Name: analyzing the permeability of the blood-brain barrier by microbial traversal through microvascular endothelial cells
Uploaded: 2020-02-14T12:30:00
Duration: 6 min 26 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analyzing the Permeability of the Blood-Brain Barrier by Microbial Traversal through Microvascular Endothelial Cells at JoVE.com

De auteurs erkennen Dr Maryam Hussain voor eerdere werkzaamheden aan deze methode, de groep van PD Dr Kerstin Danker (Charité-Universitätsmedizin, Berlijn) voor het verstrekken van de THBMECs en Juliane Weber voor het kritisch lezen van het manuscript. Deze studie werd ondersteund door de RTK 2155 (ProMoAge).

1. Voorbereiding van buffer- en reagentia
<ol><li>Bereid 10x fosfaatbuffer zoutlijn (10x PBS) voor door 80 g natriumchloride (NaCl), 2 g kaliumchloride (KCl), 14,4 g dinatrium-waterstof-fosfaatdihydraat (Na2HPO4 · 2 H2O) en 2 g kaliumdiwaterstoffosfaat (KH2PO4)toe te voegen in een glaskolf van 1 L in 1 L van dubbel gedistilleerde H2O. Autoclave de 10x PBS oplossing en verdun 100 mL van deze oplossing in 900 mL dubbel gedestilleerd water om 1x PBS te krijgen.<ol>
<li>Gebruik het autoclave om oplossingen te steriliseren. Doe de glazen kolf in de mand, sluit het deksel en steriliseer het gedurende 15 min bij 121 °C en 98,9 kPa. OPMERKING: Dit protocol wordt altijd gebruikt voor autoclaving oplossingen in verdere stappen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bereid een 10 μg/mL collageen IV en 10 μg/mL fibronectine oplossing door verdunning 0,5 mg/mL fibronectine oplossing en de 0,3 mg/mL collageen IV oplossing elk met 1x PBS tot 100 mg/μL aliquots in 1,5 mL micro buizen. Meng daarna 100 μL van beide aliquots met 1.800 μL 1x PBS in 2 mL microbuizen en bewaar ze bij -20 °C.</li>
	<li>Bereid DMEM/F-12 medium voor door 4% foetaal runderserum en 2 mM L-glutamine en 100 mg/L penicilline/streptomycine toe te voegen aan het medium en op te slaan bij 4 °C.</li>
	<li>Bereid 1x trypsin-EDTA oplossing voor door 5 mL van de 10x geconcentreerde trypsin-EDTA-oplossing te verdunnen met 45 mL 1x PBS in een 50 mL buis en deze op te slaan bij 4 °C.</li>
	<li>Bereid 500 mL LB medium door een gewicht van 10 g LB bouillon basis in een 500 mL glazen kolf. Voeg 500 mL gesteriliseerd water toe en autoclave.</li>
	<li>Bereid LB agar door een gewicht van 10 g LB bouillon basis en 7,5 g agar-agar in een 500 mL glazen kolf. Voeg 500 mL gesteriliseerd water toe voordat u autoclaven en sluit het deksel van de kolf niet. Autoclave en laat de oplossing afkoelen tot het warm is om aan te raken.</li>
	<li>Bereid antibioticavrij medium voor door 4% foetaal runderserum en 2 mM L-glutamine toe te voegen, maar geen penicilline/streptomycine aan het DMEM/F-12 medium en bewaar het op 4 °C zoals in stap 1.3.</li>
</ol>2. Groei van de bloed-hersenbarrière nabootsen cellen
<ol><li>Om de 12 putplaat te monteren, plaatst u de celkweekinserts in de putten (figuur 2A).<ol>
<li>Pak de plaat en elke insert in een biologische veiligheidskast en voer daar verdere stappen uit. Gebruik gesteriliseerde tangen om de insert te grijpen op zijn brede basis om het te verplaatsen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bedek het poreuze membraan van elke insert met 90 μL van 10 μg/mL collageen IV en 10 μg/mL fibronectinemengsel. Incubeer de 12 putplaat gedurende 24 uur bij 37 °C in een celkweekincubator (figuur 2B).</li>
	<li>Was de wisselplaten twee maal door 1 mL 1x PBS in elke wisselplaat te besuialeren en de oplossing aan te zuigen met een vacuümpomp voor celculturen.</li>
	<li>Equilibrate de membranen door pipetteren 0,5 mL van voorverwarmde DMEM / F-12 medium in de bovenste en 1,5 mL in de onderste kamer. Bebroed de plaat 30 min bij 37 °C in een celkweekincubator met 5% CO2-atmosfeer (figuur 2C).</li>
	<li>Zaad 2 x 105 menselijke microvasculaire endotheelcellen in elke bovenste kamer en de 12 putplaat bij 37 °C uitbroeden in een celkweekincubator (figuur 2D).<ol>
<li>Zuig het medium uit de celkweekkolf aan met behulp van een vacuümpomp voor celculturen en was de monolayer door 10 mL 1x PBS te besuifen en de oplossing daarna te besmeifen met een vacuümpomp.</li>
		<li>Bedek de cellen volledig met 1x geconcentreerde trypsin-EDTA door 5 mL van de oplossing in de celkweekkolf te besmeien. Incubeer de kolf 3-5 min bij 37 °C in een celkweekincubator. OPMERKING: Als de cellen niet zijn gescheiden, tikt u de kolf stevig tegen de palm van de hand om de cellen los te maken.</li>
		<li>Neem 5 mL met een pipet als een aliquot van de celvering in een 15 mL buis en voeg 5 mL van de FCS-bevattende medium om de enzymatische reactie te stoppen.</li>
		<li>Centrifugeer de suspensie gedurende 3 min bij 210 x g,verwijder de supernatant met een vacuümpomp en breg de pellet opnieuw in 5 mL medium met een pipet.</li>
		<li>Gebruik de celteller door 10 μL van de celsuspensie te mengen met 10 μL van 0,4% trypanblauwe vlek in een microbuis van 1,5 mL. Voeg 10 μL van het mengsel toe aan een schuif van de telkamer, zet het in de celteller en begin te tellen.<ol>
<li>Richt de teller op de cellen, zodat hun rand is donkerblauw en het midden wit. Start daarna het juiste programma voor celtelling.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Als u het volume voor elke wisselplaat wilt berekenen, verdeelt u de verkregen 2 x 105 cellen per wisselplaat met de berekende concentratie van de celsuspensie.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Teelt van het Bloed-hersenbarrièremodel
<ol><li>Incubeer de 12 putplaat gedurende 14 dagen bij 37 °C.</li>
	<li>Verander 0,5 mL medium voor de bovenste kamer en 1,5 mL medium voor de onderste om de 2-3 dagen. Verwarm het medium voordat u het in de celfles. Aanzuigen met de vacuümpomp (figuur 2E). OPMERKING: Werk zorgvuldig om te voorkomen dat het membraan raakt.</li>
	<li>Controleer de status van de cellen door ze te imagingen met een microscoop en de samenvloeiing te bepalen. Zorg ervoor dat de samenloop na 14 dagen 100% is.</li>
</ol>4. Bereiding van bacteriën
<ol><li>Een dag voor de meting, zet een kolonie van de E. coli stam GM2163 in LB medium. Incubeer de kweekbuis gedurende 24 uur bij 37 °C met 180 tpm in een incubatieshaker (figuur 2F).<ol>
<li>Cultiver de E. coli-stam op een LB agarplaat bij 4 °C. Neem een kolonie met een gesteriliseerde pick en zet de pick in de bereide kweekbuis met 3 mL LB medium.</li>
		<li>Bereid een LB agar plaat voor elke insert met warme LB agar oplossing en vul de petrischaaltjes tot de helft van hun totale volume. Laat ze stevig worden en bewaar ze bij 4 °C.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Behandeling van cellen
<ol><li>Behandel op dag 14 na het zaaien cellen met verbindingen of meet de transendotheel elektrische weerstand (TEER), indien gepland (figuur 2G). LET OP: Altijd een aantal onbehandelde cellen als een controle.<ol>
<li>Om cellen met de samenstelling van belang te behandelen, verdunt u de verbinding tot de uiteindelijke concentratie in DMEM/F-12 medium. Voeg 0,5 mL van dit mengsel toe in de bovenste kamer en 1,5 mL in de onderste kamer. Incubeer de plaat in een celkweekincubator voor de gewenste tijd.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Wissel daarna het volledige medium om met antibioticavrij medium door te aspiratingen met de vacuümpomp en pipetteren (figuur 2H).</li>
</ol>6. Meting van de doorlaatbaarheid
