Name: analyzing the permeability of the blood-brain barrier by microbial traversal through microvascular endothelial cells
Uploaded: 2020-02-14T12:30:00
Duration: 6 min 26 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analyzing the Permeability of the Blood-Brain Barrier by Microbial Traversal through Microvascular Endothelial Cells at JoVE.com

Forfatterne anerkender Dr. Maryam Hussain for tidligere arbejde på denne metode, gruppen af PD Dr. Kerstin Danker (Charité-Universitätsmedizin, Berlin) for at give THBMECs og Juliane Weber for kritisk at læse manuskriptet. Denne undersøgelse blev støttet af RTK 2155 (ProMoAge).

1. Forberedelse af buffer- og reagenser
<ol><li>10x fosfatbuffersaltvand (10x PBS) ved tilsætning af 80 g natriumchlorid (NaCl), 2 g kaliumchlorid (KCl), 14,4 g dinatrium-hydrogen-fosfat-dihydrat (Na2HPO4 · 2H2O) og 2 g kalium-dihydrogen fosfat (KH2PO4)i en 1 L glaskolbe i 1 L dobbelt destilleret H2O. Autoclave 10x PBS opløsning og fortyndet 100 ml af denne opløsning i 900 ml dobbelt destilleret vand for at få 1x PBS.<ol>
<li>Brug autoklaven til at sterilisere opløsninger. Sæt glaskolben i kurven, luk låget og steriliser den i 15 min ved 121 °C og 98,9 kPa. BEMÆRK: Denne protokol bruges altid til autoklaveringløsninger i yderligere trin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Der fremstilles en opløsning på 10 μg/ml kollagen IV og 10 μg/mL fibronectin ved at fortynde 0,5 mg/mL fibronectinopløsning og opløsningen på 0,3 mg/mL kollagen IV hver med 1x PBS til 100 mg/μL aliquoter i 1,5 ml mikrorør. Derefter blandes 100 μL af begge aliquoter med 1.800 μL 1x PBS i 2 ml mikrorør og opbevares ved -20 °C.</li>
	<li>DMEM/F-12 medium klargør ved tilsætning af 4% føtal kvægserum og 2 mM L-glutamin og 100 mg/L penicillin/streptomycin til mediet og opbevares ved 4 °C.</li>
	<li>Forbered 1x trypsin-EDTA løsning ved at fortynde 5 ml af den 10x koncentrerede trypsin-EDTA opløsning med 45 ml 1x PBS i et 50 ml rør og opbevar den ved 4 °C.</li>
	<li>Forbered 500 ml LB medium ved vejning 10 g LB bouillon base i en 500 ml glaskolbe. Tilsæt 500 ml steriliseret vand og autoklave det.</li>
	<li>Forbered LB agar ved vejning 10 g LB bouillon base og 7,5 g agar-agar i en 500 ml glaskolbe. Tilsæt 500 ml steriliseret vand før autoklavering, og kolben må ikke lukkes. Autoklave og lad opløsningen køle af, indtil den er varm at røre ved.</li>
	<li>Der fremstilles antibiotikafrit medium ved at tilsætte 4 % føtal kvægserum og 2 mM L-glutamin, men ingen penicillin/streptomycin til DMEM/F-12-mediet og opbevar det ved 4 °C som i trin 1.3.</li>
</ol>2. Vækst af blod - hjerne Barrier efterligne celler
<ol><li>For at samle de 12 brøndplade, sætte cellekultur skær i brøndene (Figur 2A).<ol>
<li>Pak pladen ud og hver indsats i et biologisk sikkerhedsskab og udfør yderligere trin der. Brug steriliserede pincet til at få fat i indsatsen på sin brede base for at flytte den.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Læg den porøse membran i hvert skær med 90 μL 10 μg/ml kollagen IV og 10 μg/mL fibronectin blanding. Inkuber 12 brøndpladen for 24 timer ved 37 °C i en cellekulturkuvøse (figur 2B).</li>
	<li>Skærne vaskes to gange ved at pipettere 1 ml 1 x PBS i hvert skær og aspirere opløsningen med en vakuumpumpe til cellekulturer.</li>
	<li>Membranerne udjævnser ved at pibe 0,5 ml forvarmet DMEM/F-12 medium i over- og 1,5 ml i underkammeret. Inkuberpladen i 30 min ved 37 °C i en cellekulturkuvøse med 5% CO2-atmosfære (figur 2C).</li>
	<li>Frø 2 x 105 humane mikrovaskulære endotelceller i hvert øvre kammer og inkuberer de 12 brøndpladen ved 37 °C i en cellekulturkuvøse (figur 2D).<ol>
<li>Aspirere mediet fra cellekulturkolben ved hjælp af en vakuumpumpe til cellekulturer og vask monolaget ved at pipettere 10 ml 1x PBS og derefter indsugning af opløsningen med en vakuumpumpe.</li>
		<li>Dæk cellerne helt med 1x koncentreret trypsin-EDTA ved at pipettere 5 ml af opløsningen i cellekulturkolben. Kolben inkuberes i 3-5 min ved 37 °C i en cellekulturkuvøse. BEMÆRK: Hvis cellerne ikke adskilles, skal du trykke på kolben mod håndfladen for at løsne cellerne.</li>
		<li>Tag 5 ml med en pipette som en aliquot fra celleaffjedringen i et 15 ml rør og tilsæt 5 ml af fcs-holdige medium for at stoppe enzymatisk reaktion.</li>
		<li>Centrifugeringen centrifugeres i 3 min ved 210 x g,fjern supernatantet med en vakuumpumpe, og pelleten skal suspenderes igen i 5 ml medium med en pipette.</li>
		<li>Brug celletælleren ved at blande 10 μL af celleaffjedringen med 10 μL 0,4% trypan blå plet i et 1,5 ml mikrorør. Tilsæt 10 μL af blandingen i et tællekammerdias, sæt den i celletælleren, og begynd at tælle.<ol>
<li>Fokuser tælleren på cellerne, så deres kant er mørkeblå og den midterste hvide. Derefter skal du starte det relevante program for celletælling.</li>
		</ol>
</li>
