Name: analyzing the permeability of the blood-brain barrier by microbial traversal through microvascular endothelial cells
Uploaded: 2020-02-14T12:30:00
Duration: 6 min 26 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analyzing the Permeability of the Blood-Brain Barrier by Microbial Traversal through Microvascular Endothelial Cells at JoVE.com

Les auteurs reconnaissent le Dr Maryam Hussain pour ses travaux antérieurs sur cette méthode, le groupe de DP Dr. Kerstin Danker (Charité-Universit-tsmedizin, Berlin) pour avoir fourni les THBMECs et Juliane Weber pour la lecture critique du manuscrit. Cette étude a été soutenue par le RTK 2155 (ProMoAge).

1. Préparation de tampons et réactifs
<ol><li>Préparer 10x tampon de phosphate salin (10x PBS) en ajoutant 80 g de chlorure de sodium (NaCl), 2 g de chlorure de potassium (KCl), 14,4 g de disodium-hydrogène-phosphate dihydrate (Na2HPO4 - 2H2O) et 2 g de phosphate de potassium-dihydrogène (KH2PO4) dans un flacon de verre de 1 L dans 1 L de H2O. Autoclave double distillé la solution 10x PBS et diluer 100 mL de cette solution dans 900 mL d’eau double distillée pour obtenir 1x PBS.<ol>
<li>Utilisez l’autoclave pour stériliser les solutions. Mettre le flacon de verre dans le panier, fermer le couvercle et le stériliser pendant 15 min à 121 oC et 98,9 kPa. REMARQUE : Ce protocole est toujours utilisé pour l’autoclaclage des solutions dans d’autres étapes.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Préparer une solution de collagène IV de 10 g/mL et une solution de fibronectin de 10 g/mL en diluant 0,5 mg/mL de fibronectin et la solution de collagène IV de 0,3 mg/mL chacune avec 1 x PBS à 100 mg/L d’aliquots dans des microtubes de 1,5 mL. Par la suite, mélanger 100 l des deux aliquots avec 1 800 oL de 1 x PBS dans des microtubes de 2 ml et les stocker à -20 oC.</li>
	<li>Préparer le milieu DMEM/F-12 en ajoutant 4 % de sérum bovin fœtal et 2 mM de L-glutamine et 100 mg/L de pénicilline/streptomycine au milieu et le stocker à 4 oC.</li>
	<li>Préparer 1x trypsine-EDTA solution en diluant 5 ml de la 10x concentré trypsin-EDTA solution avec 45 ml de 1x PBS dans un tube de 50 ml et le stocker à 4 oC.</li>
	<li>Préparer 500 ml de lb-moyen en pesant 10 g de base de bouillon LB dans un flacon de verre de 500 ml. Ajouter 500 ml d’eau stérilisée et l’autoclave.</li>
	<li>Préparer l’agar LB en pesant 10 g de base de bouillon LB et 7,5 g d’agar-agar dans un flacon de verre de 500 ml. Ajouter 500 ml d’eau stérilisée avant d’autoclacter et ne pas fermer le couvercle du flacon. Autoclave et laisser la solution pour refroidir jusqu’à ce qu’il soit chaud au toucher.</li>
	<li>Préparer un milieu sans antibiotiques en ajoutant 4 % de sérum bovin fœtal et 2 mM de L-glutamine, mais pas de pénicilline/streptomycine au milieu DMEM/F-12 et le stocker à 4 oC comme à l’étape 1.3.</li>
</ol>2. Croissance des cellules imitant la barrière hémato-encéphalique
<ol><li>Pour assembler la plaque de 12 puits, placez les inserts de culture cellulaire dans les puits (Figure 2A).<ol>
<li>Déballez la plaque et chaque insert dans une armoire de sécurité biologique et y effectuez d’autres étapes. Utilisez des forceps stérilisés pour saisir l’insert à sa large base pour le déplacer.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Enrober la membrane poreuse de chaque insert de 90 oL de collagène IV de 10 g/mL et de 10 g/mL de mélange de fibronectin. Incuber la plaque de 12 puits pendant 24 h à 37 oC dans un incubateur de culture cellulaire (figure 2B).</li>
	<li>Laver les inserts deux fois en pipetting 1 ml de 1x PBS dans chaque insert et aspirer la solution avec une pompe à vide pour les cultures cellulaires.</li>
	<li>Équilibrez les membranes en tapotage de 0,5 ml de milieu DMEM/F-12 préchauffé dans la partie supérieure et de 1,5 mL dans la chambre inférieure. Incuber la plaque pendant 30 min à 37 oC dans un incubateur de culture cellulaire avec une atmosphère de CO2 de 5 %(figure 2C).</li>
	<li>Graine 2 x 105 cellules endothéliales microvasculaires humaines dans chaque chambre supérieure et incuber la plaque de 12 puits à 37 oC dans un incubateur de culture cellulaire (Figure 2D).<ol>
<li>Aspirez le milieu du flacon de culture cellulaire à l’aide d’une pompe à vide pour les cultures cellulaires et lavez la monocouche en pipetilant 10 ml de 1x PBS et en aspirant la solution par la suite à l’aide d’une pompe à vide.</li>
		<li>Couvrir complètement les cellules avec 1x concentré trypsine-EDTA en pipetting 5 ml de la solution dans le flacon de culture cellulaire. Incuber le flacon de 3 à 5 min à 37 oC dans un incubateur de culture cellulaire. REMARQUE : Si les cellules ne sont pas dissociées, appuyez fermement sur le flacon contre la paume de la main pour déloger les cellules.</li>
