Name: analyzing the permeability of the blood-brain barrier by microbial traversal through microvascular endothelial cells
Uploaded: 2020-02-14T12:30:00
Duration: 6 min 26 s
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作者承认Maryam Hussain博士以前对这种方法所做的工作，即PD博士Kerstin Danker博士（柏林查里特-大学）为THBMEC和朱利安·韦伯提供批判性阅读手稿。这项研究得到了RTK 2155（宣传）的支持。

1. 制备缓冲液和试剂
<ol><li>在1L玻璃瓶中加入1L双蒸馏H2O中的1L玻璃瓶中，加入10克氯化钠（NaCl）、2克氯化钾（KCl）、14.4克磷酸二氢二水合酸钠（Na2HPO4 + 2H2O）和2克磷酸钾（KH2PO4），制备10倍磷酸盐缓冲盐（10x PBS）。 高压灭菌10xPBS溶液，在900 mL的双蒸馏水中稀释100 mL，以获得1x PBS。<ol>
<li>使用高压灭菌器对溶液进行灭菌。将玻璃瓶放入篮中，合上盖子，在 121 °C 和 98.9 kPa 下消毒 15 分钟。 注：此协议始终用于进一步步骤中的高压灭菌解决方案。</li>
	</ol>
</li>
	<li>通过稀释 0.5 mg/mL 纤维素溶液和 0.3 mg/mL 胶原蛋白 IV 溶液，在 1.5 mL 微管中分别使用 1x PBS 至 100 mg/μL 等分，制备 10 μg/mL 胶原蛋白 IV 和 10 μg/mL 纤维素溶液。此后，将两种等分的100μL与1，800μL的1x PBS混合在2 mL微管中，并将其储存在-20°C。</li>
	<li>通过在培养基中加入4%的胎儿牛血清和2 mM L-谷氨酰胺和100毫克/L青霉素/链霉素，制备DMEM/F-12培养基，并将其储存在4°C。</li>
	<li>在 50 mL 管中稀释 45 mL 的 1x PBS 的 10x 浓缩胰蛋白酶-EDTA 溶液的 5 mL，制备 1x 胰蛋白酶-EDTA 溶液并将其储存在 4°C。</li>
	<li>在 500 mL 玻璃瓶中称量 10 g LB 肉汤底座，制备 500 mL LB 介质。加入500 mL的消毒水，并高压灭菌。</li>
	<li>在 500 mL 玻璃瓶中称量 10 g LB 肉汤底座和 7.5 g 的琼脂，准备 LB 琼脂。在高压灭菌前加入500 mL的消毒水，不要关闭烧瓶盖。高压灭菌器，让溶液冷却，直到接触时温暖。</li>
	<li>通过在 DMEM/F-12 介质中加入 4% 的胎儿牛血清和 2 mM L-谷氨酰胺，但不含青霉素/链霉素，并将其储存在 4°C，如步骤 1.3 中一样，制备无抗生素培养基。</li>
</ol>2. 血脑屏障模拟细胞的生长
<ol><li>要组装 12 孔板，请将细胞培养物插入孔中（图2A）。<ol>
<li>将板和每个刀片解压在生物安全柜中，并在那里执行进一步步骤。使用消毒钳抓住刀片在其宽基上移动它。</li>
	</ol>
</li>
	<li>用90μL的10微克/mL胶原蛋白IV和10μg/mL纤维蛋白混合物覆盖每个刀片的多孔膜。在细胞培养箱中孵育12孔板24小时，在37°C下孵化（图2B）。</li>
	<li>将 1 mL 的 1x PBS 移入每个刀片，然后用真空泵吸出溶液，用于细胞培养，将刀片洗涤两次。</li>
	<li>通过在上部移液 0.5 mL 的预预热 DMEM/F-12 介质和下腔室的 1.5 mL 来平衡膜。在具有5%CO2大气的细胞培养箱中，在37°C下孵育板30分钟（图2C）。</li>
	<li>种子2 x 105人类微血管内皮细胞进入每个上腔，并在细胞培养箱中以37°C孵育12孔板（图2D）。<ol>
<li>使用真空泵从细胞培养液中吸出培养基，然后通过移液 10 mL 的 1x PBS 清洗单层，然后用真空泵对溶液进行吸气。</li>
		<li>将溶液的5 mL移液液液移入细胞培养瓶，用1x浓缩胰蛋白酶-EDTA完全覆盖细胞。在细胞培养箱中37°C下孵育烧瓶3-5分钟。 注：如果细胞未分离，请用力将烧瓶敲打手掌，以清除细胞。</li>
		<li>在15 mL管中，将5mL与移液器作为电池悬浮液的等分，并加入5 mL的含FCS介质，以阻止酶反应。</li>
		<li>在 210 x g下将悬浮液离心 3 分钟，用真空泵去除上清液，用移液器将颗粒重新悬浮在 5 mL 的介质中。</li>
		<li>将细胞悬浮液的10μL与10μL的0.4%锥蓝色染色剂混合在1.5 mL微管中，使用细胞计数器。将10μL的混合物加入计数室滑块，放入细胞计数器，然后开始计数。<ol>