		<li>For at beregne volumenet for hvert skær skal de opnåede 2 x 105 celler fordeles pr. skær med den beregnede koncentration af cellesuspensionen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Dyrkning af blod -hjerne Barrier Model
<ol><li>Inkuber 12 brøndpladen i 14 dage ved 37 °C.</li>
	<li>Skift 0,5 ml medium for det øverste kammer og 1,5 ml medium for den nederste hver 2-3 dage. Varm mediet, før du lægger det i cellekolben. Aspirer med vakuumpumpen (Figur 2E). BEMÆRK: Arbejd forsigtigt for at undgå at røre ved membranen.</li>
	<li>Kontroller cellernes status ved at billeddanne dem med et mikroskop og bestemme sammenløbet. Sørg for, at sammenløbet er 100% efter 14 dage.</li>
</ol>4. Forberedelse af bakterier
<ol><li>En dag før måling, sætte en koloni af E. coli stamme GM2163 i LB medium. Inkubere kulturrøret i 24 timer ved 37 °C med 180 omdrejninger i en inkubationsshaker (figur 2F).<ol>
<li>Dyrke E. coli belastning på en LB agar plade ved 4 °C. Tag en koloni med en steriliseret pick og sætte pick i den forberedte kultur rør med 3 ml LB medium.</li>
		<li>Forbered en LB agar plade til hvert skær med varm LB agar løsning og fyld Petri retter til halvdelen af deres samlede volumen. Lad dem blive faste og opbevar dem ved 4 °C.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Behandling af celler
<ol><li>På dag 14 efter såning, behandle celler med forbindelser eller måle den transendotel elektriske modstand (TEER), hvis det er planlagt (Figur 2G). BEMÆRK: Hav altid nogle ubehandlede celler som kontrolelement.<ol>
<li>Til behandling af celler med renters sammensætning udvandes forbindelsen til den endelige koncentration i DMEM/F-12 medium. Tilsæt 0,5 ml af denne blanding i det øverste kammer og 1,5 ml i underkammeret. Inkuberpladen i en cellekulturkuvøse for den ønskede tid.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Derefter udskiftes hele mediet med antibiotikafrit medium ved at indsugning med vakuumpumpen og pipetteringen (figur 2H).</li>
</ol>6. Måling af permeabilitet
<ol><li>For at få konstante koncentrationer af bakterier, måle den optiske tæthed med et fotometer på en bølgelængde på 600 nm. Den overnattende opløsning af bakterier med LB-medium i et 50 ml falcon rør til en OD600 på 0,5 ± 0,05. Arbejde på is.<ol>
<li>Fyld 1 ml LB-medium i en cuvette. Start fotometeret og sæt cuvetten i, markeret side fremad. Tryk på bunden "Blank" for at måle den tomme værdi bagefter.</li>
		<li>Mål tætheden af bakterieopløsningen ved at fylde den i en cuvette, sætte den i, og trykke på den nederste prøve. Målingen gentages under fortyndingen, indtil den endelige koncentration opnås.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Arbejd i et biologisk sikkerhedsskab, hvor bakterier kan håndteres med den forberedte 12 brøndplade og bakterieopløsning ved OD600 = 0,5. Der tilsættes 450 μL bakterieopløsning kun i hvert øvre kammer, der indeholder 0,5 ml medium (figur 2I).</li>
	<li>Inkuber 12 brøndpladen i 6 timer ved 37 °C i en kuvøse. BEMÆRK: Protokollen dikterer at holde pause her.</li>
	<li>Prøve 50 μL af mediet med en pipette fra hvert underkammer ved at fjerne indsatsen med pincet (figur 2J). Pas på ikke at spilde mediet fra de øverste kamre til de lavere.</li>
	<li>Hver prøve pladen på en separat agarplade (figur 2K). Slip prøven på pladen og stribe ud opløsningen med en celle sprederen.</li>
	<li>Inkuber agarpladerne for 24 timer ved 37 °C i en kuvøse.</li>
	<li>Tæl kolonierne i hver plade (figur 2L).</li>
</ol>7. Analyse af data
<ol><li>Data i en tabel og beregne gennemsnits- og standardafvigelsen for de observerede kolonier af behandlede og ubehandlede celler.</li>
	<li>Vis gennemsnittet som det absolutte antal kolonier.<ol>
<li>For at normalisere resultaterne skal du beregne det relative antal kolonier ved at dividere alle resultater med kontrolværdien.</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60692/60692fig2a.jpg"> Figur 2: Detaljeret præsentation af de enkelte trin i protokollen. (A) Sæt skærmed steriliserede pincet i 12 brøndpladen. B) Coat hver indsats med 90 μL fibronectin og kollagen IV blanding og inkubator i 24 h. (C) Ligevægt membranerne med forvarmet medium i 30 min. (D) Frø 2 x 105 menneskelige hjerne mikrovaskulære endotelceller pr indsætte. E) Opkog pladen i det passende tidsrum. F) En dag før måling, sætte en E. coli koloni i en LB medium kultur rør og inkubator for 24 h. (G) Behandle celler eller måle TEER. (H) Børst komplet medium med antibiotika-fri medium. I) Tilsættes 450 μL bakterieopløsning (OD600 = 0,5) i hvert overkammer og inkubator i 6 timer(J)Prøve 50 μL medium fra hvert underkammer, der fjerner skær med pincet. (K) Plade prøven på agar plader og inkubere for 24 h. (L) Tæl kolonierne og analysere data. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60692/60692fig2large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>