		<li>Prendre 5 ml avec une pipette comme aliquot de la suspension cellulaire dans un tube de 15 ml et ajouter 5 ml du milieu contenant du FCS pour arrêter la réaction enzymatique.</li>
		<li>Centrifuger la suspension pendant 3 min à 210 x g,retirer le supernatant à l’utilisation d’une pompe à vide et resuspendre la pastille en 5 ml de milieu avec une pipette.</li>
		<li>Utilisez le compteur cellulaire en mélangeant 10 l de la suspension cellulaire avec 10 l de tache bleu trypan de 0,4 % dans un microtube de 1,5 ml. Ajouter 10 l de mélange dans une glissière de chambre de comptage, le mettre dans le compteur cellulaire, et commencer à compter.<ol>
<li>Concentrez le compteur sur les cellules de sorte que leur bord soit bleu foncé et le blanc moyen. Par la suite, commencez le programme approprié pour le comptage cellulaire.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Pour calculer le volume de chaque insert, diviser les 2 x 105 cellules obtenues par insert avec la concentration calculée de la suspension cellulaire.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Cultivation du modèle de barrière hémato-encéphalique
<ol><li>Incuber l’assiette de 12 puits pendant 14 jours à 37 oC.</li>
	<li>Changer 0,5 ml de milieu pour la chambre supérieure et 1,5 ml de milieu pour le milieu inférieur tous les 2-3 jours. Chauffer le milieu avant de le mettre dans le flacon de la cellule. Aspirer avec la pompe à vide (Figure 2E). REMARQUE : Travaillez soigneusement pour éviter de toucher la membrane.</li>
	<li>Vérifiez l’état des cellules en les imagerie avec un microscope et de déterminer la confluence. Assurez-vous que la confluence est de 100% après 14 jours.</li>
</ol>4. Préparation des bactéries
<ol><li>Un jour avant la mesure, mettre une colonie de la souche E. coli GM2163 dans le milieu LB. Incuber le tube de culture pendant 24 h à 37 oC avec 180 tr/min dans un shaker d’incubation (Figure 2F).<ol>
<li>Cultiver la souche E. coli sur une plaque d’agar LB à 4 oC. Prenez une colonie avec un pic stérilisé et mettez le pic dans le tube de culture préparé avec 3 ml de milieu LB.</li>
		<li>Préparer une plaque d’agar LB pour chaque insert avec une solution d’agar LB chaude et remplir les plats Petri à la moitié de leur volume total. Laissez-les devenir solides et entreposez-les à 4 oC.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Traitement des cellules
<ol><li>Le jour 14 après l’ensemencement, traitez les cellules avec des composés ou mesurez la résistance électrique transendothéliale (TEER), si prévu (Figure 2G). REMARQUE: Ayez toujours quelques cellules non traitées comme un contrôle.<ol>
<li>Pour traiter les cellules avec le composé d’intérêt, diluer le composé à la concentration finale dans le milieu DMEM/F-12. Ajouter 0,5 ml de ce mélange dans la chambre supérieure et 1,5 ml dans la chambre inférieure. Incuber la plaque dans un incubateur de culture cellulaire pour le temps désiré.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ensuite, échangez le milieu complet avec un milieu sans antibiotiques en aspirant avec la pompe à vide et la tuyauterie (Figure 2H).</li>
</ol>6. Mesure de la perméabilité
<ol><li>Pour obtenir des concentrations constantes de bactéries, mesurez la densité optique à l’arme à l’automètre à une longueur d’onde de 600 nm. Diluer la solution de nuit des bactéries avec le milieu LB dans un tube de faucon de 50 ml à un OD600 de 0,5 à 0,05. Travaillez sur la glace.<ol>
<li>Remplir 1 ml de milieu LB dans une cuvette. Démarrer le photomètre et mettre la cuvette dedans, côté marqué vers l’avant. Appuyez sur le bas "Blank" pour mesurer la valeur vierge par la suite.</li>
		<li>Mesurer la densité de la solution bactérienne en la remplissant dans une cuvette, en la mettant dedans et en appuyant sur l’échantillon inférieur. Répétez la mesure pendant la dilution jusqu’à l’obtention de la concentration finale.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Travaillez dans un coffret de sécurité biologique où les bactéries peuvent être manipulées avec la plaque de 12 puits préparée et la solution bactérienne à OD600 -0,5. Ajouter 450 l de solution bactérienne seulement dans chaque chambre supérieure contenant 0,5 ml de milieu(figure 2I).</li>
	<li>Incuber la plaque de 12 puits pendant 6 h à 37 oC dans un incubateur. REMARQUE: Le protocole dicte de faire une pause ici.</li>
	<li>Échantillondez 50 l du milieu avec une pipette de chaque chambre inférieure en enlevant l’insert avec des forceps (Figure 2J). Veillez à ne pas renverser le milieu des chambres supérieures vers les chambres inférieures.</li>
	<li>Plaquer chaque échantillon sur une plaque d’agar séparée (Figure 2K). Déposer l’échantillon sur la plaque et sortir la solution à l’arme à l’écart.</li>