<ol><li>Om constante concentraties bacteriën te krijgen, meet de optische dichtheid met een fotometer op een golflengte van 600 nm. Verdun de nachtoplossing van bacteriën met LB-medium in een 50 mL-valkenbuis tot een OD600 van 0,5 ± 0,05. Werk op ijs.<ol>
<li>Vul 1 mL LB medium in een cuvette. Start de fotometer en zet de cuvette in, gemarkeerd kant naar voren. Druk op de bodem "Blank" voor het meten van de lege waarde achteraf.</li>
		<li>Meet de dichtheid van de bacteriële oplossing door het te vullen in een cuvette, zetten het in, en het indrukken van de onderste monster. Herhaal de meting tijdens het verdunnen tot het verkrijgen van de uiteindelijke concentratie.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Werk in een biologische veiligheidskast waar bacteriën kunnen worden behandeld met de voorbereide 12 putplaat en bacteriële oplossing bij OD600 = 0,5. Voeg slechts 450 μL bacteriële oplossing toe aan elke bovenste kamer met 0,5 mL medium (figuur 2I).</li>
	<li>Incubeer de 12 putplaat gedurende 6 uur bij 37 °C in een couveuse. LET OP: Het protocol dicteert om hier te pauzeren.</li>
	<li>Monster 50 μL van het medium met een pipet uit elke onderste kamer door de wisselplaat met tangen te verwijderen (figuur 2J). Zorg ervoor dat het medium niet van de bovenste kamers naar de onderste kamers wordt gemorst.</li>
	<li>Plaat elk monster op een aparte agar-plaat(figuur 2K). Laat het monster op de plaat vallen en streep de oplossing eruit met een celverspreider.</li>
	<li>Incubeer de agarplaten 24 uur bij 37 °C in een couveuse.</li>
	<li>Tel de kolonies in elke plaat (figuur 2L).</li>
</ol>7. Gegevens analyseren
<ol><li>Schrijf de gegevens in een tabel en bereken de gemiddelde en standaarddeviatie van de waargenomen kolonies van behandelde en onbehandelde cellen.</li>
	<li>Geef het gemiddelde weer als het absolute aantal kolonies.<ol>
<li>Om de resultaten te normaliseren, berekent u het relatieve aantal kolonies door alle resultaten te delen met de controlewaarde.</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60692/60692fig2a.jpg"> Figuur 2: Gedetailleerde presentatie van de afzonderlijke stappen in het protocol. (A) Zet de inzetstukken met gesteriliseerde tangen in de 12 putplaat. (B) Bestrijk elke insert met 90 μL fibronectine en collageen IV mengsel en incubeer gedurende 24 uur. (C) Equilibrate de membranen met voorverwarmde medium voor 30 min. (D) Zaad 2 x 105 menselijke hersenen microvasculaire endotheelcellen per insert. (E) Cultiveren van de plaat voor de juiste hoeveelheid tijd. (F) Een dag voor het meten, zet een E. coli kolonie in een LB medium kweekbuis en incubeer voor 24 uur. (G) Behandel cellen of meet TEER. (H) Uitwisseling volledig medium met antibiotica-vrij medium. (I) Voeg 450 μL bacteriële oplossing (OD600 = 0,5) toe aan elke bovenste kamer en broed gedurende 6 uur. (J) Monster 50 μL medium uit elke onderste kamer verwijderen insert met tangen. (K) Plaats het monster op agarplaten en uitbroed gedurende 24 uur. (L) Tel de kolonies en analyseer de gegevens. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60692/60692fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Beperkt inzicht in de pathogenese van microbiële traversal beperkt verdere ontwikkeling van therapieën voor POD of meningitis. De mortaliteit en morbiditeit van deze ziekten vereisen een betere behandeling van de patiënt, vereisen onderzoek van de onderliggende mechanismen en hebben een robuust platform nodig voor samengestelde screening. De multifactoriële gebeurtenissen kunnen worden bestudeerd met menselijke BMECs. Verschillende succesvolle gerapporteerde isolatieprocedures van BMECs van een aantal soorten hebben aangetoond dat de kenmerken van de cellen moleculaire signatuur52,53verloren zijn gegaan . De beschreven THBMECs in deze procedure werden getransfected in zeer vroege passages, waar zij specifieke hersenen endotheelcelkenmerken tentoonstelden en hen43bewaarden . Dit is belangrijk, omdat niet alle stappen in de getroffen trajecten tot nu toe zijn ontdekt, en dit model lijkt conventionele BMECs na te bootsen. Ons gepresenteerde model toont directe invloeden op BMECs en de microbiële traversal door de BBB.
De behandeling van THBMEC-cellen is eenvoudig en de benodigde technische apparatuur bestaat in de meeste life science-laboratoria. Ons model zorgt voor een onmiddellijke start van onderzoeksprocedures nadat de THBMEC's een strakke monolayer hebben gebouwd. Het gebied van toepassingen kan uitgebreid zijn vanwege de mogelijke combinaties tussen nieuwe tests en conventionele testen zoals TEER-meting of etikettering met tracers54. Het is ook mogelijk om astrocyten of pericytes toe te voegen om een co- of triple-cultuurmodel te maken. De invloed van geneesmiddelen op de microbiële traversal kan ook worden getest in ons model door de THBMECs te behandelen met verbindingen voordat de bovenste kamer met bacteriën wordt ingeënt. In feite is het mogelijk om wisselplaten met filters voor 96 putplaten te kopen, waardoor de automatisering van de procedure mogelijk is. Dit kan de implementatie van systemen voor geneesmiddelen met een hoge doorvoer vergemakkelijken om de ontdekking van geneesmiddelen tegen de genoemde ziekten te versnellen en de bijwerkingen op de BBB tijdens de ontwikkeling van geneesmiddelen te verminderen.
Een kritieke stap in de gepresenteerde methode is de incubatietijd na het toevoegen van de bacteriën aan de bovenste kamer. Het is belangrijk om uren te gebruiken als tijdlijnen in het protocol, omdat de generatietijd van E. coli slechts 20 min55is. Anders kan het gebruik van verschillende tijdpunten leiden tot misleidende resultaten. Er is ook een mogelijk risico op besmetting tussen de bovenste en onderste kamer tijdens de bacteriële blootstelling als de platen niet met zorg worden behandeld. Eventuele wijzigingen aan de 12 putplaat op dit punt kunnen het medium in de onderste kamer vervuilen.
E. coli is een bekende, veel voorkomende oorzaak van bacteriële meningitis. Verder onderzoek moet verschillende bacteriën testen die ook geassocieerd worden met meningitis, zoals Neisseria meningitidis56 of Streptococcus pneumoniae57. Deze lijken verschillende mechanismen te gebruiken om de BBB over te steken en moeten beter worden begrepen voor de behandeling van patiënten. Bij oudere patiënten neemt de incidentie voor POD met26 toe en het aantal voorkomende comorbiditeiten. Het is bekend dat er interacties zijn tussen verschillende ziekten, vooral systemische ziekten zoals diabetes. In ons model is het mogelijk om deze omstandigheden te simuleren of de cellen te behandelen voordat de bacteriën worden toegevoegd.
Het model wordt beperkt door het directe contact van THBMECs en bacteriën, en verder onderzoek is nodig om mogelijke mechanismen van contact te onderzoeken om de betrokken trajecten en eiwitten te detecteren. Het is echter mogelijk om wisselplaten te verwijderen en de cellen te oogsten voor verdere analyse. De TEER van het model is lager in vergelijking met stamcelmodellen38,39,40. We bevestigden dit door gebruik te maken van een bacteriële concentratie die de BBB na 6 uur niet in onbehandelde cellen kruiste.
Samengevat, deze methode vertegenwoordigt een robuust platform om de traversal van bacteriën te analyseren door de BBB met het potentieel om het uit te breiden voor high-throughput drug screenings.