Forfatterne har intet at afsløre.

Begrænset indsigt i patogenesen af mikrobielle traversal grænser yderligere udvikling af behandlinger for POD eller meningitis. Dødeligheden og sygeligheden af disse sygdomme kræver bedre patientbehandling, kræver forskning i de underliggende mekanismer og har brug for en robust platform for sammensat screening. De multifaktorielle hændelser kan studeres med humane BMECs. Flere vellykkede rapporterede isolationsprocedurer for BMEC'er fra en række arter har vist tab af cellernes karakteristiske molekylære signatur52,53. De beskrevne THBMECs i denne procedure blev transfunderet i meget tidlige passager, hvor de udviste specifikke hjerneendotelcelleegenskaber og bevarede dem43. Dette er vigtigt, fordi ikke alle trin i de berørte veje er blevet opdaget hidtil, og denne model synes at efterligne konventionelle BMECs. Vores præsenterede model viser direkte indflydelse på BMECs og den mikrobielle traversal gennem BBB.
Håndteringen af THBMEC-celler er ligetil, og det nødvendige tekniske udstyr findes i de fleste life science laboratorier. Vores model giver mulighed for en øjeblikkelig start på efterforskningsprocedurer efter THBMECs har bygget en stram monolayer. Anvendelsesfeltet kan være omfattende på grund af de mulige kombinationer mellem nye test og konventionelle analyser såsom TEER-måling eller mærkning med sporstoffer54. Det er også muligt at tilføje astrocytter eller pericytter for at lave en co- eller triple-kultur model. Narkotikaens indflydelse på det mikrobielle traversal kunne også testes i vores model ved at behandle THBMECs med forbindelser, før det tilinossere det øverste kammer med bakterier. Faktisk er det muligt at købe skær med filtre til 96 brøndplader, der gør det muligt at automatisering af proceduren. Dette kan lette gennemførelsen af høj-throughput narkotika screening systemer til at fremskynde opdagelsen af lægemidler mod de nævnte sygdomme og for at reducere bivirkninger på BBB under udviklingen af lægemidler.
Et kritisk skridt i den præsenterede metode er inkubationstiden efter tilsætning af bakterierne til det øverste kammer. Det er vigtigt at bruge timer som tidslinjer i protokollen, fordi generationen tid af E. coli er kun 20 min55. Ellers kan brugen af forskellige tidspunkter føre til vildledende resultater. Der er også en mulig risiko for kontaminering mellem øvre og nedre kammer under bakterieeksponeringen, hvis pladerne ikke håndteres med forsigtighed. Eventuelle ændringer af de 12 brøndplade på dette punkt kunne forurene mediet i underkammeret.
E. coli er en velkendt, meget almindelig årsag til bakteriel meningitis. Yderligere undersøgelser bør teste forskellige bakterier, der også er forbundet med meningitis, såsom Neisseria meningitidis56 eller Streptococcus pneumoniae57. Disse synes at bruge forskellige mekanismer til at krydse BBB og skal forstås bedre til behandling af patienter. Hos ældre patienter, forekomsten for POD stiger26 samt antallet af forekommende comorbiditeter. Det er kendt, at der er interaktioner mellem forskellige sygdomme, især systemiske dem som diabetes. I vores model er det muligt at simulere disse betingelser eller behandle cellerne, før de tilføjer bakterierne.
Modellen er begrænset af den direkte kontakt mellem THBMECs og bakterier, og yderligere forskning er nødvendig for at undersøge potentielle kontaktmekanismer for at opdage de involverede veje og proteiner. Det er dog muligt at fjerne skær og høste cellerne til yderligere analyse. Modellens TEER er lavere i forhold til stamcellemodellerne38,39,40. Vi bekræftede dette ved hjælp af en bakteriekoncentration, der ikke krydsede BBB i ubehandlede celler efter 6 timer.
Sammenfattende repræsenterer denne metode en robust platform til at analysere krydsning af bakterier gennem BBB med potentiale til at udvide det til high-throughput drug screeninger.

