentration; lot #: 0536C008</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase, Type I</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17018029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D4902</td>
			<td>0.1 &#181;M working concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erythrocyte Lysis Buffer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>00-4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Corning</td>
			<td>R35-076-CV</td>
			<td>50 mg/mL working concentration; lot #: R2040212FBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14025092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HDMEM</td>
			<td>Gelifesciences</td>
			<td>SH30243.01</td>
			<td>Lot #: AD20813268</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IBMX</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I7018</td>
			<td>0.5 mM working concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I3536</td>
			<td>1 &#956;g/mL working concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsurgical forceps</td>
			<td>Suzhou Mingren Medical Equipment Co.,Ltd. (China)</td>
			<td>MR-F201A-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsurgical scissor</td>
			<td>Suzhou Mingren Medical Equipment Co.,Ltd. (China)</td>
			<td>MR-H121A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oil Red O solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>O1516</td>
			<td>0.3% working concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (Phosphate buffered saline)</td>
			<td>ABCONE (China)</td>
			<td>P41970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrimeScript RT reagent Kit</td>
			<td>TAKARA</td>
			<td>RR047A</td>
			<td>Lot #: AK4802</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy kit</td>
			<td>TAKARA</td>
			<td>9767</td>
			<td>Lot #: AHF1991D</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rosa26RFP/+ mice</td>
			<td>JAX</td>
			<td>No.007909</td>
			<td>C57BL/6 backgroud; male and female</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rosiglitazone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R2408</td>
			<td>1 &#956;M working concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard forceps</td>
			<td>Suzhou Mingren Medical Equipment Co.,Ltd. (China)</td>
			<td>MR-F424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical scissor</td>
			<td>Suzhou Mingren Medical Equipment Co.,Ltd. (China)</td>
			<td>MR-S231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Premix Ex Taq</td>
			<td>TAKARA</td>
			<td>RR420A</td>
			<td>Lot #: AK9003</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triiodothyronine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T2877</td>
			<td>10 nM working concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wnt1-Cre+;PPAR&#947;flox/flox mice</td>
			<td>JAX</td>
			<td>No.009107</td>
			<td>C57BL/6 backgroud; male and female</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation, culture, and adipogenic induction of neural crest original adipose-derived stem cells from periaortic adipose tissue

Kan damarlarını çevreleyen yağ dokusunun aşırı miktarda (perivasküler yağ dokusu, ayrıca PVAT olarak da bilinir) kardiyovasküler hastalık riski ile ilişkilidir. Farklı yağ dokularından elde edilen ADSC'ler farklı özellikler gösterir ve PVAT'tan elde edilenler iyi karakterize edilmemiştir. Yakın zamanda yapılan bir çalışmada, periaortik ark yağ dokusundaki bazı ADSC'lerin (PAAT) ektodermden kaynaklanan geçici bir göçmen hücre popülasyonu olan nöral krest hücrelerinden (NJKs) indiğini bildirdik.
Bu yazıda, wnt-1 Cre+/-PAAT kırmızı floresan protein (RFP) etiketli NCCs izole etmek için bir protokol açıklar; Rosa26RFP/+ fareler ve in vitro onların adipojenik farklılaşma indükleyen. Kısaca, stromal vasküler fraksiyonu (SVF) enzimatik OLARAK PAAT'tan ayrıştırılır ve RFP+ nöral krest türetilen ADSC'ler (NCADSCs) floresan aktif hücre ayrıştırma (FACS) tarafından izole edilir. NCADSCs kahverengi ve beyaz adipositler hem de ayırt, cryopreserved olabilir, ve ~ 3-5 pasajlar için adipojenik potansiyelini korumak. Protokolümüz, PVAT adipogenez veya lipogenezin in vitro modelini almak için PVAT'tan bol miktarda ADSC üretebilir. Böylece, bu NCADSCs PVAT farklılaşma dahil moleküler anahtarları incelemek için değerli bir sistem sağlayabilir.