De menselijke BBB is een unieke grens van hersenweefsel, het scheiden van de hersenen van het bloed. Het reguleert strikt de passage van grotere en hydrofiele moleculen, blokkeert paracellulaire diffusie, en onderhoudt hersenen homeostase. Het beschermt ook de hersenen tegen plasmaschommelingen, toxines, microben, en begeleidt ontstekingscellen als onderdeel van het centrale zenuwstelsel (CNS) immuniteit. Sinds de ontdekking een eeuw geleden1, zijn veel studies uitgevoerd om de structuur en functie van de BBB te begrijpen. De complexe interacties van cellen, eiwitten en signalen van hersenen en bloed vragen nog verder onderzoek en modellen.
De menselijke BBB bestaat uit drie celtypen: hersenmicrovasculaire endotheliale cellen (BMECs), pericyten en astrocyten2,3. De BMECs verschillen van de meerderheid van de endotheelcellen in het lichaam in die plaats dat ze beschikken over een groot aantal strakke knooppunten en hecht knooppunten4, lage pinocytotische activiteit2,5, en een continue kelder membraan6,7 om paracellulaire diffusie te blokkeren. Kleine lipofiele moleculen kunnen diffuus en passeren de BBB na hun concentratie gradiënt; grotere en hydrofiele moleculen binnenkomen of verlaten de hersenen alleen door gepolariseerde selectieve transportsystemen8. Deze verordening resulteert in een hoge transendotheliale elektrische weerstand (TEER) van 1.500-2.000 Ω·cm2 die omgekeerd gecorreleerd is aan permeability9,10. Hoewel BMECs een strakke barrière bouwen, kunnen ze reageren op lokale en perifere signalen11,12. Er is een nauwe interactie tussen BMECs en astrocyten13; de astrocyte eindvoeten bouwen een laag rond de vaten en veroorzaken de vorming van strakke knooppunten13,14. Zij zijn betrokken bij bbb-rijping met verschillende factoren, waaronder het transformeren van groeifactor-β (TGF-β)15,16. Bovendien spelen pericyten een sleutelrol bij de regulatie van angiogenese17 en voorkomen apoptose van het endotheel in cellulaire differentiatie18 (figuur 1). Ze zijn ingebed in de kelder membraan en zorgen voor structurele stabiliteit van het schip muur19.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60692/60692fig1.jpg"> Figuur 1: Schematische structuur van de bloed-hersenbarrière. De unieke structuur van de menselijke BBB bestaat uit drie verschillende celtypes. Het microvatlumen wordt omringd door endotheelcellen, die zijn verrijkt met strakke verbindingen, en niet worden gefedereerd. Ze zijn ingebed in de kelder membraan, net als de pericytes. Deze cellen zijn belangrijk voor de structurele stabiliteit van de vaatwand en spelen een rol bij de ontwikkeling van de BBB naast de astrocyten. Hun eindvoeten bouwen een nauwe laag rond het schip en ondersteunen de bouw van strakke kruispunten. Alle componenten van de BBB zijn belangrijk voor fysiologische functionaliteit. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60692/60692fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
Veel verschillende pathologieën zijn gerelateerd aan de ineenstorting van de BBB (bijvoorbeeld septische encefalopathie). De getroffen patiënten hebben verhoogde eiwitniveaus in het hersenvocht20, en de hersenen parenchyma in de getroffen knaagdieren toont een verhoogde opname van gemarkeerdcolloïdaal ijzeroxide en aminozuren21,22. Deze resultaten wijzen op een verhoogde doorlaatbaarheid van de BBB die optreedt naast een verhoogde pinocytose in BMECs21 en endothelial activatie23. Een andere geassocieerde pathologie gerelateerd aan een veranderde BBB is meningitis, een medische noodsituatie en een complexe ontsteking vergezeld van hersenoedeem dat kan leiden tot neuronale celdood. De primaire ingangsplaats van circulerende bacteriën wordt verondersteld om microvaten24te zijn ; de BBB voorkomt echter de binnenkomst van bacteriën. De doorlaatbaarheid van de BBB is niet altijd gekoppeld aan een toename van experimentele hematogene meningitis25 en de mechanismen kunnen multifactorieiaal zijn. Toeval van sepsis met postoperatieve delirium (POD)26 en de associatie met preoperatieve infecties27,28 geeft de noodzaak aan van een BBB-model dat de directe blootstelling aan bacteriën in staat stelt om een beter begrip te krijgen in bacteriële pathogenese.
Er zijn veel hiaten in het begrijpen en kwantificeren van de microbiële traversal door de BBB. Daarom hebben we een model ontwikkeld dat een handige test van verschillende factoren en omstandigheden mogelijk maakt met een directe correlatie tussen bacteriële traversal en invloeden op de doorlaatbaarheid van de BBB. Eerdere werkzaamheden waren gericht op de paracellulaire doorlaatbaarheid en omvatten TEER-meting en tracerflux. Bovendien werd macromolecuultransport geanalyseerd door geconjugeerde moleculen of antilichamen, waarbij verschillende modellen met alleen endotheliale cellen of combinaties met astrocyten en pericyten werden ontwikkeld. Vanwege de moeilijkheid bij het verkrijgen van menselijk weefsel op een regelmatige basis, veel dier-gebaseerde modellen worden gebruikt. Hersencellen van runderen en varkens oorsprong vormen strakke monolagen met een hoge TEER die goed gevormde apical-basale polariteit vormen en geschikt zijn voor onderzoeken van klein molecuultransport door de BBB. De eiwitten verschillen in volgorde van hun menselijke homologen29,30, waardoor het onderzoek van therapeutische antilichamen moeilijk. Om deze reden kunnen murine- of menselijke kweekmodellen de voorkeur krijgen. Muis of ratten als monsterbronnen hebben het voordeel dat ze worden verkregen uit goed gekarakteriseerde soorten, maar leveren weinig cellen op voor studiedoeleinden. Dit kan worden omzeild door het gebruik van vereeuwigde muis hersenen endothelioom (END) cellijnen bEND.3, bEND.5 of cEND31,32,33.
Primaire gekweekte cellen uit menselijk weefsel zijn moeilijk te verkrijgen en regelmatig te verwerken. Daarom zijn de meeste menselijke cellulaire modellen gebruikt in onderzoek naar de menselijke BBB zijn vereeuwigde endotheel cellijnen. Een gepubliceerde cellijn is menselijke cerebrale microvasculaire endotheelcellijn hCMEC/D3, die zeer geschikt is voor het bestuderen van de opname van geneesmiddelen en gemakkelijk te hanteren is. De cellen bouwen een monolayer en uitdrukken de karakteristieke strakke kruising eiwitten van de BBB34, terwijl het expressieniveau van claudin-5 wordt gemeld lager te zijn dan in intacte microvaten35 en veel specifieke vervoerders zijn gedetecteerd op transcript niveau36 en in proteomic studies34. Een relatief lage TEER in het bereik van 30-50 Ω·cm2 is nog steeds een uitdaging37. Een andere bron voor hersenendotheelcellen zijn menselijke pluripotente stamcellen (hPSCs)38 en menselijke navelstrengbloed afgeleide stamcellen van circulerende endotheel vererver en hematopoietische geslachten39,40. Beide differentiatieprotocollen resulteren in strakke celmonolagen en hoge TEER-waarden (bijvoorbeeld 1.450 Ω·cm2 in coculturen)38. Deze stamcelmodellen vereisen extreme zorg voor de teelt, maar bieden de mogelijkheid om de invloed van het reguleren van hormonen41 of ziekten met genetische achtergronden42 op BBB-ontwikkeling te bestuderen.