Den menneskelige BBB er en unik grænse for hjernevæv, der adskiller hjernen fra blodet. Det strengt regulerer passage af større og hydrofile molekyler, blokerer paracellulær diffusion, og fastholder hjernen homøostase. Det beskytter også hjernen mod plasmaudsving, toksiner, mikrober og guider inflammatoriske celler som en del af centralnervesystemets (CNS) immunitet. Siden opdagelsen for et århundrede siden1, mange undersøgelser er blevet gennemført for at forstå strukturen og funktionen af BBB. De komplekse interaktioner mellem celler, proteiner og signaler fra hjerne og blod kræver yderligere undersøgelse og modeller.
Den menneskelige BBB består af tre celletyper: hjernemikrovaskulære endotelceller (BMECs), pericytter og astrocytter2,3. BMECs adskiller sig fra de fleste af de endotelceller i kroppen, idet de besidder et stort antal stramme vejkryds og klæber vejkryds4,lav pinocytotisk aktivitet2,5, og en kontinuerlig kælder membran6,7 til at blokere paracellulære diffusion. Små lipofile molekyler kan diffuse og passere BBB efter deres koncentration gradient; større og hydrofile molekyler kommer ind i eller efterlader kun hjernen gennem polariserede selektive transportsystemer8. Denne forordning resulterer i en høj transendotelelektrisk modstand (TEER) på 1.500-2.000 Ω·cm2 , der er omvendt korreleret med permeabilitet9,10. Selv om BMEC'er bygger en stram barriere, kan de reagere på lokale og perifere signaler11,12. Der er et tæt samspil mellem BMECs og astrocytter13; astrocytendfødderne bygger et lag omkring fartøjerne og fremkalder dannelsen af stramme vejkryds13,14. De er involveret i BBB-modning med forskellige faktorer, herunder omdannelse af vækstfaktor-β (TGF-β)15,16. Desuden spiller pericytter en central rolle i reguleringen af angiogenese17 og forhindre apoptose af endotel i cellulære differentiering18 (figur 1). De er indlejret i kælderen membran og giver strukturel stabilitet af fartøjet væg19.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60692/60692fig1.jpg"> Figur 1: Den skematiske struktur af blod- og hjernebarrieren. Den unikke struktur af den menneskelige BBB er sammensat af tre forskellige celletyper. Mikrokarlumen er omgivet af endotelceller, som er beriget i snævre vejkryds, og er ikke fenestrated. De er indlejret i kælderen membran, ligesom pericytter. Disse celler er vigtige for den strukturelle stabilitet af beholdervæggen og spiller en rolle i udviklingen af BBB ved siden af astrocytterne. Deres endefødder bygge et tæt lag omkring fartøjet og støtte bygningen af stramme vejkryds. Alle komponenter i BBB er vigtige for fysiologiske funktionalitet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60692/60692fig1large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
Mange forskellige patologier er relateret til sammenbruddet af BBB (f.eks septisk encefalopati). De berørte patienter har øget proteinindholdet i cerebrospinalvæsken20, og hjernen parenkym i de berørte gnavere viser en øget optagelse af markant kolloid jernoxid og aminosyrer21,22. Disse resultater peger i retning af en øget permeabilitet af BBB , der opstår sammen med en øget pinocytose i BcMECs21 og endotelaktivering23. En anden associeret patologi relateret til en ændret BBB er meningitis, en medicinsk nødsituation og en kompleks betændelse ledsaget af cerebralødem, der kan føre til neuronal celledød. Det primære indsejlingssted for cirkulerende bakterier formodes at være mikrokarerne24; BBB forhindrer dog, at bakterier kommer i brug. BBB's permeabilitet er ikke altid forbundet med en stigning i eksperimentel hæmatogen meningitis25, og mekanismerne kan være multifaktorielle. Tilfældighed af sepsis med postoperative delirium (POD)26 og foreningen med præoperative infektioner27,28 angiver behovet for en BBB model, der gør det muligt for direkte eksponering for bakterier for at få en bedre forståelse i bakteriel patogenese.
Der er mange huller i forståelsen og kvantificeringen af den mikrobielle traversal gennem BBB. Derfor har vi udviklet en model, der giver mulighed for en bekvem test af forskellige faktorer og betingelser med en direkte sammenhæng mellem bakteriel tværgående og påvirkninger på gennemtrængelighed en BBB. Tidligere arbejde fokuserede på paracellulær permeabilitet og omfattede TEER-måling og sporstofflux. Desuden blev makromolekyletransport analyseret af konjugerede molekyler eller antistoffer, hvorved der kun blev udviklet forskellige modeller, der kun anvender endotelceller eller kombinationer med astrocytter og pericytter. På grund af vanskelighederne med at opnå humant væv på regelmæssig basis, mange dyrebaserede modeller anvendes. Hjerneendotelceller af kvæg- og svineoprindelse danner stramme monolag med en høj TEER, der danner velformet apitisk-basal polaritet og er velegnede til undersøgelser af små molekyletransport gennem BBB. Proteinerne adskiller sig i rækkefølge fra deres menneskelige homologer29,30, hvilket gør undersøgelse af terapeutiske antistoffer vanskelig. Af denne grund, murine eller menneskelige kultur modeller kan være at foretrække. Mus eller rotter som prøve kilder har den fordel, at blive opnået fra velkarakteriserede arter, men giver få celler til studieformål. Dette kan omgås ved brug af udødeliggjort mus hjerne endotel (END) cellelinjer bEND.3, bEND.5 eller cEND31,32,33.
Primære dyrkede celler fra humant væv er vanskelige at opnå og håndtere regelmæssigt. Derfor er de fleste menneskelige cellulære modeller, der anvendes i forskning undersøger den menneskelige BBB udødeliggjort endotelcellelinjer. En offentliggjort cellelinje er human cerebral mikrovaskulære endotelcellelinje hCMEC/D3, som er velegnet til at studere narkotikaoptagelse og er let at håndtere. Cellerne bygger et monolag og udtrykker bBB34'skarakteristiske stramme krydsproteiner , mens ekspressionsniveauet for claudin-5 formodes at være lavere end i intakte mikrokar35 , og mange specifikke transportører er blevet påvist på udskriftsniveau36 samt i proteomiske undersøgelser34. En relativt lav TEER i intervallet 30-50 Ω·cm2 er stadig en udfordring37. En anden kilde til hjerneendotelceller er humane pluripotente stamceller (HPSC'er)38 og menneskelige navlestrengsblod-afledte stamceller fra cirkulerende endotelafomiog hæmatopoietiske slægter39,40. Begge differentieringsprotokoller resulterer i stramme cellemonolag og høje TEER-værdier (f.eks. 1.450 Ω·cm2 i co-kulturer)38. Disse stamcellemodeller kræver ekstrem pleje til dyrkning, men giver mulighed for at undersøge virkningen af regulering af hormoner41 eller sygdomme med genetisk baggrund42 på BBB udvikling.