	<li>Incuber les plaques d’agar pendant 24 h à 37 oC dans un incubateur.</li>
	<li>Comptez les colonies dans chaque assiette (Figure 2L).</li>
</ol>7. Analyse des données
<ol><li>Écrivez les données dans un tableau et calculez l’écart moyen et standard des colonies observées de cellules traitées et non traitées.</li>
	<li>Afficher la moyenne comme le nombre absolu de colonies.<ol>
<li>Pour normaliser les résultats, calculez le nombre relatif de colonies en divisant tous les résultats avec la valeur de contrôle.</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60692/60692fig2a.jpg"> Figure 2 : Présentation détaillée des différentes étapes du protocole. (A) Mettre les inserts avec des forceps stérilisés dans la plaque de 12 puits. (B) Enrober chaque insert de 90 'L de mélange de fibronectin et de collagène IV et incuber pendant 24 h. (C) Équilibrez les membranes avec un milieu préchauffé pendant 30 min. (D) Graine 2 x 105 cellules endothéliales microvasculaires du cerveau humain par insert. (E) Cultivez la plaque pendant le temps approprié. (F) Un jour avant de mesurer, mettez une colonie d’E. coli dans un tube de culture moyenne LB et incubez pendant 24 h. (G) Traiter les cellules ou mesurer TEER. (H) Échange de milieu complet avec milieu sans antibiotiques. (I) Ajouter 450 l de solution bactérienne (OD600 à 0,5) dans chaque chambre supérieure et incuber pendant 6 h. (J) Échantillon de 50 'L de milieu de chaque chambre inférieure en levant l’insert avec des forceps. (K) Déposer l’échantillon sur des plaques d’agar et incuber pendant 24 h. (L) Comptez les colonies et analysez les données. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60692/60692fig2large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>

Les auteurs n’ont rien à révéler.

Une connaissance limitée de la pathogénie de la traversale microbienne limite le développement de thérapies pour pod ou méningite. La mortalité et la morbidité de ces maladies exigent un meilleur traitement des patients, nécessitent des recherches sur les mécanismes sous-jacents et nécessitent une plate-forme solide pour le dépistage composé. Les événements multifactoriels peuvent être étudiés avec des BMEC humains. Plusieurs procédures d’isolement signalées réussies de BMECs d’un certain nombre d’espèces ont montré une perte des caractéristiques des cellules signature moléculaire52,53. Les THBMECs décrits dans cette procédure ont été transfectés dans les passages très tôt, où ils ont exhibé les caractéristiques endothéliales spécifiques de cellules de cerveau et les ont préservés43. Ceci est important, car toutes les étapes des voies touchées n’ont pas été découvertes jusqu’à présent, et ce modèle semble imiter les BMEC classiques. Notre modèle présenté montre des influences directes sur les BMEC et la traversée microbienne à travers le BBB.
La manipulation des cellules THBMEC est simple, et l’équipement technique requis existe dans la plupart des laboratoires des sciences de la vie. Notre modèle permet un démarrage immédiat des procédures d’enquête après que les THBMEC ont construit un monocouche serré. Le domaine des applications peut être étendu en raison des combinaisons possibles entre de nouveaux tests et des essais conventionnels tels que la mesure TEER ou l’étiquetage avec des traceurs54. Il est également possible d’ajouter des astrocytes ou des péricytes pour faire un modèle de co- ou de triple culture. L’influence des médicaments sur la traversale microbienne pourrait également être testée dans notre modèle en traitant les THBMEC avec des composés avant d’inoculer la chambre haute avec des bactéries. En fait, il est possible d’acheter des inserts avec des filtres pour 96 plaques de puits permettant l’automatisation de la procédure. Cela peut faciliter la mise en œuvre de systèmes de dépistage des médicaments à haut débit afin d’accélérer la découverte de médicaments contre les maladies mentionnées et de réduire les effets secondaires sur le BBB pendant le développement du médicament.
Une étape critique dans la méthode présentée est le temps d’incubation après l’ajout des bactéries à la chambre supérieure. Il est important d’utiliser les heures comme calendriers dans le protocole, parce que le temps de génération de E. coli est seulement 20 min55. Dans le cas contraire, l’utilisation de différents points de temps pourrait conduire à des résultats trompeurs. Il existe également un risque possible de contamination entre la chambre supérieure et la chambre inférieure pendant l’exposition bactérienne si les plaques ne sont pas manipulées avec soin. Toute modification de la plaque de puits 12 à ce stade pourrait contaminer le milieu dans la chambre inférieure.