Yukarıda açıklanan protokolü kullanarak, 5-6 Wnt-1 Cre+/-den ~ 0.5-1.0 x 106 ADSCs elde ; Rosa26RFP/+ fareler (48 haftalık, erkek veya dişi).
PaAT'ın farelerden toplanmasının akış şeması Şekil 1'desunulmuştur. NCADSC'lerin morfolojisi diğer farelerin yağ dokularından gelen ADSC'ye benzerdi. Kültürlü NCADSC'ler 7-8 günlük kültürden sonra %80-90 biraraya geldi ve NCADSC'lerde fibroblast benzeri morfolojisi ge...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation, Culture, and Adipogenic Induction of Neural Crest Original Adipose-Derived Stem Cells from Periaortic Adipose Tissue at JoVE.com

Isolation, Culture, and Adipogenic Induction of Neural Crest Original Adipose-Derived Stem Cells from Periaortic Adipose Tissue

Wnt-1 Cre+/-periaortik yağ dokusundan elde edilen adipoz türetilmiş kök hücrelerin (NCADSCs) izolasyonu, kültürü ve adipojenik indüksiyonu için bir protokol salıyoruz. Rosa26RFP/+ fareler. NCADSCs in vitro adipogenez veya lipogenez modelleme için ADSCs kolay erişilebilir bir kaynak olabilir.

Periaortik Yağ Dokusundan Nöral Adipoz-Türetilmiş Kök Hücrelerin İzolasyon, Kültür ve Adipojenik İndüksiyonu

An excessive amount of adipose tissue surrounding the blood vessels (perivascular adipose tissue, also known as PVAT) is associated with a high risk of ...