I denne undersøgelse etablerede vi en udødeliggjort transfunderet human hjerne mikrovaskulær endotelcellelinje, THBMEC43, at efterligne BBB og studere bakteriel traversal. Celler er seedet på et filter og dyrkes til 100% sammenløb i denne celle kultur model. Bakterier er vaccineret i den øverste del af cellekulturkammer. Vi bruger Escherichia coli (E. coli) i vores stikprøveundersøgelse på grund af den høje forekomst af E. coli meningitis44. Det er blevet påvist, at den laveste permeabilitet af cellemonolayer forekommer mellem dag 13 og dag 15 efter såning45. Derfor udføres behandlingen af THBMEC monolaget efter dette tidspunkt, og bakterier vaccineres bagefter i mediet på monolagets apical overflade. Efter en inkubationstid kvantificeres bakterier, der var i stand til at krydse barrieren, via platingsmedium med bakterierne på agarplader og optælling af kolonierne. Et øget antal kolonier korrelerer med højere bakteriel traversal gennem BBB. TEER er omkring 70 Ω·cm246. Det er dog ikke nødvendigt at måle TEER i den beskrevne metode. Selv om det er en veletableret værdi for BBB's gennemtrængelighed, synes det ikke at have nogen indvirkning på bakteriens gennemkørsel gennem BBB. Ubehandlede celler tjener som en kontrol af tæthed i vores model. Det er i tidligere arbejde blevet påvist, at cellerne er i stand til at reagere på proinflammatoriske cytokiner og udtrykke typiske stramme krydsproteiner47. Dette giver mulighed for sammensatte screening og validering af et større sæt transporter substrater og receptorer.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agar - Agar</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>6494.3</td>
			<td>BioScience-Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclave</td>
			<td>Systec</td>
			<td>VX-150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacteria E.coli strain GM2163</td>
			<td>Fermentas Life Sciences, Lithuania</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photometer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>6131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cells THBMEC</td>
			<td>Group of M. F. Stins</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture flasks</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>658175</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Universal 320</td>
			<td>Hettrichlab</td>
			<td>1401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen IV</td>
			<td>SIGMA Aldrich</td>
			<td>C6745</td>
			<td>from human cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess Automated Cell Counter with cell counting chamber slides and Trypan Blue stain 0.4%</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C10311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture tubes</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>191180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cuvettes</td>
			<td>BRAND</td>
			<td>759015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Di sodium hydrogen phosphate di hydrate</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>1065800500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12</td>
			<td>GIBCO/ Thermo Sc.</td>
			<td>11330032</td>
			<td>HEPES</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tubes 15 ml</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>188271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tubes 50 ml</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>227261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>GIBCO/ Thermo Sc.</td>
			<td>10270</td>
			<td>value FBS -Brazil</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>SIGMA Aldrich</td>
			<td>F0556</td>
			<td>solution human fibroblasts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heracell 150 CO2 Incubator</td>
			<td>Heraeus</td>
			<td>50116047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator shaker I 26 New Brunswick</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>M1324-0000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inoculation loop</td>
			<td>Dr. Ilona Schubert - Laborfachhandel</td>
			<td>641000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth Base</td>
			<td>GIBCO/ Thermo Sc.</td>
			<td>12780029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>GIBCO/ Thermo Sc.</td>
			<td>25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microbial incubator B 6200</td>
			<td>Heraeus</td>
			<td>51015192</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microbiological Safety Cabinet AURA 2000 M.A.C. Class II</td>
			<td>BIOAIR</td>
			<td>12469</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope inverse</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>TELAVAL 31</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro tubes 2 ml</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>72,695,400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro tubes 1,5 ml</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>72,706,400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin / Streptomycin</td>
			<td>GIBCO/ Thermo Sc.</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Dr. Ilona Schubert - Laborfachhandel</td>
			<td>464-800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Roth</td>
			<td>HN02.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium-di-hydrogen phosphate</td>
			<td>Roth</td>
			<td>P018.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Roth</td>
			<td>9265.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThinCerts + Multiwell Plates</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>665631</td>
			<td>12 well, pore size 3.0 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin - EDTA</td>
			<td>GIBCO/ Thermo Sc.</td>
			<td>15400054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuumpump Laboport</td>
			<td>KNF</td>
			<td>N 86 KT.18</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analyzing the permeability of the blood-brain barrier by microbial traversal through microvascular endothelial cells