E. coli est une cause bien connue et très fréquente de méningite bactérienne. D’autres études devraient tester différentes bactéries qui sont également associées à la méningite, telles que Neisseria meningitidis56 ou Streptococcus pneumoniae57. Ceux-ci semblent utiliser différents mécanismes pour traverser le BBB et doivent être mieux compris pour le traitement des patients. Chez les patients âgés, l’incidence du POD augmente26 ainsi que le nombre de comorbidités. On sait qu’il existe des interactions entre différentes maladies, en particulier systémiques comme le diabète. Dans notre modèle, il est possible de simuler ces conditions ou de traiter les cellules avant d’ajouter les bactéries.
Le modèle est limité par le contact direct des THBMEC et des bactéries, et d’autres recherches sont nécessaires pour étudier les mécanismes potentiels de contact pour détecter les voies et les protéines impliquées. Cependant, il est possible d’enlever les inserts et de récolter les cellules pour une analyse plus approfondie. Le TEER du modèle est plus faible par rapport aux modèles de cellules souches38,39,40. Nous avons confirmé ceci en utilisant une concentration bactérienne qui n’a pas traversé le BBB dans les cellules non traitées après 6 h.
En résumé, cette méthode représente une plate-forme robuste pour analyser la traversée des bactéries à travers le BBB avec le potentiel de l’étendre pour les dépistages de médicaments à haut débit.

Le BBB humain est une limite unique du tissu cérébral, séparant le cerveau du sang. Il régule strictement le passage des molécules plus grandes et hydrophiles, bloque la diffusion paracellulaire, et maintient l’homéostasie du cerveau. Il protège également le cerveau contre les fluctuations plasmatiques, les toxines, les microbes, et guide les cellules inflammatoires dans le cadre de l’immunité du système nerveux central (SNC). Depuis sa découverte il y a un siècle1, de nombreuses études ont été réalisées pour comprendre la structure et la fonction du BBB. Les interactions complexes des cellules, des protéines et des signaux du cerveau et du sang exigent encore davantage d’investigation et de modèles.
Le BBB humain est composé de trois types de cellules : les cellules endothéliales microvasculaires du cerveau (BMECs), les péricytes, et les astrocytes2,3. Les BMEC diffèrent de la majorité des cellules endothéliales dans le corps en ce qu’ils possèdent un nombre élevé de jonctions serrées et les jonctions adhérentes4, faible activité pinocytotique2,5, et une membrane de sous-sol continue6,7 pour bloquer la diffusion paracellulaire. Les petites molécules lipophiles peuvent diffuser et passer le BBB suivant leur gradient de concentration; les molécules plus grandes et hydrophiles entrent ou ne quittent le cerveau que par des systèmes de transport sélectifs exprimés polarisés8. Ce règlement se traduit par une résistance électrique transendothéliale élevée (TEER) de 1 500 à 2 000 cm2 qui est inversement corrélée à la perméabilité9,10. Bien que les BMEC construisent une barrière serrée, ils peuvent réagir aux signaux locaux et périphériques11,12. Il existe une interaction étroite entre les BMEC et les astrocytes13; l’astrocyte pieds d’extrémité construire une couche autour des navires et induire la formation de jonctions serrées13,14. Ils sont impliqués dans la maturation de BBB avec différents facteurs, y compris la transformation du facteur de croissance -MD (TGF-MD)15,16. En outre, les péritéytes jouent un rôle clé dans la régulation de l’angiogenèse17 et dans la prévention de l’apoptosis de l’endothélium dans la différenciation cellulaire18 (Figure 1). Ils sont encastrés dans la membrane du sous-sol et assurent la stabilité structurale du mur du navire19.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60692/60692fig1.jpg"> Figure 1 : Structure schématique de la barrière hémato-encéphalique. La structure unique du BBB humain est composée de trois types de cellules différents. Le microvessel lumen est entouré de cellules endothéliales, qui sont enrichies en jonctions serrées, et ne sont pas fenestrés. Ils sont intégrés dans la membrane du sous-sol, comme les péricartes. Ces cellules sont importantes pour la stabilité structurelle de la paroi du vaisseau et jouent un rôle dans le développement du BBB à côté des astrocytes. Leurs pieds d’extrémité construisent une couche étroite autour du navire et soutiennent la construction de jonctions serrées. Tous les composants du BBB sont importants pour la fonctionnalité physiologique. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60692/60692fig1large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
De nombreuses pathologies différentes sont liées à l’effondrement du BBB (p. ex., encéphalopathie septique). Les patients affectés ont augmenté des niveaux de protéine dans le fluide céphalo-rachidien20,et le parenchyme de cerveau dans les rongeurs affectés montre une prise accrue de l’oxyde de fer colloïdal marqué et des acides aminés21,22. Ces résultats indiquent une perméabilité accrue du BBB qui se produit parallèlement à une pinocytose accrue dans les BMECs21 et l’activation endothéliale23. Une autre pathologie associée liée à un BBB modifié est la méningite, une urgence médicale et une inflammation complexe accompagnée d’un oedème cérébral qui peut conduire à la mort des cellules neuronales. Le principal site d’entrée des bactéries en circulation est censé être les micronavires24; cependant, le BBB empêche l’entrée de bactéries. La perméabilité du BBB n’est pas toujours liée à une augmentation de la méningite hématogène expérimentale25 et les mécanismes peuvent être multifactoriels. Coïncidence de la septicémie avec le délire postopératoire (POD)26 et l’association avec les infections préopératoires27,28 indique la nécessité d’un modèle bBB qui permet à l’exposition directe aux bactéries pour obtenir une meilleure compréhension de la pathogénie bactérienne.