<li>将计数器聚焦在单元格上，使其边缘为深蓝色和中间白色。之后，启动适当的细胞计数程序。</li>
		</ol>
</li>
		<li>要计算每个刀片的体积，请将每刀片获得的 2 x 105个单元格与细胞悬浮液的计算浓度分开。</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 血脑屏障模型的培养
<ol><li>在37°C下孵育12孔板14天。</li>
	<li>上腔室的介质更换 0.5 mL，下腔介质每 2-3 天更换 1.5 mL。在将介质放入电池瓶之前，请将其加热。真空泵吸气 （图 2E）。 注：小心工作，避免接触膜。</li>
	<li>通过显微镜成像细胞，检查细胞的状态，并确定汇合。确保14天后汇合度为100%。</li>
</ol>4. 细菌的制备
<ol><li>测量前一天，将大肠杆菌菌株的菌群化为LB介质。在37°C下孵育培养管24小时，在孵育摇床中孵育180rpm（图2F）。<ol>
<li>在 4°C 的 LB 琼脂板上培养大肠杆菌菌株。取一个带消毒的采摘管，并将采摘放入具有 3 mL LB 介质的制备培养管中。</li>
		<li>为每个刀片准备一个 LB 琼脂板，并填充培养皿，将其总体积减半。让他们变成固体，并存储在4°C。</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. 细胞治疗
<ol><li>播种后的第14天，用化合物处理细胞或测量转皮电阻（TEER），如果计划（图2G）。 注： 始终有一些未经处理的细胞作为控件。<ol>
<li>要用感兴趣的化合物处理细胞，将该化合物稀释到DMEM/F-12介质中的最终浓度。将0.5 mL的混合物加入上腔室，将1.5 mL添加到下腔。在细胞培养箱中孵育所需的时间。</li>
	</ol>
</li>
	<li>之后，通过真空泵吸气和移液，用无抗生素介质交换完整的介质（图2H）。</li>
</ol>6. 渗透性测量
<ol><li>要获得恒定浓度的细菌，使用波长为 600 nm 的光度计测量光学密度。在 50 mL 猎鹰管中用 LB 培养基将细菌的隔夜溶液稀释到 OD600 0.5 ± 0.05。在冰上工作。<ol>
<li>将 1 mL 的 LB 介质填充到比色皿中。启动光度计，将比色皿放入，标记的一侧向前。按底部"空白"以测量空白值之后。</li>
		<li>通过将细菌溶液填充到比色皿中，放入，并按压底部样品，测量细菌溶液的密度。在稀释过程中重复测量，直到获得最终浓度。</li>
	</ol>
</li>
	<li>在生物安全柜中工作，在 OD600 = 0.5 处，可以使用准备好的 12 孔板和细菌溶液处理细菌。将450μL的细菌溶液只加入每个含有0.5 mL的介质的上腔（图2I）。</li>
	<li>在培养箱中孵育12孔板6小时，温度为37°C。 注： 协议要求在此处暂停。</li>
	<li>用移液器从每个下腔室取出带钳子的刀片，将介质的 50 μL 采样（图 2J）。小心不要将介质从上部腔泄漏到下腔。</li>
	<li>将每个样品放在单独的琼脂板上（图2K）。将样品掉落在板上，用细胞扩张器条纹溶液。</li>
	<li>在孵化器中，在37°C下孵育琼脂板24小时。</li>
	<li>计算每个板中的菌落（图 2L）。</li>
</ol>7. 分析数据
<ol><li>将数据写在表中，并计算已观察到的已处理和未经处理的细胞群的平均值和标准偏差。</li>
	<li>将平均值显示为菌落的绝对数量。<ol>
<li>要使结果规范化，通过将所有结果与控制值分开来计算菌落的相对数量。</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60692/60692fig2a.jpg"> 图 2：协议中各个步骤的详细演示。（A） 将带消毒钳子的刀片放入 12 孔板中。（B） 用90μL的纤维素和胶原蛋白IV混合物覆盖每个插入物，孵育24小时（C）用预热培养基将膜模平衡30分钟（D）种子2 x 105人脑微血管内皮细胞。（E） 在适当的时间内培育盘子.（F） 测量前一天，将大肠杆菌菌群放入LB培养管中，孵育24小时（G）处理细胞或测量TEER。（H） 用无抗生素的培养基交换完整的介质。（I） 将450 μL的细菌溶液（OD600 + 0.5）加入每个上腔，孵育6小时（J）样品50μL的介质，从每个下腔取出带钳子的刀片。（K） 在琼脂板上将样品板板，孵育24小时 （L） 计数菌落并分析数据.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60692/60692fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的较大版本。</a>