Den menneskelige blod - hjerne barriere (BBB) er karakteriseret ved en meget lav gennemtrængelighed for biomolekyler for at beskytte og regulere stofskiftet i hjernen. Den BBB er hovedsageligt dannet ud af endotelceller indlejret i kollagen IV og fibronectin-rige kælder membraner. Flere patologier skyldes dysfunktion af BBB efterfulgt af mikrobielle traversal, forårsager sygdomme som meningitis. For at teste effekten af flere parametre, herunder forskellige lægemidler og anæstesi, om permeabilitet en BBB vi etableret en ny menneskelig celle kultur model efterligne BBB med menneskelige hjerne mikrovaskulære endotelceller celler. Endotelcellerne dyrkes på kollagen IV og fibronectinbelagte filterenheder indtil sammenløbet og kan derefter behandles med forskellige forbindelser af interesse. For at påvise en mikrobiel traversal, er det øverste kammer med den apiske overflade af endotelceller podet med bakterier. Efter en inkubationsperiode er prøver af det nederste kammer belagt på agarplader, og de opnåede kolonier tælles, hvorved antallet af kolonier korrelerer med BBB's gennemtrængelighed. Endogene cellulære faktorer kan analyseres i denne eksperimentelle set-up for at belyse grundlæggende cellulære mekanismer i endotelceller, der bidrager til BBB. Desuden, denne platform gør det muligt at udføre en skærm for forbindelser, der kan påvirke permeabilitet af endotelceller. Endelig kan bakteriel tværgående studeres og knyttes til forskellige patologier, såsom meningitis. Det kan være muligt at udvide modellen og analysere bakteriernes veje gennem BBB. I denne artikel giver vi en detaljeret protokol over den beskrevne metode til at undersøge BBB's gennemtrængelighed.