In deze studie hebben we een vereeuwigde transfected menselijke hersenen microvasculaire endotheel cellijn, THBMEC43,om de BBB na te bootsen en bacteriële traversal te bestuderen. Cellen worden gezaaid op een filter en gegroeid tot 100% samenvloeiing in deze cel kweek model. Bacteriën worden ingeënt in het bovenste deel van de celkweekkamer. We gebruiken Escherichia coli (E. coli)in onze steekproefstudie vanwege de hoge incidentie van E. coli meningitis44. Er is aangetoond dat de laagste doorlaatbaarheid van celmonolayer optreedt tussen dag 13 en dag 15 na het zaaienvan 45. Daarom wordt de behandeling van de THBMEC-monolayer na deze tijd uitgevoerd en worden bacteriën daarna inhet medium op het apicale oppervlak van de monolaag ingeënt. Na een incubatietijd worden bacteriën die de barrière konden oversteken gekwantificeerd via beplatingsmedium met de bacteriën op agarplaten en het tellen van de kolonies. Een toename van het aantal kolonies correleert met hogere bacteriële traversal door de BBB. De TEER is ongeveer 70 Ω·cm246. Het is echter niet nodig om de TEER te meten volgens de beschreven methode. Hoewel het een gevestigde waarde is voor de doorlaatbaarheid van de BBB, lijkt het geen invloed te hebben op de doorloop van bacteriën door de BBB. Onbehandelde cellen dienen als een controle van de dichtheid in ons model. In eerdere werkzaamheden is aangetoond dat de cellen kunnen reageren op ontstekingsremmende cytokinen en typische strakke verbindingseiwitten47uitdrukken. Dit maakt samengestelde screening en validatie van een grotere set transporter substraten en receptoren mogelijk.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agar - Agar</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>6494.3</td>
			<td>BioScience-Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclave</td>
			<td>Systec</td>
			<td>VX-150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacteria E.coli strain GM2163</td>
			<td>Fermentas Life Sciences, Lithuania</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photometer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>6131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cells THBMEC</td>
			<td>Group of M. F. Stins</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture flasks</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>658175</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Universal 320</td>
			<td>Hettrichlab</td>
			<td>1401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen IV</td>
			<td>SIGMA Aldrich</td>
			<td>C6745</td>
			<td>from human cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess Automated Cell Counter with cell counting chamber slides and Trypan Blue stain 0.4%</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C10311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture tubes</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>191180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cuvettes</td>
			<td>BRAND</td>
			<td>759015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Di sodium hydrogen phosphate di hydrate</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>1065800500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12</td>
			<td>GIBCO/ Thermo Sc.</td>
			<td>11330032</td>
			<td>HEPES</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tubes 15 ml</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>188271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tubes 50 ml</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>227261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>GIBCO/ Thermo Sc.</td>
			<td>10270</td>
			<td>value FBS -Brazil</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>SIGMA Aldrich</td>
			<td>F0556</td>
			<td>solution human fibroblasts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heracell 150 CO2 Incubator</td>
			<td>Heraeus</td>
			<td>50116047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator shaker I 26 New Brunswick</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>M1324-0000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inoculation loop</td>
			<td>Dr. Ilona Schubert - Laborfachhandel</td>
			<td>641000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth Base</td>
			<td>GIBCO/ Thermo Sc.</td>
			<td>12780029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>GIBCO/ Thermo Sc.</td>
			<td>25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microbial incubator B 6200</td>
			<td>Heraeus</td>
			<td>51015192</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microbiological Safety Cabinet AURA 2000 M.A.C. Class II</td>
			<td>BIOAIR</td>
			<td>12469</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope inverse</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>TELAVAL 31</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro tubes 2 ml</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>72,695,400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro tubes 1,5 ml</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>72,706,400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin / Streptomycin</td>
			<td>GIBCO/ Thermo Sc.</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Dr. Ilona Schubert - Laborfachhandel</td>
			<td>464-800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Roth</td>
			<td>HN02.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium-di-hydrogen phosphate</td>
			<td>Roth</td>
			<td>P018.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Roth</td>
			<td>9265.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThinCerts + Multiwell Plates</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>665631</td>
			<td>12 well, pore size 3.0 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin - EDTA</td>
			<td>GIBCO/ Thermo Sc.</td>
			<td>15400054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuumpump Laboport</td>
			<td>KNF</td>
			<td>N 86 KT.18</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analyzing the permeability of the blood-brain barrier by microbial traversal through microvascular endothelial cells