作者没有什么可透露的。

对微生物横行的发病机制的深入了解限制了POD或脑膜炎疗法的进一步发展。这些疾病的死亡率和发病率要求更好的患者治疗，需要研究潜在的机制，并且需要一个强大的化合物筛查平台。多因素事件可以研究与人类BMECs。几个成功的BMECs分离程序从一些物种显示细胞的特性分子特征52，53损失。在这个过程中描述的THBMECs在非常早期的通道中转染，在那里他们表现出特定的脑内皮细胞特征，并保存了43。这一点很重要，因为到目前为止，还没有发现受影响路径中的所有步骤，而且此模型似乎模仿了传统的 BMEC。我们提出的模型显示了对BMEC和通过BBB的微生物遍历的直接影响。
THBMEC细胞的处理非常简单，大多数生命科学实验室都拥有所需的技术设备。我们的模型允许在 THBMEC 建立紧密的单层后立即开始调查程序。由于新测试与传统方法（如 TEER 测量或带示踪剂标记54）之间的可能组合，因此应用领域可能广泛。也可以添加星形细胞或圆细胞，以构成共体或三元培养模型。药物对微生物横行体的影响也可以在我们的模型中测试，在用细菌接种上腔之前用化合物处理THBMECs。事实上，可以购买带96孔板过滤器的刀片，使程序自动化。这可促进实施高通量药物筛选系统，以加速发现针对上述疾病的药物，并减少药物开发过程中对BBB的副作用。
所呈现方法的一个关键步骤是将细菌添加到上腔后孵育时间。在协议中使用小时作为时间线很重要，因为大肠杆菌的生成时间只有20分钟55小时。否则，使用不同的时间点可能会导致误导性结果。如果不小心处理板，在细菌暴露期间，上腔和下腔之间也可能存在污染风险。此时对 12 个井板的任何更改都可能污染下腔室中的介质。
大肠杆菌是细菌性脑膜炎的一个众所周知、非常常见的病因。进一步的研究应测试与脑膜炎相关的不同细菌，如脑膜炎脑膜炎56或肺炎链球菌57。这些似乎使用不同的机制跨越BBB，需要更好地了解患者的治疗。在老年患者中，POD的发病率增加26，以及发生合并症的数量。众所周知，不同的疾病之间有相互作用，尤其是像糖尿病这样的系统性疾病。在我们的模型中，可以在添加细菌之前模拟这些条件或治疗细胞。
该模型受到THBMECs和细菌直接接触的限制，需要进一步研究，以研究潜在的接触机制，以检测所涉及的途径和蛋白质。但是，可以取出插入物并收集细胞以进行进一步分析。与干细胞模型38、39、40相比，该模型的TEER较低。我们通过使用6小时后未在未处理的细胞中穿过BBB的细菌浓度来证实这一点。
总之，这种方法是一个强大的平台，用于分析细菌通过BBB的遍历，并有可能扩展它进行高通量药物筛选。