Il existe de nombreuses lacunes dans la compréhension et la quantification de la traversée microbienne à travers le BBB. Par conséquent, nous avons développé un modèle qui permet un test pratique de différents facteurs et conditions avec une corrélation directe entre la traversale bactérienne et les influences sur la perméabilité de la BBB. Les travaux antérieurs ont porté sur la perméabilité paracellulaire et ont inclus la mesure TEER et le flux de traceur. En outre, le transport macromolécule a été analysé par des molécules ou des anticorps conjugués, par lequel différents modèles utilisant seulement des cellules endothéliales ou des combinaisons avec des astrocytes et des péricytes ont été développés. En raison de la difficulté à obtenir des tissus humains sur une base régulière, de nombreux modèles à base d’animaux sont utilisés. Les cellules endothéliales cérébrales d’origine bovine et porcine forment des monocouches serrées avec un TEER élevé qui forment une polarité apical-basale bien formée et sont adaptés pour les investigations du transport de petites molécules à travers le BBB. Les protéines diffèrent dans l’ordre de leurs homologues humains29,30, ce qui rend l’étude des anticorps thérapeutiques difficile. Pour cette raison, les modèles de culture murine ou humaine peuvent être préférables. La souris ou les rats comme sources d’échantillons ont l’avantage d’être obtenus à partir d’espèces bien caractérisées, mais produisent peu de cellules à des fins d’étude. Ceci peut être contourné par l’utilisation de l’endothéliome immortalisé de cerveau de souris (END) lignes cellulaires bEND.3, bEND.5 ou cEND31,32,33.
Les cellules cultivées primaires à partir des tissus humains sont difficiles à obtenir et à manipuler sur une base régulière. Par conséquent, la plupart des modèles cellulaires humains utilisés dans la recherche sur le BBB humain sont immortalisés lignées cellulaires endothéliales. Une lignée cellulaire publiée est la lignée cellulaire endothéliale cérébrale humaine hCMEC/D3, qui est bien adaptée pour étudier l’apport médicamenteux et est facile à manipuler. Les cellules construisent une monocouche et expriment les protéines de jonction serrées caractéristiques du BBB34, tandis que le niveau d’expression de claudin-5 est rapporté pour être inférieur à dans les micronavires intacts35 et de nombreux transporteurs spécifiques ont été détectés au niveau de transcription36 ainsi que dans les études protéomiques34. Un TEER relativement faible dans la gamme de 30-50 cm2 est toujours un défi37. Une autre source pour les cellules endothéliales de cerveau sont les cellules souches pluripotentes humaines (hPSCs)38 et les cellules souches du sang de cordon humain dérivées de l’ancêtre endothélial circulant et les lignées hématopoïétiques39,40. Les deux protocoles de différenciation donnent lieu à des monocouches cellulaires serrées et à des valeurs TEER élevées (p. ex., 1 450 cm2 dans les cocultures)38. Ces modèles de cellules souches nécessitent un soin extrême pour la culture, mais offrent la possibilité d’étudier l’influence de la régulation des hormones41 ou des maladies ayant des antécédents génétiques42 sur le développement de BBB.
Dans cette étude, nous avons établi une lignée de cellules endothéliales microvasculaires du cerveau humain immortalisée, THBMEC43, pour imiter le BBB et pour étudier la traversale bactérienne. Les cellules sont ensemoir sur un filtre et cultivées à 100% de confluence dans ce modèle de culture cellulaire. Les bactéries sont inoculées dans la partie supérieure de la chambre de culture cellulaire. Nous utilisons Escherichia coli (E. coli) dans notre étude d’échantillon en raison de l’incidence élevée de la méningite à E. coli 44. Il a été démontré que la plus faible perméabilité de la monocouche cellulaire se produit entre le jour 13 et le jour 15 après l’ensemencement45. Par conséquent, le traitement de la monocouche THBMEC est effectué après ce temps et les bactéries sont inoculées par la suite dans le milieu sur la surface apicale de la monocouche. Après un temps d’incubation, les bactéries qui ont pu traverser la barrière sont quantifiées par le biais du placage avec les bactéries sur les plaques d’agar et le comptage des colonies. Un nombre accru de colonies est en corrélation avec une traversée bactérienne plus élevée à travers le BBB. Le TEER est d’environ 70 cm246. Cependant, il n’est pas nécessaire de mesurer le TEER dans la méthode décrite. Bien qu’il s’agit d’une valeur bien établie pour la perméabilité de la BBB, il semble n’avoir aucun impact sur la traversée des bactéries à travers le BBB. Les cellules non traitées servent de contrôle de l’étanchéité dans notre modèle. Il a été démontré dans des travaux antérieurs que les cellules sont capables de réagir aux cytokines proinflammatoires et d’exprimer des protéines de jonction serrées typiques47. Cela permet le criblage composé et la validation d’un plus grand ensemble de substrats de transport et de récepteurs.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agar - Agar</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>6494.3</td>
			<td>BioScience-Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclave</td>
			<td>Systec</td>
			<td>VX-150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacteria E.coli strain GM2163</td>
			<td>Fermentas Life Sciences, Lithuania</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photometer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>6131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cells THBMEC</td>
			<td>Group of M. F. Stins</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture flasks</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>658175</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Universal 320</td>