De menselijke bloed-hersenbarrière (BBB) wordt gekenmerkt door een zeer lage doorlaatbaarheid voor biomoleculen om het metabolisme van de hersenen te beschermen en te reguleren. De BBB wordt voornamelijk gevormd uit endotheliale cellen ingebed in collageen IV en fibronectine-rijke keldermembranen. Verschillende pathologieën zijn het gevolg van disfunctie van de BBB gevolgd door microbiële traversal, waardoor ziekten zoals meningitis. Om het effect van meerdere parameters, waaronder verschillende geneesmiddelen en verdovingsmiddelen, te testen op de doorlaatbaarheid van de BBB hebben we een nieuw menselijke celkweekmodel vastgesteld dat de BBB nabootst met microvasculaire endothelialcellen van de menselijke hersenen. De endotheelcellen worden geteeld op collageen IV en fibronectine-gecoate filtereenheden tot samenvloeiing en kan vervolgens worden behandeld met verschillende verbindingen van belang. Om een microbiële traversal aan te tonen, wordt de bovenste kamer met het apicale oppervlak van de endotheelcellen ingeënt met bacteriën. Na een incubatietijd worden monsters van de onderste kamer verguld op agarplaten en worden de verkregen kolonies geteld, waarbij het aantal kolonies correleert met de doorlaatbaarheid van de BBB. Endogene cellulaire factoren kunnen worden geanalyseerd in deze experimentele set-up om elementaire cellulaire mechanismen van de endotheelcellen bij te dragen aan de BBB op te helderen. Bovendien maakt dit platform het mogelijk om een scherm uit te voeren voor verbindingen die de doorlaatbaarheid van de endothelialcellen kunnen beïnvloeden. Ten slotte kan bacteriële traversal worden bestudeerd en gekoppeld aan verschillende pathologieën, zoals meningitis. Het is mogelijk om het model uit te breiden en de paden van de bacteriën te analyseren via de BBB. In dit artikel geven we een gedetailleerd protocol van de beschreven methode om de doorlaatbaarheid van de BBB te onderzoeken.