人类BBB是脑组织的独特边界，将大脑与血液分离。它严格调节较大和亲水分子的通过，阻止副细胞扩散，并保持大脑平衡。它还保护大脑免受血浆波动、毒素、微生物的侵害，并引导炎症细胞作为中枢神经系统（CNS）免疫的一部分。自一个世纪前发现以来，已经进行了大量研究，以了解BBB的结构和功能。细胞、蛋白质和来自大脑和血液的信号的复杂相互作用需要进一步的调查和模型。
人类BBB由三种细胞类型组成：脑微血管内皮细胞（BMECs）、围细胞和星形细胞2、3。BMECs与体内大多数内皮细胞的不同之处在于，它们具有大量紧密结和附着4，低细胞活性2，5，和连续的基底膜6，7，以阻止准细胞扩散。小亲脂分子可以扩散并通过BBB跟随其浓度梯度;较大和亲水分子进入或离开大脑只能通过极化表达选择性运输系统8。此调节导致高跨端电阻 （TEER） 为 1，500-2，000 μcm2，与渗透性9、10成成反比相关。虽然BMEC建立一个严密的屏障，他们可以对本地和外围信号11，12作出反应。BMEC和星形细胞13之间有着密切的相互作用;星形细胞端脚在容器周围形成一层，并诱导形成紧密的交汇点13，14。它们参与BBB成熟与不同的因素，包括转换生长因子-+（TGF-+）15，16。此外，围细胞在调节血管生成17和防止细胞分化中内皮细胞凋亡方面起着关键作用（图1）。它们嵌入在基底膜中，提供容器壁19的结构稳定性。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60692/60692fig1.jpg"> 图1：血脑屏障的原理结构。人BBB的独特结构由三种不同的细胞类型组成。微容器流明被内皮细胞包围，这些细胞在紧密的结中富集，并且不被隔离。它们嵌入在地下室膜中，就像围周。这些细胞对血管壁的结构稳定性非常重要，并在星形细胞旁边的BBB的发展中发挥作用。它们的末端脚在容器周围建立一个紧密的层，并支持建立紧密的交汇点。BBB 的所有组件对生理功能都很重要。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60692/60692fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的较大版本。</a>
许多不同的病理与BBB的崩溃有关（例如，败血性脑病）。受影响的患者在脑脊液20中增加了蛋白质水平，受影响啮齿动物的脑气肿显示，有标记的胶体氧化铁和氨基酸21、22的摄入量增加。这些结果表明BBB的渗透性增加，与BMECs21和内皮活化23中的皮质增多一起发生。与BBB改变相关的另一个相关病理学是脑膜炎、医疗紧急情况和伴有脑水肿的复杂炎症，可导致神经元细胞死亡。循环细菌的主要进入点应该是微容器24;然而，BBB防止细菌进入。BBB的渗透性并不总是与实验性血性脑膜炎25的增加有关，其机制可以是多因素的。脓毒症与术后精神错乱（POD）26和与术前感染的关联27，28表明需要一个BBB模型，使直接接触细菌，以更好地了解细菌发病机制。
在理解和量化通过BBB的微生物遍历方面存在着许多差距。因此，我们开发了一个模型，允许对不同因素和条件进行方便的测试，其中细菌遍历与对BBB渗透性的影响直接相关。以前的工作侧重于副细胞渗透性，包括TEER测量和示踪通量。此外，通过结合分子或抗体分析大分子传输，从而开发仅使用内皮细胞或与星形细胞和围细胞组合的不同模型。由于难以定期获得人体组织，许多动物模型被使用。牛和猪源的大脑内皮细胞形成紧密的单层，具有高TEER，形成形状良好的锥基极性，适合研究通过BBB的小分子传输。这些蛋白质的序列与人类同源体29、30的序列不同，使得治疗抗体研究变得困难。因此，鼠或人类文化模型可能更可取。老鼠或大鼠作为样本来源，其优点是从特征良好的物种中获得，但用于研究目的的细胞很少。这可以通过使用不朽的小鼠脑内皮瘤（END）细胞系bEND.3，bEND.5或cEND31，32，33来规避。
人体组织的主要培养细胞很难获得，难以定期处理。因此，用于研究人类BBB的研究的大多数人类细胞模型都是不朽的内皮细胞系。已公布的细胞系是人脑脑微血管内皮细胞系hCMEC/D3，非常适合研究药物吸收，易于处理。细胞建立单层并表达BBB34的特性紧密结蛋白，而Claudin-5的表达水平报告低于完整的微血管35，许多特定的传输者在转录水平36和蛋白质组学研究中被检测到。在 30-50 μcm2范围内相对较低的 TEER 仍然是一个挑战37。脑内皮细胞的另一个来源是人多能干细胞（hPSCs）38和人类脐带血源干细胞的循环内皮祖细胞和造血谱系39，40。两种分化协议都会产生紧密的细胞单层和高TEER值（例如，共培养中1，450 μcm 2）38。这些干细胞模型需要极度的培养，但提供了研究调节激素41或遗传背景42疾病对BBB发展的影响的机会。
在这项研究中，我们建立了不朽的转染人脑微血管内皮细胞系THBMEC43，以模拟BBB和研究细菌横行。细胞在过滤器上播种，并在此细胞培养模型中增长到100%的汇合。细菌在细胞培养室的上部接种。我们的样本研究中使用大肠杆菌（大肠杆菌），因为大肠杆菌脑膜炎的发病率很高。已经表明，细胞单层的最低渗透率发生在播种45天之后的第13天和第15天之间。因此，在此时间之后对THBMEC单层进行治疗，随后在单层表面的介质中接种细菌。在孵育时间之后，能够穿过屏障的细菌通过电镀介质与琼脂板上的细菌一起量化，并计算菌落。菌落数量的增加与通过BBB的细菌横贯性较高相关。TEER 约为 70 μcm246。但是，在描述的方法中不必测量 TEER。虽然它对BBB的渗透性有一个既定的价值，但它似乎对细菌通过BBB的遍历没有影响。未经处理的细胞在我们的模型中可以控制紧绷性。它已经表明，在以前的工作，细胞能够对亲炎细胞因子作出反应，并表达典型的紧密结蛋白47。这允许对更大的运输基板和受体进行化合物筛选和验证。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agar - Agar</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>6494.3</td>
			<td>BioScience-Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclave</td>
			<td>Systec</td>
			<td>VX-150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacteria E.coli strain GM2163</td>
			<td>Fermentas Life Sciences, Lithuania</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photometer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>6131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cells THBMEC</td>
			<td>Group of M. F. Stins</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture flasks</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>658175</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Universal 320</td>
			<td>Hettrichlab</td>
			<td>1401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen IV</td>
			<td>SIGMA Aldrich</td>
			<td>C6745</td>