			<td>Hettrichlab</td>
			<td>1401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen IV</td>
			<td>SIGMA Aldrich</td>
			<td>C6745</td>
			<td>from human cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess Automated Cell Counter with cell counting chamber slides and Trypan Blue stain 0.4%</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C10311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture tubes</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>191180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cuvettes</td>
			<td>BRAND</td>
			<td>759015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Di sodium hydrogen phosphate di hydrate</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>1065800500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12</td>
			<td>GIBCO/ Thermo Sc.</td>
			<td>11330032</td>
			<td>HEPES</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tubes 15 ml</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>188271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tubes 50 ml</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>227261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>GIBCO/ Thermo Sc.</td>
			<td>10270</td>
			<td>value FBS -Brazil</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>SIGMA Aldrich</td>
			<td>F0556</td>
			<td>solution human fibroblasts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heracell 150 CO2 Incubator</td>
			<td>Heraeus</td>
			<td>50116047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator shaker I 26 New Brunswick</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>M1324-0000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inoculation loop</td>
			<td>Dr. Ilona Schubert - Laborfachhandel</td>
			<td>641000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth Base</td>
			<td>GIBCO/ Thermo Sc.</td>
			<td>12780029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>GIBCO/ Thermo Sc.</td>
			<td>25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microbial incubator B 6200</td>
			<td>Heraeus</td>
			<td>51015192</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microbiological Safety Cabinet AURA 2000 M.A.C. Class II</td>
			<td>BIOAIR</td>
			<td>12469</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope inverse</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>TELAVAL 31</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro tubes 2 ml</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>72,695,400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro tubes 1,5 ml</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>72,706,400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin / Streptomycin</td>
			<td>GIBCO/ Thermo Sc.</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Dr. Ilona Schubert - Laborfachhandel</td>
			<td>464-800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Roth</td>
			<td>HN02.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium-di-hydrogen phosphate</td>
			<td>Roth</td>
			<td>P018.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Roth</td>
			<td>9265.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThinCerts + Multiwell Plates</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>665631</td>
			<td>12 well, pore size 3.0 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin - EDTA</td>
			<td>GIBCO/ Thermo Sc.</td>
			<td>15400054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuumpump Laboport</td>
			<td>KNF</td>
			<td>N 86 KT.18</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analyzing the permeability of the blood-brain barrier by microbial traversal through microvascular endothelial cells

La barrière hémato-encéphalique humaine (BBB) est caractérisée par une très faible perméabilité pour les biomolécules afin de protéger et de réguler le métabolisme du cerveau. Le BBB est principalement formé à partir de cellules endothéliales incorporées dans le collagène IV et les membranes riches en fibronectin soude. Plusieurs pathologies résultent d’un dysfonctionnement du BBB suivi d’une traversée microbienne, causant des maladies telles que la méningite. Afin de tester l’effet de plusieurs paramètres, y compris différents médicaments et anesthésiques, sur la perméabilité du BBB, nous avons établi un nouveau modèle de culture cellulaire humaine imitant le BBB avec des cellules endothéliales microvasculaires du cerveau humain. Les cellules endothéliales sont cultivées sur le collagène IV et les unités de filtre enduites de fibronectin jusqu’à la confluence et peuvent ensuite être traitées avec différents composés d’intérêt. Afin de démontrer une traversée microbienne, la chambre supérieure avec la surface apicale des cellules endothéliales est inoculée avec des bactéries. Après une période d’incubation, des échantillons de la chambre inférieure sont plaqués sur des plaques d’agar et les colonies obtenues sont comptées, ce qui correspond au nombre de colonies en corrélation avec la perméabilité du BBB. Les facteurs cellulaires endogènes peuvent être analysés dans cette configuration expérimentale afin d’élucider les mécanismes cellulaires de base des cellules endothéliales contribuant au BBB. En outre, cette plate-forme permet d’effectuer un écran pour les composés qui pourraient affecter la perméabilité des cellules endothéliales. Enfin, la traversée bactérienne peut être étudiée et liée à différentes pathologies, telles que la méningite. Il pourrait être possible d’étendre le modèle et d’analyser les voies de la bactérie à travers le BBB. Dans cet article, nous fournissons un protocole détaillé de la méthode décrite pour étudier la perméabilité du BBB.