Volgens het protocol werden de cellen ingezaaid en werd het BBB-model gebouwd. Op dag 14 na het zaaien werden de cellen behandeld met glyoxaal als reactieve aldehyde. Het doel van het experiment was om de correlatie tussen leeftijd en diabetes in POD27 en de hoge incidentie van meningitis bij oudere patiënten48te onderzoeken. De verhoogde niveaus van geavanceerde glycatie eindproducten (AME's) in zowel leeftijd als diabetes49 vragen om verder onderzoek naar het effect van glycatie in de pathogenese van microbiële traversal door de BBB. Glycatie is een niet-enzymatische reactie van vrije aminogroepen in eiwitten met carbonylgroepen van het verminderen van koolhydraten of andere carbonylverbindingen. Glucose staat bekend als donor van carbonylgroepen; er zijn echter meer reactieve bekenden bekend. Na het bouwen van een onstabiele Schiff's basis, herschikken ze naar stabielere en reactieve dicarbonylverbindingen zoals glyoxal. AME's, de eindproducten, kunnen kruisverbindingen veroorzaken tussen eiwitten50. Ze kunnen cellulaire structuren beschadigen en de cellulaire functie veranderen door interactie met de receptor van AME's (RAGE)51.
Cellen werden behandeld met een 0,05 en 0,15 mM glyoxal (GO) oplossing voor 1 uur, en onbehandelde cellen dienden als een controle. Glycatie werd gedetecteerd via immunoblotting en detectie met een anti-AGE-antilichaam (figuur 3). De verkregen bacteriële kolonies werden geteld en vertegenwoordigd als het absolute aantal kolonies (figuur 4A) of het relatieve aantal kolonies genormaliseerd aan de controle (figuur 4B). Het medium uit putten met de onbehandelde cellen vormde zeer weinig kolonies. Dit resultaat toonde aan dat de onbehandelde cellen in staat waren om een barrière te bouwen en als controle kon dienen. Monsters die met glyoxal werden behandeld, vertoonden een toename van het aantal kolonies, wat leidde tot de conclusie dat er een effect van glyoxaal is op de THBMEC's en de cellulaire barrièredichtheid, omdat het aantal kolonies een significant verschil aantoonde tussen onbehandelde en behandelde cellen. De verhoogde bacteriële kruising van de barrière na de behandeling met glyoxal kan verklaren waarom diabetes is gecorreleerd aan ziekten met een BBB-afbraak.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60692/60692fig3a.jpg"> Figuur 3: Detectie van eiwitglycatie via immunoblotting. THBMECs werden behandeld met GO in verschillende concentraties voor 1 uur. Totaal eiwit werd geïsoleerd en gescheiden met behulp van SDS-PAGE. Glycatie van de eiwitten werd gedetecteerd via immunoblotting met behulp van anti-AGE-antilichaam (CML-26). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60692/60692fig3alarge.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
In een andere setting werd eiwitglyccation van THBMECs veroorzaakt door glucose. Gesteriliseerde glucose werd toegevoegd aan het DMEM/F-12 medium om de glucoseconcentratie te verhogen van het normale glucosemedium (NG) met 17,5 mM tot hoog glucosemedium (HG) met 42,5 mM. ThbMECs werden gekweekt in twee verschillende celkweekkolven: een in het medium normale glucose (NG) en de andere in hoogglucosemedium (HG). Deze twee verschillende media werden ook gebruikt voor de groei van de BBB op filters in 12 put platen. Cellen gekweekt in NG medium diende als een controle. De verkregen kolonies worden weergegeven als het absolute aantal kolonies (figuur 4C) of het relatieve aantal kolonies genormaliseerd aan de controle (figuur 4D). De resultaten wijzen op geen significant effect op de traversal van bacteriën door de menselijke BBB, wat leidt tot de conclusie dat het effect van NG vs HG niet ernstig genoeg was om de integriteit van de BBB te beïnvloeden. De verschillende scenario's zijn ontworpen om het model en de integriteit van de cellen na te bootsen de BBB te bewijzen.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60692/60692fig4d.jpg"> Figuur 4: Absolute en relatieve aantallen getelde bacteriële kolonies in het BBB-model met THBMECs. ThbMECs werden behandeld met 0,15 mM GO voor 1 uur, onbehandelde cellen dienden als een controle. Aan elke bovenste kamer werd in totaal 450 μL E. coli-suspensie (OD600 = 0,5) toegevoegd. Medium uit de onderste kamers werd verguld op agar platen na 6 uur. (A) De grafiek toont het gemiddelde gemiddelde +/- SEM van getelde kolonies. (B) De grafiek toont de getelde kolonies genormaliseerd naar de onbehandelde cellen als controle +/- SEM (n = 4). In (C) en (D) werden THBMECs geteeld in NG en HG medium. Aan elke bovenste kamer werd in totaal 450 μL E. coli-suspensie (OD600 = 0,5) toegevoegd. Medium uit de onderste kamer werd verguld op agar platen na 6 uur. (C) De grafiek toont het gemiddelde gemiddelde +/- SEM van getelde kolonies. (D) De grafiek toont de getelde kolonies genormaliseerd naar de onbehandelde cellen als controle +/- SEM (n = 3). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60692/60692fig4large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Analyzing the Permeability of the Blood-Brain Barrier by Microbial Traversal through Microvascular Endothelial Cells at JoVE.com