			<td>from human cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess Automated Cell Counter with cell counting chamber slides and Trypan Blue stain 0.4%</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C10311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture tubes</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>191180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cuvettes</td>
			<td>BRAND</td>
			<td>759015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Di sodium hydrogen phosphate di hydrate</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>1065800500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12</td>
			<td>GIBCO/ Thermo Sc.</td>
			<td>11330032</td>
			<td>HEPES</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tubes 15 ml</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>188271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tubes 50 ml</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>227261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>GIBCO/ Thermo Sc.</td>
			<td>10270</td>
			<td>value FBS -Brazil</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>SIGMA Aldrich</td>
			<td>F0556</td>
			<td>solution human fibroblasts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heracell 150 CO2 Incubator</td>
			<td>Heraeus</td>
			<td>50116047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator shaker I 26 New Brunswick</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>M1324-0000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inoculation loop</td>
			<td>Dr. Ilona Schubert - Laborfachhandel</td>
			<td>641000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth Base</td>
			<td>GIBCO/ Thermo Sc.</td>
			<td>12780029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>GIBCO/ Thermo Sc.</td>
			<td>25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microbial incubator B 6200</td>
			<td>Heraeus</td>
			<td>51015192</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microbiological Safety Cabinet AURA 2000 M.A.C. Class II</td>
			<td>BIOAIR</td>
			<td>12469</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope inverse</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>TELAVAL 31</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro tubes 2 ml</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>72,695,400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro tubes 1,5 ml</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>72,706,400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin / Streptomycin</td>
			<td>GIBCO/ Thermo Sc.</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Dr. Ilona Schubert - Laborfachhandel</td>
			<td>464-800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Roth</td>
			<td>HN02.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium-di-hydrogen phosphate</td>
			<td>Roth</td>
			<td>P018.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Roth</td>
			<td>9265.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThinCerts + Multiwell Plates</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>665631</td>
			<td>12 well, pore size 3.0 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin - EDTA</td>
			<td>GIBCO/ Thermo Sc.</td>
			<td>15400054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuumpump Laboport</td>
			<td>KNF</td>
			<td>N 86 KT.18</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analyzing the permeability of the blood-brain barrier by microbial traversal through microvascular endothelial cells