Suivant le protocole, les cellules ont été ensecées, et le modèle BBB a été construit. Au jour 14 après l’ensemencement, les cellules ont été traitées avec le glyoxal comme aldéhyde réactif. Le but de l’expérience était d’étudier la corrélation entre l’âge et le diabète dans POD27 et l’incidence élevée de la méningite chez les patients âgés48. Les niveaux accrus des produits finaux avancés de glycation (AGEs) dans l’âge et le diabète49 exigent davantage d’examen de l’effet de la glycation dans la pathogénie de traversal microbien par le BBB. La glycation est une réaction non-enzymatique des groupes aminés libres dans les protéines avec des groupes carbonyles de réduire les glucides ou d’autres composés carbonyles. Le glucose est bien connu comme donateur de groupes de carbonyles; cependant, il y en a plus réactifs connus. Après avoir construit une base instable de Schiff, ils se réarrangent à des composés dicarbonyl plus stables et réactifs comme le glyoxal. AGEs, les produits finaux, peut provoquer des liens croisés entre les protéines50. Ils peuvent endommager les structures cellulaires et modifier la fonction cellulaire par interaction avec le récepteur des AE (RAGE)51.
Les cellules ont été traitées avec une solution glyoxal (GO) de 0,05 et 0,15 mM pendant 1 h, et les cellules non traitées ont servi de contrôle. La glycation a été détectée par immunoblotting et détection avec un anticorps anti-AGE (figure 3). Les colonies bactériennes obtenues ont été comptées et représentées comme le nombre absolu de colonies (figure 4A) ou le nombre relatif de colonies normalisées au contrôle (figure 4B). Le milieu prélevé dans les puits avec les cellules non traitées forme très peu de colonies. Ce résultat a démontré que les cellules non traitées étaient capables de construire une barrière et pouvaient servir de contrôle. Les échantillons traités au glyoxal présentaient un nombre accru de colonies, ce qui a mené à la conclusion qu’il y a un effet du glyoxal sur les THBMECetets et la densité de barrière cellulaire, parce que le nombre de colonies a démontré une différence significative entre les cellules non traitées et traitées. Le croisement bactérien accru de la barrière après le traitement avec le glyoxal pourrait expliquer pourquoi le diabète est corrélé aux maladies avec une panne de BBB.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60692/60692fig3a.jpg"> Figure 3 : Détection de la glycation protéique par immunoblotting. Les THBMEC ont été traités avec GO à différentes concentrations pendant 1 h. La protéine totale a été isolée et séparée à l’aide de SDS-PAGE. La glycation des protéines a été détectée par immunoblotting utilisant l’anti-age-anticorps (CML-26). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60692/60692fig3alarge.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
Dans un cadre différent, la glycation protéique des THBMECs a été induite par le glucose. Le glucose stérilisé a été ajouté au milieu de DMEM/F-12 pour augmenter la concentration de glucose du milieu normal de glucose (NG) avec 17.5 mM au milieu élevé de glucose (HG) avec 42.5 mM. Des THBMECs ont été cultivés dans deux flacons différents de culture cellulaire : l’un dans le milieu normal de glucose (NG) et l’autre dans le milieu de glucose élevé (HG). Ces deux supports différents ont également été utilisés pour la croissance du BBB sur des filtres dans 12 plaques de puits. Les cellules cultivées dans le milieu NG ont servi de contrôle. Les colonies obtenues sont représentées comme le nombre absolu de colonies (figure 4C) ou le nombre relatif de colonies normalisées au contrôle (figure 4D). Les résultats n’indiquent aucun effet significatif sur la traversée des bactéries par le BBB humain, menant à la conclusion que l’effet de NG contre HG n’était pas assez grave pour affecter l’intégrité du BBB. Les différents scénarios ont été conçus pour prouver le modèle et l’intégrité des cellules imitant le BBB.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60692/60692fig4d.jpg"> Figure 4 : Nombre absolu et relatif de colonies bactériennes comptées dans le modèle BBB avec thBMECs. Les THBMECs ont été traités avec 0.15 mM GO pendant 1 h, les cellules non traitées ont servi de contrôle. Un total de 450 l de suspension E. coli (OD600 - 0,5) a été ajouté à chaque chambre supérieure. Le moyen des chambres inférieures a été plaqué sur des plaques d’agar après 6 h. (A) Le graphique montre la moyenne moyenne de la SEM des colonies comptées. (B) Le graphique montre les colonies comptées normalisées aux cellules non traitées comme contrôle - / SEM (n ' 4). Dans (C) et (D), THBMECs ont été cultivés dans ng et HG milieu. Un total de 450 l de suspension E. coli (OD600 - 0,5) a été ajouté à chaque chambre supérieure. Le moyen de la chambre inférieure a été plaqué sur des plaques d’agar après 6 h. (C) Le graphique montre la moyenne moyenne de la SEM des colonies comptées. (D) Le graphique montre les colonies comptées normalisées aux cellules non traitées comme contrôle - / SEM (n ' 3). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60692/60692fig4large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Analyzing the Permeability of the Blood-Brain Barrier by Microbial Traversal through Microvascular Endothelial Cells at JoVE.com

Analyzing the Permeability of the Blood-Brain Barrier by Microbial Traversal through Microvascular Endothelial Cells

La barrière hémato-encéphalique humaine empêche sélectivement la pénétration des molécules hydrophiles et des agents pathogènes dans le cerveau. Plusieurs pathologies, y compris la méningite et le délire postopératoire, sont associées à une perméabilité accrue de la barrière hémato-encéphalique. Ici, nous décrivons un modèle de culture cellulaire endothéliale pour tester la perméabilité de barrière par traversal microbien.