Basit ve pratik metodolojimiz, PVAT adipogenezinin in vitro olarak incelenmesi ve obezite ve buna bağlı kardiyovasküler hastalıklara karşı normal ilaçların test edilmesi için bol miktarda ADSCS elde etmek için kullanılabilir. Bu yöntemin avantajı, biotin NCADSCs doğal floresan si FACS veya manyetik aktif hücre sıralama için flou-krom konjuge antikorlar ile hücreleri etiketlemek gerekir. Bu yöntem pvat adipogenezi veya lipogenez in vitro incelemek için ektoderm nöral krest hücrelerinden elde edilen bol ADSC elde etmek için kullanılabilir.Genç farelerin kullanılması ve kedotery ve indüklenen adipogenez deneyimine sahip olmak, 3T3 hücrelerinin bu protokolün başarısı için çok önemli olduğu anlamına gelir. Prosedürü gösteren Yiding Qi, bir yüksek lisans öğrencisi ve Lian Xu, benim laboratuvar bir teknisyen olacaktır. PAAT diseksiyonu için, fare leşini beş dakika boyunca %75 etanolle sterilize ettikten sonra, karnındaki deriyi ayırmak ve ayırmak için makas kullanın.Leğen kemiğinden boyuna kadar ventral orta hat boyunca kesin ve karın açın. Diyafram ortaya çıkarmak için karaciğer hareket ettirin, ve orta hattın her iki tarafında diyafram ve kaburga kesti. Kalbi ve akciğerleri ortaya çıkarmak için kaburgaları soyun.Akciğerleri ve timusu da çıkar. Bir petri kabıiçine aort ve kalp ile birlikte PAAT ayıklayın. Ve kalbi çıkarmak için aort kökündeki aortu kesin.Sonra, aort kemer ve alçalan aort arasında bir kesim yapmak. Dikkatle her iki yapıçevreleyen yağ dokusu ayırmak, ve arka göğüs duvarından sol ve sağ ortak karotis arterler. Bu kökten PAAT ayırmak için önemlidir ve daha büyük bir vasküler damarlar dikkatle olarak, vasküler duvar hücrelerinin varlığı FACS verimliliğini etkileyebilir.Buz soğuk HBSS tampon içeren bir petri kabına doku yerleştirin. Ve mümkün olduğunca vaskülatür ve fasya kadar kaldırmak için steril forceps kullanın. Daha sonra, iki mililitre Eppendorf tüp içine yağ dokusu aktarın, buz üzerinde buz soğuk HBSS tampon noktası beş mililitre içeren.Tüm PAAT toplandığında, hasat edilen yağ dokusunu bir mililitre taze hazırlanmış sindirim ortamı içeren yeni bir iki mililitrelik mikro santrifüj tüpüne aktarın. Ve dokuları kıymak için cerrahi makas kullanın. Doku bulamacını dokuz mililitre taze sindirim ortamı içeren 50 milimetrelik bir tüpe aktarın.Ve dokuları 10 kez triturate için bir mililitrelik pipet kullanın. Homojen bir solüsyon elde edildiğinde, tüpü 30 ila 45 dakika boyunca 37 santigrat derecede ve dakikada 100 devirde kuluçkaya yatırın ve aşırı hazımsızlığı önlemek için her 5 ila 10 dakikada bir kontrol edin. Açık sarı homojen bir yağ dokusu çözeltisi tüpün hafif girdap üzerine gözlenebilir zaman, HDMEM beş mililitre ile sindirimi durdurmak 10% fetal sığır serum uymaktadır.Iyice karıştırıldıktan sonra, yağ dokusu örneğini santrifüj edin. Stromal vasküler hücre fraksiyonu kahverengimsi bir pelet olarak görünür olacaktır. Peleti 10 mililitre kültür ortamında yeniden askıya alın ve hücre süspansiyonuna 70 mikrometrelik bir süzgeçten filtre uygulayın.Başka bir santrifüj ile hücreleri toplamak. Ve yavaşça eritrositler lysis tampon beş mililitre pelet yeniden askıya. Süspansiyonu 15 mililitrelik bir tüpe aktarın.10 dakika sonra, PBS 10 mililitre iki santrifüjler ile reaksiyonu durdurmak, 1% fetal sığır serumu ile takviye. İkinci santrifüjden sonra, buzun üzerinde beş mililitre lik kültür ortamı içinde peleti yeniden askıya alın. Ve hücreleri son bir santrifüjle toplayın.Daha sonra, saymak için FACS arabelleği beş mililitre hücreleri yeniden askıya. Bir NCADSC kültürü kurmak için, standart protokollere göre FACS tarafından izolasyon sonra, her bir kuyu, on iki kuyu kültür plakası santimetre kare konsantrasyonu için üçüncü hücrelere beş kez 10 hücreleri yerleştirin. 37 santigrat derece ve 20 ila 24 saat için% 5 karbondioksit eksik kültür orta.Ertesi gün, hücreleri 37 santigrat derece PBS ile yıkayın ve taze kültür ortamı ile kültürü besleyin. Kültür %80 ila %90 biraraya geldiğinde, hücreleri 37 santigrat derecede üç ila beş dakika boyunca her kuyubaşına %0,25 tripsin EDTA'nın iki mililitresiyle tedavi edin. Hücreler plakanın altından ayrıldığında, iki mililitre kültürlü ortam ile enzimleri nötralize edin ve hasat edilen hücreleri santrifüj le toplayın.Yeniden saymak için taze kültür ortamı bir mililitre pelet askıya. Ve hücreleri yeni bir 12 kuyu kültür plakası içinde beş kez 10 santimetre kare konsantrasyon üçüncü hücrelere tohum. Daha sonra, sıvı azot dondurulmuş depolama için% 10 dimetil sülfoksit ile desteklenen kültür orta kalan hücreleri yeniden askıya.Adipojenik farklılaşmayı tetiklemek için, hücreler %80-90 bir araya geldiğinde, hücreleri kahverengi veya beyaz adipojenik indüksiyon ortamıile iki gün boyunca uygun şekilde tedavi edin. Kuluçka sonunda, hücreleri pbs ile iki kez yıkayın ve her kuyuya uygun taze adipojenik indüksiyon ortamını eklemeden ve hücreleri üç ila beş günlük ek kuluçka için hücre kültürü kuluçka makinesine geri döndürün. Kültürlü NCADSCs kültür yedi ila sekiz gün sonra% 80-90 bir araya ulaşmak.Ve morfoloji gibi genişletilmiş bir fiberglas göstermek. Daha fazla adipojenik potansiyelini doğrulamak için, farklılaşmış NCADSCs yağ kırmızı boyama olgun adipositler tespit etmek için yapılabilir. Tipik olarak, olgun adipositler adipojenik farklılaşma gösteren NCADSCs üzerinde% 60 ile beyaz veya kahverengi adipojenik indüksiyon sekiz gün sonra gözlenir.NCADSC'lerin geçtikten sonra büyük ölçüde azaltılmış bir adipojenik potansiyel gösterdiğini unutmayın. İmmünoblotve kantitatif gerçek zamanlı PCR, sekiz günlük beyaz adipojenik indüksiyondan sonra adipojenik diferansiyek diferansiyek sikanlı NCADSC'lerde adipositspesifik spesifik protein ve genlerin ekspresyonunun önemli ölçüde arttığını ortaya koymaktadır. Benzer şekilde, adiposit spesifik genlerin ekspresyonu ve kahverengi adiposit spesifik genler de kahverengi adipojenik indüksiyon sekiz gün sonra önemli ölçüde artar.Çoğu NCADSC izolasyon protokolü basit, ekonomik olduğundan ve antikor kullanımını gerektirmediğinden, ifp'nin güçlü sıvı nedenlerinin yoğunluğu FACS beslenme verimliliğini artırabilir.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Isolation and Enrichment of Human Adipose-derived Stromal Cells for Enhanced Osteogenesis

İzolasyon ve İnsan zenginleştirilmesi Gelişmiş Osteogenezi için Stromal Hücreleri adipoz-türevi

Bone marrow-derived mesenchymal stromal cells (BM-MSCs) are considered the gold standard for stem cell-based tissue engineering applications. However, the ...