人类血脑屏障（BBB）的特点是生物分子的渗透性非常低，以保护和调节大脑的新陈代谢。BBB主要由嵌入胶原蛋白IV和富含纤维蛋白的基底膜的内皮细胞形成。一些疾病是由BBB功能障碍引起的，然后是微生物横行，导致脑膜炎等疾病。为了测试多种参数（包括不同药物和麻醉剂）对BBB渗透性的影响，我们建立了一种新的人细胞培养模型，模拟BBB与人脑微血管内皮细胞。内皮细胞生长在胶原蛋白IV和纤维蛋白涂层过滤单元，直到汇合，然后可以处理不同的感兴趣的化合物。为了证明微生物的横行，内皮细胞的上腔表面用细菌接种。潜伏期后，下腔的样品在琼脂板上镀，并计算获得的菌落，从而将菌落数量与BBB的渗透性相关。内源性细胞因子可以分析在这个实验设置，以阐明促进BBB的内皮细胞的基本细胞机制。此外，该平台允许对可能影响内皮细胞渗透性的化合物执行屏幕。最后，可以研究细菌横行，并将其与不同的病理联系起来，如脑膜炎。有可能扩展模型并分析细菌通过BBB的通路。在本文中，我们提供了描述的方法的详细协议，以研究BBB的渗透性。