Efter protokollen blev cellerne seedet, og BBB-modellen blev bygget. På dag 14 efter såning blev cellerne behandlet med glyoxal som en reaktiv aldehyd. Formålet med forsøget var at undersøge sammenhængen mellem alder og diabetes i POD27 og den høje forekomst af meningitis hos ældre patienter48. De forhøjede niveauer af avancerede glykeringsslutprodukter (AB'er) i både alder og diabetes49 kræver yderligere undersøgelse af virkningen af glykning i patogenesen af mikrobielle traversal gennem BBB. Glykning er en ikke-enzymatisk reaktion fra frie aminogrupper i proteiner med carbonylgrupper, der reducerer kulhydrater eller andre karbonylforbindelser. Glukose er kendt som donor af carbonyl grupper; Der er dog mere reaktive dem kendt. Efter at have opbygget en ustabil Schiffbase omarrangerer de til mere stabile og reaktive dicarbonylforbindelser som glyoxal. Age, de endelige produkter, kan forårsage krydsforbindelser mellem proteiner50. De kan beskadige cellulære strukturer og ændre cellulære funktion ved interaktion med receptoren af AGEs (RAGE)51.
Celler blev behandlet med en 0,05 og 0,15 m glyoxal (GO) opløsning i 1 time, og ubehandlede celler tjente som en kontrol. Glykning blev påvist via immunblottning og påvisning med et anti-AGE antistof (figur 3). De opnåede bakteriekolonier blev talt og repræsenteret som det absolutte antal kolonier (figur 4A) eller det relative antal kolonier, der blev normaliseret til kontrollen (figur 4B). Mediet taget fra brønde med de ubehandlede celler dannede meget få kolonier. Dette resultat viste, at de ubehandlede celler var i stand til at opbygge en barriere og kunne tjene som kontrol. Prøver behandlet med glyoxal viste et øget antal kolonier, hvilket førte til den konklusion, at der er en effekt af glyoxal på THBMECs og cellulær barrieretæthed, fordi antallet af kolonier viste en betydelig forskel mellem ubehandlede og behandlede celler. Den øgede bakteriekrydsning af barrieren efter behandlingen med glyoxal kan forklare, hvorfor diabetes er korreleret med sygdomme med en BBB opdeling.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60692/60692fig3a.jpg"> Figur 3: Påvisning af proteinlyklykning via immunblotting. THBMECs blev behandlet med GO i forskellige koncentrationer i 1 time. Det samlede protein blev isoleret og adskilt ved hjælp af SDS-PAGE. Glykning af proteinerne blev påvist via immunblotting ved hjælp af anti-AGE-antistof (CML-26). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60692/60692fig3alarge.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
I en anden indstilling, protein glykning af THBMECs blev induceret af glukose. Steriliseret glukose blev tilsat DMEM/F-12 medium for at øge glukosekoncentrationen fra normalt glukosemedium (NG) med 17,5 mM til høj glukosemedium (HG) med 42,5 mM. THBMECs blev dyrket i to forskellige celledyrkningskolber: det ene i det normale glukosemedium (NG) og det andet inden for højglukosemedium (HG). Disse to forskellige medier blev også brugt til vækst af BBB på filtre i 12 brøndplader. Celler dyrket i NG medium tjente som en kontrol. De opnåede kolonier er repræsenteret som det absolutte antal kolonier (figur 4C) eller det relative antal kolonier, der normaliseres til kontrollen (figur 4D). Resultaterne tyder ikke på nogen signifikant indvirkning på krydsningen af bakterier gennem den menneskelige BBB, hvilket førte til den konklusion, at virkningen af NG vs HG ikke var alvorlig nok til at påvirke BBB's integritet. De forskellige scenarier var designet til at bevise modellen og integriteten af de celler, der efterligner BBB.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60692/60692fig4d.jpg"> Figur 4: Absolutte og relative antal optalte bakteriekolonier i BBB-modellen med THBMECs. THBMECs blev behandlet med 0,15 mM GO for 1 time, ubehandlede celler tjente som en kontrol. I alt 450 μL E. coli suspension (OD600 = 0,5) blev tilføjet til hvert øvre kammer. Medium fra de nederste kamre blev belagt på agarplader efter 6 h. (A) Grafen viser den gennemsnitlige gennemsnit +/- SEM af tællede kolonier. (B) Grafen viser de optalte kolonier, der normaliseres med de ubehandlede celler som kontrol +/- SEM (n = 4). I (C) ogd) blev DER dyrket THBMECs i NG- og HG-medium. I alt 450 μL E. coli suspension (OD600 = 0,5) blev tilføjet til hvert øvre kammer. Medium fra det nederste kammer blev belagt på agarplader efter 6 h. (C) Grafen viser den gennemsnitlige gennemsnit +/- SEM af tællede kolonier. (D) Grafen viser de optalte kolonier, der normaliseres med de ubehandlede celler som kontrol +/- SEM (n = 3). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60692/60692fig4large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Analyzing the Permeability of the Blood-Brain Barrier by Microbial Traversal through Microvascular Endothelial Cells at JoVE.com