Analyzing the Permeability of the Blood-Brain Barrier by Microbial Traversal through Microvascular Endothelial Cells

De menselijke bloed-hersenbarrière voorkomt selectief penetratie van hydrofiele moleculen en ziekteverwekkers in de hersenen. Verschillende pathologieën, waaronder meningitis en postoperatief delirium, worden geassocieerd met een verhoogde doorlaatbaarheid van de bloed-hersenbarrière. Hier beschrijven we een endothelial celkweekmodel om de barrièredoorlaatbaarheid te testen door microbiële traversal.

Analyseren van de permeability van de bloed-hersenbarrière door microbiële traversal door middel van microvasculaire endotheliale cellen

The human blood-brain barrier (BBB) is characterized by a very low permeability for biomolecules in order to protect and regulate the metabolism of the ...

Deze methode maakt het mogelijk om de menselijke bloed-hersenbarrière te analyseren door het meten van bacteriële traversal op verschillende behandelingen. Het kan helpen om de pathogenese van bacteriële meningitis en postoperatieve delirium te ontdekken. Het is een eenvoudige methode en de effecten van de behandeling worden direct vertegenwoordigd door het aantal bacteriën.Het kan worden gewijzigd om een hoge doorvoeranalyse van verbindingen op de endotheelcellen mogelijk te maken. Begin met het monteren van de 12-put plaat in een biologische veiligheidskast. Pak de plaat en elke insert, gebruik dan gesteriliseerde tangen om de inserts te grijpen aan hun basis en leg ze in de putten.Bestrijk het poreuze membraan van elke wisselplaat met 90 microliter van 10 microgram per microliter collageen IV en fibronectinemengsel en broed de plaat gedurende 24 uur in een celkweekinator in een celkweekinator bij 37 graden Celsius. Na de incubatie, was de inzetstukken twee keer door het pipetten van een milliliter PBS in elke insert en aspirating het met een vacuümpomp. Vervolgens equilibrate de membranen door pipet voorverwarmd DMEM F12 medium in de bovenste en onderste kamers en de plaat incuren op 37 graden Celsius en 5% kooldioxide.Om de menselijke microvasculaire endotheelcellen te zaaien, het medium uit de celkweekkolf te halen en de cellen te wassen met 10 milliliter PBS. Bedek de cellen volledig met vijf milliliter trypsine EDTA en incuberen de kolf gedurende drie tot vijf minuten bij 37 graden Celsius. Breng vijf milliliter van de cellen in een 15 milliliter buis en voeg vijf milliliter FCS met medium om de enzymatische reactie te stoppen.Centrifuge de suspensie gedurende drie minuten op 210 keer g, verwijder de supernatant en resuspend de cel pellet in vijf milliliter van medium. Voeg 10 microliter van de celsuspensie toe aan 10 microliter van 0,4% trypanblauwe vlek en voeg vervolgens 10 microliter van het mengsel toe aan een telkamer. Zet de telkamer in de cel teller en start het juiste programma om ervoor te zorgen dat de teller is gericht.Na het tellen, zaad 200,000 cellen in elke bovenste kamer op de 12-put plaat en broeden de plaat op 37 graden Celsius gedurende 14 dagen het veranderen van de media in de bovenste en onderste kamer om de twee tot drie dagen. Zorg er na 14 dagen voor dat de celvloeiing 100% is door ze met een microscoop te imaging. Een dag voor de permeabiliteitsmeting, zet een kolonie E.coli stam GM2163 in drie milliliter LB medium.Kweek de cellen op 37 graden Celsius gedurende 24 uur in een incubatieshaker. Om cellen met een verbinding van belang te behandelen, verdun het aan zijn definitieve concentratie in DMEM F12 middel en voeg dit mengsel in de hogere en lagere kamers in de 12-goedplaat toe, dan de plaat in een celkweek incubator uitbroeden. Na de incubatie, uitwisseling van het volledige medium met antibiotica-vrij medium.Bepaal de concentratie van de nachtelijke bacteriële cultuur door het meten van de optische dichtheid op 600 nanometer, dan verdunnen tot een OD600 van 0,5 in een 50 milliliter Falcon buis. Voeg in een biologische veiligheidskast 450 microliter van de bacteriële oplossing toe aan elke bovenste kamer van de 12-bronplaat en broed de plaat vervolgens zes uur uit bij 37 graden Celsius. Na de incubatie, verwijder de insert met tangen en monster 50 microliter van het medium uit elke onderste kamer zorg ervoor dat het medium niet morsen van de bovenste kamers in de onderste.Het is belangrijk om de media van de bovenste en onderste kamer strikt te scheiden, omdat een overloop van bacteriën uit de bovenste kamer tot vals-positieve resultaten zou leiden. Laat elk monster op een aparte agarplaat vallen en streep de oplossing met een celspreader. Broed de platen 24 uur lang op 37 graden Celsius en tel de kolonies.Om het effect van glycatie op microbiële traversale door de bloed-hersenbarrière te onderzoeken, werden cellen behandeld met een 0,5 en een 0,15 millimolar glyoxale oplossing gedurende een uur met onbehandelde cellen die als controle dienen. De glycatie werd vervolgens gedetecteerd via immunoblotting met anti-AGE antilichamen. De verkregen bacteriële kolonies werden geteld en werden vertegenwoordigd als het absolute aantal kolonies of het relatieve aantal kolonies dat aan de controle wordt genormaliseerd.Monsters behandeld met glyoxal weergegeven een verhoogd aantal kolonies waaruit blijkt dat de behandeling een effect heeft op de cellulaire barrière dichtheid. Om glucose-geïnduceerde eiwitglycatie te onderzoeken, werden THBMECs gekweekt in normale glucose en hoog glucosemedium. Het absolute aantal kolonies en het relatieve aantal kolonies genormaliseerd aan de controle gaf aan dat glucose geen significant effect op de integriteit van de bloed-hersenbarrière had.Behandelde endotheelcellen kunnen verder worden geanalyseerd door proteomics benaderingen, bijvoorbeeld massaspectrometrie, om veranderingen in het proteoom te analyseren. Deze techniek helpt bij het begrijpen van de menselijke bloed-hersenbarrière en bacteriële traversale. Het kan worden gebruikt om aspecten van veroudering en neurodegeneratieve ziekten zoals de ziekte van Alzheimer te ontdekken.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Separation of Single-stranded DNA, Double-stranded DNA and RNA from an Environmental Viral Community Using Hydroxyapatite Chromatography