按照协议，对细胞进行种子设定，并构建 BBB 模型。在播种后的第14天，细胞被处理与甘油作为反应性醛。实验的目的是调查POD27的年龄与糖尿病与48岁老年患者脑膜炎高发率之间的相关性。老年和糖尿病49中高级糖化最终产物（AGEs）水平的增加，需要进一步检查糖化在通过BBB的微生物横行的发病机制中的影响。糖化是一种自由氨基酸组在蛋白质中的非酶反应，碳基组减少碳水化合物或其他碳基化合物。葡萄糖是众所周知的碳基基组捐赠者;然而，有更多的反应性知道。建立不稳定的希夫基地后，他们重新排列到更稳定、反应性更基的二碳化合物，如甘草。AGEs，最终产品，可以引起蛋白质50之间的交叉联系。它们可以通过与AGEs（RAGE）51的受体相互作用来破坏细胞结构并改变细胞功能。
细胞用0.05和0.15 mM glyoxal （GO） 溶液治疗1小时，未经处理的细胞作为对照。糖化是通过免疫凝固和检测与抗AGE抗体检测（图3）。所得细菌菌落被计算并表示为菌落的绝对数量（图4A）或归化为对照的菌落的相对数量（图4B）。从未处理细胞的井中取的介质形成很少的菌落。这一结果表明，未经治疗的细胞能够建立屏障，并可以作为一种控制。用乳酸酶处理的样本显示菌落数量增加，从而得出结论，即甘草对THBMECs和细胞屏障密度有影响，因为菌落的数量表明未经处理的细胞和经过处理的细胞之间存在显著差异。使用glyoxal治疗后，细菌对屏障的交叉增加可以解释为什么糖尿病与BBB分解的疾病相关。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60692/60692fig3a.jpg"> 图3：通过免疫印迹检测蛋白质糖化。用不同浓度的GO处理1小时，使用SDS-PAGE分离总蛋白。使用抗AGE抗体（CML-26）通过免疫印迹检测蛋白质的糖化。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60692/60692fig3alarge.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的较大版本。</a>
在不同的环境中，THBMECs的蛋白质糖化是由葡萄糖诱导的。在 DMEM/F-12 介质中加入灭菌葡萄糖，以增加从正常葡萄糖介质 （NG） 的葡萄糖浓度（NG），从 17.5 mM 添加到高葡萄糖介质 （HG） 42.5 mM。THBMECs在两种不同的细胞培养瓶中培养：一种在正常葡萄糖（NG）培养基中，另一种在高葡萄糖（HG）培养基。这两种不同的介质也用于12个孔板中的BBB过滤器的生长。在NG培养的细胞作为一种控制。获得的菌落表示为绝对菌落数（图4C）或归化为对照的菌落的相对数量（图4D）。结果表明，对细菌通过人体BBB的遍历没有显著影响，因此得出结论，NG与HG的影响不够严重，不足以影响BBB的完整性。不同的场景被设计用来证明模拟BBB的细胞的模型和完整性。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60692/60692fig4d.jpg"> 图4：使用THBMECs的BBB模型中计数细菌菌落的绝对数和相对数。泰布细胞用0.15 mM GO治疗1小时，未经治疗的细胞作为对照。在每个上腔室中共添加450μL的大肠杆菌悬浮液（OD600 = 0.5）。从下腔的介质在6小时（A）后在琼脂板上镀。（B） 该图显示归化为未处理细胞的计数菌落，作为控制 +/- SEM （n = 4）。在 （C） 和 （D） 中 ， THBMEC 在 NG 和 HG 介质中培养.在每个上腔室中共添加450μL的大肠杆菌悬浮液（OD600 = 0.5）。从下腔中，在6小时（C）后在琼脂板上镀上， 图表显示计数菌落的平均平均值 +/- SEM.（D） 该图显示归化为未处理细胞的计数菌落，作为控制 +/- SEM （n = 3）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60692/60692fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的较大版本。</a>