Analyzing the Permeability of the Blood-Brain Barrier by Microbial Traversal through Microvascular Endothelial Cells

Den menneskelige blod - hjerne barriere selektivt forhindrer indtrængen af hydrofile molekyler og patogener ind i hjernen. Flere patologier, herunder meningitis og postoperativ delirium, er forbundet med en øget gennemtrængelighed af blod - hjerne barrieren. Her beskriver vi en endotelcellekulturmodel for at teste barrierengennemtrængelighed ved mikrobiel traversal.

Analyse af permeabiliteten af blod-hjernebarrieren ved mikrobielle traversal gennem mikrovaskulære endotelceller

The human blood-brain barrier (BBB) is characterized by a very low permeability for biomolecules in order to protect and regulate the metabolism of the ...

Denne metode gør det muligt at analysere den menneskelige blod - hjerne barriere ved at måle bakterielle traversal på forskellige behandlinger. Det kan bidrage til at opdage patogenesen af bakteriel meningitis og postoperativ delirium. Det er en enkel metode, og virkningerne af behandlingen er direkte repræsenteret ved antallet af bakterier.Det kan ændres for at muliggøre høj gennemløbsanalyse af forbindelser på endotelcellerne. Begynd med at samle 12-brøndpladen i et biologisk sikkerhedsskab. Pak pladen og hver indsats ud, og brug derefter steriliserede kraftbefædre til at få fat i skærne på deres base og læg dem i brøndene.Coat porøs membran af hver indsats med 90 mikroliter på 10 mikrogram pr mikroliter kollagen IV og fibronectin blanding og inkubere pladen i en cellekultur inkubator ved 37 grader Celsius i 24 timer. Efter inkubationen vaskes indsatsen to gange ved at pipettere en milliliter PBS i hver indsats og aspirere den med en vakuumpumpe. Derefter jævnbyrde membraner ved pipettering prewarmed DMEM F12 medium i de øvre og nedre kamre og inkubere pladen ved 37 grader Celsius og 5% kuldioxid.For at frø de humane mikrovaskulære endotelceller, aspirere mediet fra cellekulturkolben og vask cellerne med 10 milliliter PBS. Cellerne dækkes helt med fem milliliter trypsin EDTA, og kolben inkuberes i tre til fem minutter ved 37 grader Celsius. Cellernes fem milliliter overføres til et 15 milliliterrør, og der tilsættes fem milliliter FCS, der indeholder medium, for at stoppe den enzymatiske reaktion.Centrifuge suspensionen i tre minutter ved 210 gange g, fjerne supernatant og resuspend cell pellet i fem milliliter medium. Tilføj 10 mikroliter af celle suspensionen til 10 mikroliter af 0,4% trypan blå plet, derefter tilføje 10 mikroliter af blandingen til et tællekammer. Sæt tællekammeret i celletælleren, og start det relevante program, og sørg for, at tælleren er fokuseret.Efter optælling, frø 200, 000 celler i hvert øvre kammer på 12-brønd plade og inkubere pladen ved 37 grader Celsius i 14 dage at ændre medierne i det øvre og nedre kammer hver to til tre dage. Efter 14 dage skal du sikre dig, at cellekanalen er 100 % ved at billedre dem med et mikroskop. En dag før permeabilitetsmåling sættes en koloni af E.coli stamme GM2163 i tre milliliter LB medium.Kultur cellerne ved 37 grader Celsius i 24 timer i en inkubationsshaker. Til behandling af celler med en sammensat af interesse, fortyndes det til sin endelige koncentration i DMEM F12 medium og tilsæt denne blanding i de øvre og nedre kamre i 12-brøndpladen, derefter inkubere pladen i en cellekultur inkubator. Efter inkubationen, udveksle hele mediet med antibiotika-fri medium.Koncentrationen af nattens bakteriekultur bestemmes ved at måle dens optiske tæthed ved 600 nanometer, og den fortyndes derefter til et OD600 på 0,5 i et Falcon-rør på 50 milliliter. I et biologisk sikkerhedsskab tilsættes 450 mikroliter af bakterieopløsningen i hvert øverste kammer af 12-brøndpladen, hvortil derefter inkuberes pladen i seks timer ved 37 grader Celsius. Efter inkubationen fjernes indsatsen med scesk og prøve 50 mikroliter af mediet fra hvert underkammer, idet mediet ikke spildes fra de øverste kamre i de nederste kamre.Det er vigtigt at strengt adskille medierne i det øvre og nedre kammer som en spillover fra bakterier i det øverste kammer ville føre til falske positive resultater. Drop hver prøve på en separat agar plade og streak opløsningen med en celle spreder. Inkuber pladerne ved 37 grader Celsius i 24 timer, og tæl derefter kolonierne.For at undersøge effekten af glykation på mikrobiel traversal gennem blod - hjerne barrieren, celler blev behandlet med en 0,5 og en 0,15 millimolar glyoxal opløsning i en time med ubehandlede celler tjener som en kontrol. Glycationen blev derefter påvist via immunblotting med anti-AGE antistoffer. De opnåede bakteriekolonier blev optalt og repræsenteret som det absolutte antal kolonier eller det relative antal kolonier, der blev normaliseret til kontrol.Prøver behandlet med glyoxal viste et øget antal kolonier, der indikerer, at behandlingen har en effekt på cellulær barrieretæthed. For at undersøge glukose-induceret protein glykkning, THBMECs blev dyrket i normal glukose og højt glukose medium. Det absolutte antal kolonier og det relative antal kolonier, der blev normaliseret til kontrol, viste, at glukose ikke havde nogen signifikant indvirkning på integriteten af blod- og hjernebarrieren.Behandlede endotelceller kan analyseres yderligere ved proteomics tilgange, for eksempel massespektrometri, at analysere ændringer i proteome. Denne teknik hjælper med at forstå den menneskelige blod - hjerne barriere og bakteriel traversal. Det kan bruges til at opdage aspekter af aldring og neurodegenerative sygdomme som Alzheimers sygdom.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Separation of Single-stranded DNA, Double-stranded DNA and RNA from an Environmental Viral Community Using Hydroxyapatite Chromatography

Viruses, particularly bacteriophages (phages), are the most numerous biological entities on Earth1,2.  Viruses modulate host cell abundance and diversity, ...

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

The system comprising bacteriophage (phage) lambda and the bacterium E. coli has long served as a paradigm for cell-fate determination1,2. Following the ...

Generation of Recombinant Arenavirus for Vaccine Development in FDA-Approved Vero Cells

Fremstilling af rekombinant arenavirus for Vaccine Development i FDA-godkendte Vero celler

The development and implementation of arenavirus reverse genetics represents a significant breakthrough in the arenavirus field  4. The use of cell-based ...

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Kvantitative<em&gt; In vitro</em&gt; Assay til måling neutrofiladhæsion til Aktiverede primære humane mikrovaskulære endotelceller under statiske forhold

The vascular  endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the  acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are ...

Analyzing the Effects of Stromal Cells on the Recruitment of Leukocytes from Flow

At analysere virkningen af ​​stromacellers om ansættelse af Leukocytter fra Flow

Stromal cells regulate the recruitment of circulating leukocytes during inflammation through cross-talk with neighboring endothelial cells. Here we ...

An In Vitro Model of the Blood-brain Barrier Using Impedance Spectroscopy: A Focus on T Cell-endothelial Cell Interaction

An In Vitro Model of the Blood-brain Barrier Using Impedance Spectroscopy: A Focus on T Cell-endothelial Cell Interaction

en<em&gt; In vitro</em&gt; Model af blodhjernebarrieren Brug Impedans Spektroskopi: En Fokus på T-celle-endotel Cell Interaction

Breakdown of the blood-brain barrier (BBB) is a critical step in the development of autoimmune diseases such as multiple sclerosis (MS) and its animal ...

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Analyse af lymfocyt Ekstravasation Ved anvendelse af en<em&gt; In vitro</em&gt; Model af humant blod-hjernebarrieren

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte ...

High-throughput Measurement of Plasma Membrane Resealing Efficiency in Mammalian Cells

Høj overførselshastighed måling af Plasma membran genforsegling effektivitet i pattedyrceller

In their physiological environment, mammalian cells are often subjected to mechanical and biochemical stresses that result in plasma membrane damage. In ...

Digestion of the Murine Liver for a Flow Cytometric Analysis of Lymphatic Endothelial Cells

Fordøjelsen af Murine leveren en Flow Cytometric analyse af lymfatisk Endothelial Cells

Within the liver, lymphatic vessels are found within the portal triad, and their described function is to remove interstitial fluid from the liver to the ...