Direct Induction of Human Neural Stem Cells from Peripheral Blood Hematopoietic Progenitor Cells

Periferik kan Hematopoetik Progenitör Hücreleri İnsan Sinir Kök Hücre Doğrudan İndüksiyon

Human disease specific neuronal cultures are essential for generating in vitro models for human neurological diseases. However, the lack of access to ...

Culturing Human Pluripotent and Neural Stem Cells in an Enclosed Cell Culture System for Basic and Preclinical Research

Temel ve Klinik öncesi Araştırma bir Kapalı Hücre Kültürü Sistemi İnsan Pluripotent ve Sinir Kök Hücre Kültürleme

This paper describes how to use a custom manufactured, commercially available enclosed cell culture system for basic and preclinical research. Biosafety ...

Isolation and Differentiation of Adipose-Derived Stem Cells from Porcine Subcutaneous Adipose Tissues

Domuz Subkutan yağ dokularındaki İzolasyonu ve Yağ-Türetilmiş Kök Hücre Farklılaşması

Obesity is an unconstrained worldwide epidemic. Unraveling molecular controls in adipose tissue development holds promise to treat obesity or diabetes. ...

Immunomagnetic Separation of Fat Depot-specific Sca1high Adipose-derived Stem Cells (ASCs)

Immunomagnetic Separation of Fat Depot-specific Sca1high Adipose-derived Stem Cells ASCs

Yağ Deposu özgü SCA1 ve İmmunomanyetik Ayırma<sup&gt; yüksek</sup&gt; Yağ türetilmiş Kök Hücreler (TSK)

The isolation of adipose-derived stem cells (ASCs) is an important method in the field of adipose tissue biology, adipogenesis, and extracellular matrix ...

Isolation and Expansion of Mesenchymal Stem/Stromal Cells Derived from Human Placenta Tissue

İnsan Plasenta Doku türetilen İzolasyon ve mezenkimal kök Genişleme / Stromal hücreler

Mesenchymal stem/stromal cells (MSC) are promising candidates for use in cell-based therapies. In most cases, therapeutic response appears to be cell-dose ...

Large-Scale Production of Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells Using a Highly Reproducible Small Molecule-Based Differentiation Protocol

Oldukça Tekrarlanabilir Küçük Molekül Tabanlı Farklılaşma Protokolü kullanarak insan pluripotent kök hücreleri gelen kardiyomiyositlerde Büyük Ölçekli Üretim

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust ...

Chondrogenic Differentiation Induction of Adipose-derived Stem Cells by Centrifugal Gravity

Santrifüj Yerçekimi ile adipoz kaynaklı Kök Hücrelerin kondrojenik Farklılaşma İndüksiyon

Impaired cartilage cannot heal naturally. Currently, the most advanced therapy for defects in cartilage is the transplantation of chondrocytes ...

Rapid Isolation of BMPR-IB+ Adipose-Derived Stromal Cells for Use in a Calvarial Defect Healing Model

BMPR-IB + hızlı İzolasyon Kalvaryum Hata Şifa Modeli Kullanılan Stromal Hücreleri yağ kaynaklı

Invasive cancers, major injuries, and infection can cause bone defects that are too large to be reconstructed with preexisting bone from the patient's own ...

In Vivo Tracking of Human Adipose-derived Mesenchymal Stem Cells in a Rat Knee Osteoarthritis Model with Fluorescent Lipophilic Membrane Dye

In Vivo Tracking of Human Adipose-derived Mesenchymal Stem Cells in a Rat Knee Osteoarthritis Model with Fluorescent Lipophilic Membrane Dye

Vivo İnsan yağ elde edilen Mezenkimal kök hücrelerin sıçan diz osteoartrit modelinde floresan lipofilik membran boya ile izleme

In order to support the clinical application of human adipose-derived mesenchymal stem cell (haMSC) therapy for knee osteoarthritis (KOA), we examined the ...