Scheiding van enkelstrengs DNA, dubbelstrengs DNA en RNA van een milieu-Viral Gemeenschap met behulp van Hydroxyapatite Chromatografie

Viruses, particularly bacteriophages (phages), are the most numerous biological entities on Earth1,2.  Viruses modulate host cell abundance and diversity, ...

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

Na Cell-lot in<em&gt; E. coli</em&gt; Na Infectie door Phage Lambda

The system comprising bacteriophage (phage) lambda and the bacterium E. coli has long served as a paradigm for cell-fate determination1,2. Following the ...

Generation of Recombinant Arenavirus for Vaccine Development in FDA-Approved Vero Cells

Generatie van recombinant arenavirus for Vaccine Development in FDA-goedgekeurde Vero cellen

The development and implementation of arenavirus reverse genetics represents a significant breakthrough in the arenavirus field  4. The use of cell-based ...

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Kwantitatief<em&gt; In vitro</em&gt; Assay om neutrofieladhesie Maatregel om Activated primaire humane microvasculaire endotheelcellen onder statische omstandigheden

The vascular  endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the  acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are ...

Analyzing the Effects of Stromal Cells on the Recruitment of Leukocytes from Flow

Het analyseren van de effecten van stromale cellen op de recrutering van leukocyten van Flow

Stromal cells regulate the recruitment of circulating leukocytes during inflammation through cross-talk with neighboring endothelial cells. Here we ...

An In Vitro Model of the Blood-brain Barrier Using Impedance Spectroscopy: A Focus on T Cell-endothelial Cell Interaction

An In Vitro Model of the Blood-brain Barrier Using Impedance Spectroscopy: A Focus on T Cell-endothelial Cell Interaction

Een<em&gt; In Vitro</em&gt; Model van de bloed-hersen barrière met behulp van Impedantiespectroscopie: een focus op T-cel-endotheelcellen Interaction

Breakdown of the blood-brain barrier (BBB) is a critical step in the development of autoimmune diseases such as multiple sclerosis (MS) and its animal ...

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Analyse van lymfocyt extravasatie gebruik van een<em&gt; In Vitro</em&gt; Model van het menselijk bloed-hersenbarrière

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte ...

High-throughput Measurement of Plasma Membrane Resealing Efficiency in Mammalian Cells

High-throughput meting van plasmamembraan opnieuw verzegelen efficiëntie bij zoogdiercellen

In their physiological environment, mammalian cells are often subjected to mechanical and biochemical stresses that result in plasma membrane damage. In ...

Digestion of the Murine Liver for a Flow Cytometric Analysis of Lymphatic Endothelial Cells

Spijsvertering van de lymfkliertest lever voor een analyse van de cytometrische stroom van lymfatische endotheliale cellen

Within the liver, lymphatic vessels are found within the portal triad, and their described function is to remove interstitial fluid from the liver to the ...