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Analyzing the Permeability of the Blood-Brain Barrier by Microbial Traversal through Microvascular Endothelial Cells

人类血脑屏障选择性地防止亲水分子和病原体渗透到大脑中。几种疾病，包括脑膜炎和术后精神错乱，与血脑屏障的渗透性增加有关。在这里，我们描述了一个内皮细胞培养模型，以测试通过微生物遍历的屏障渗透性。

微生物通过微血管内皮细胞对血脑屏障渗透性分析

The human blood-brain barrier (BBB) is characterized by a very low permeability for biomolecules in order to protect and regulate the metabolism of the ...

这种方法通过测量不同治疗的细菌遍历，可以分析人类血脑屏障。它可能有助于发现细菌性脑膜炎和术后精神错乱的发病机制。这是一种简单明了的方法，治疗的效果直接表现为细菌的数量。它可以被修改，以便对内皮细胞上的化合物进行高通量分析。首先将 12 井板组装在生物安全柜中。拆开板和每个刀片，然后使用消毒钳抓住其底部的刀片，并把它们放入井中。在每个刀片的多孔膜上涂上90微升，每微升胶原蛋白IV和纤维素混合物10微克，并在37摄氏度的细胞培养箱中孵育板，24小时。孵育后，将一毫升PBS移液到每个刀片中，用真空泵吸气，将刀片洗涤两次。然后通过上下腔中预预热的DMEM F12介质对膜进行平衡，并在37摄氏度和5%的二氧化碳下孵育板。播种人类微血管内皮细胞，从细胞培养瓶中吸出培养的培养，用10毫升PBS清洗细胞。用5毫升的尝试性EDTA完全覆盖细胞，并在37摄氏度下孵育烧瓶3至5分钟。将5毫升细胞转移到15毫升管中，并加入5毫升含有介质的FCS，以停止酶反应。在210倍g下离心3分钟，取出上光，将细胞颗粒重新悬浮在5毫升的介质中。将10微升的细胞悬浮液加入10微升0.4%的尝试蓝色污渍，然后将10微升的混合物加入计数室。将计数室放入单元格计数器，然后启动相应的程序，确保计数器已聚焦。数了之后，种子20万细胞进入12井板的每个上腔，并在37摄氏度下孵育板，每两到三天改变上腔室和下室的介质。14天后，通过显微镜成像，确保细胞汇合度为100%。在渗透性测量前一天，将大肠杆菌菌株 GM2163 放入三毫升 LB 介质中。在37摄氏度的孵化摇床中培养细胞24小时。要用感兴趣的化合物治疗细胞，将其稀释到DMEM F12介质中的最终浓度，并将这种混合物加入12井板的上腔和下腔，然后在细胞培养培养箱中孵育该细胞。孵育后，用无抗生素介质交换完整的介质。通过测量其光学密度在600纳米，然后稀释到50毫升猎鹰管中的0.5的OD600的OD600，确定隔夜细菌培养物的浓度。在生物安全柜中，将450微升的细菌溶液加入12井板的每个上腔，然后在37摄氏度下孵育6小时。孵育后，用钳子取出刀片，并将介质的样品从每个下腔中取出50微升，注意不要将介质从上腔溢出到下室。必须严格区分上下室的介质，因为从上室细菌的溢出会导致误报结果。将每个样品放到单独的加糖板上，用细胞扩散器条纹溶液。在37摄氏度下孵育板24小时，然后计算菌落。为了研究糖化对通过血脑屏障的微生物穿越的影响，细胞用0.5和0.15毫摩尔糖溶液治疗了一个小时，未经处理的细胞作为对照。然后通过免疫印迹与抗年龄抗体检测糖化。获得的细菌菌落被计算为绝对菌落数量或与控制结果正常化的相对菌落数。用甘于一氧化二甲处理的样本显示，菌落数量增加，表明该治疗对细胞屏障密度有一些影响。为了研究葡萄糖诱导蛋白糖化，在正常葡萄糖和高葡萄糖介质中培育了THBMEC。菌落的绝对数量和与对照相对的菌落数量表明，葡萄糖对血脑屏障的完整性没有显著影响。通过蛋白质组学方法（例如质谱法）可以进一步分析经过治疗的内皮细胞，以分析蛋白质组的变化。这种技术有助于理解人类血脑屏障和细菌穿越。它可用于发现衰老和神经退行性疾病的各个方面，如阿尔茨海默病。

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Separation of Single-stranded DNA, Double-stranded DNA and RNA from an Environmental Viral Community Using Hydroxyapatite Chromatography

分离单链DNA，双链DNA和RNA病毒使用羟基磷灰石色谱从环境社区

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科研

免疫与感染

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在细胞命运<em&gt; E.大肠杆菌</em感染后的噬菌体λ

The system comprising bacteriophage (phage) lambda and the bacterium E. coli has long served as a paradigm for cell-fate determination1,2. Following the ...

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Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

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量<em在体外</em&gt;激活的主人微血管内皮细胞在静态条件下测量的检测，以中性粒细胞粘附

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Analyzing the Effects of Stromal Cells on the Recruitment of Leukocytes from Flow

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一个<em&gt;体外</em&gt;血 - 脑屏障使用阻抗谱型号：对T细胞，内皮细胞的相互作用为中心

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Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

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