Analyse de la perméabilité de la barrière hémato-encéphalique par traversale microbienne à travers les cellules endothéliales microvasculaires

The human blood-brain barrier (BBB) is characterized by a very low permeability for biomolecules in order to protect and regulate the metabolism of the ...

Cette méthode permet d’analyser la barrière céphalo-cérébrale humaine en mesurant la traversée bactérienne sur différents traitements. Il peut aider à découvrir la pathogénie de la méningite bactérienne et du délire postopératoire. Il s’agit d’une méthode simple et les effets du traitement sont directement représentés par le nombre de bactéries.Il peut être modifié pour permettre une analyse à haut débit des composés sur les cellules endothéliales. Commencez par assembler la plaque de 12 puits dans une armoire de sécurité biologique. Déballez la plaque et chaque insert, puis utilisez des forceps stérilisés pour saisir les inserts à leur base et les mettre dans les puits.Enduire la membrane poreuse de chaque insert de 90 microlitres de 10 microgrammes par microlitre de collagène IV et de mélange de fibronectine et incuber la plaque dans un incubateur de culture cellulaire à 37 degrés Celsius pendant 24 heures. Après l’incubation, lavez les inserts deux fois en pipetant un millilitre de PBS dans chaque insert et en l’aspirant à l’utilisation d’une pompe à vide. Ensuite, équilibrer les membranes par pipetting préchauffé DMEM F12 milieu dans les chambres supérieures et inférieures et incuber la plaque à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone.Pour ensemencer les cellules endothéliales microvasculaires humaines, aspirez le milieu de la fiole de culture cellulaire et lavez les cellules avec 10 millilitres de PBS. Couvrir complètement les cellules de cinq millilitres de trypsine EDTA et incuber le flacon pendant trois à cinq minutes à 37 degrés Celsius. Transférer cinq millilitres des cellules dans un tube de 15 millilitres et ajouter cinq millilitres de FCS contenant du milieu pour arrêter la réaction enzymatique.Centrifuger la suspension pendant trois minutes à 210 fois g, enlever le supernatant et resuspendre la pastille cellulaire en cinq millilitres de milieu. Ajouter 10 microlitres de la suspension cellulaire à 10 microlitres de 0,4% de tache bleue trypan, puis ajouter 10 microlitres du mélange à une chambre de comptage. Mettez la chambre de comptage dans le compteur cellulaire et commencer le programme approprié en s’assurant que le compteur est concentré.Après compter, grainez 200 000 cellules dans chaque chambre haute sur la plaque de 12 puits et incubez la plaque à 37 degrés Celsius pendant 14 jours en changeant les médias dans la chambre haute et inférieure tous les deux à trois jours. Après 14 jours, assurez-vous que la confluence cellulaire est 100% en les écreant avec un microscope. Un jour avant la mesure de la perméabilité, placez une colonie de souches d’E.coli GM2163 en trois millilitres de moyenne LB.Culture des cellules à 37 degrés Celsius pendant 24 heures dans un shaker d’incubation. Pour traiter les cellules avec un composé d’intérêt, diluer à sa concentration finale dans le milieu DMEM F12 et ajouter ce mélange dans les chambres supérieures et inférieures dans la plaque de 12 puits, puis incuber la plaque dans un incubateur de culture cellulaire. Après l’incubation, échanger le milieu complet avec un milieu sans antibiotiques.Déterminer la concentration de la culture bactérienne nocturne en mesurant sa densité optique à 600 nanomètres, puis la diluer à un OD600 de 0,5 dans un tube Falcon de 50 millilitres. Dans un cabinet de sécurité biologique, ajouter 450 microlitres de la solution bactérienne dans chaque chambre supérieure de la plaque de 12 puits, puis incuber la plaque pendant six heures à 37 degrés Celsius. Après l’incubation, retirer l’insert avec des forceps et échantillonner 50 microlitres du milieu de chaque chambre basse en prenant soin de ne pas renverser le milieu des chambres supérieures dans les chambres inférieures.Il est important de séparer strictement les médias de la chambre haute et inférieure, car un débordement des bactéries de la chambre haute entraînerait de faux résultats positifs. Déposez chaque échantillon sur une plaque d’agar séparée et striez la solution à l’à l’l’œur d’un éperon cellulaire. Incuber les plaques à 37 degrés Celsius pendant 24 heures, puis compter les colonies.Pour étudier l’effet de la glycation sur le traversal microbien par la barrière hébra-encéphalique, les cellules ont été traitées avec un 0,5 et une solution glyoxale millimolaire de 0,15 millimolar pendant une heure avec des cellules non traitées servant de contrôle. La glycation a ensuite été détectée par immunoblotting avec des anticorps anti-ÂGE. Les colonies bactériennes obtenues ont été comptées et représentées comme le nombre absolu de colonies ou le nombre relatif de colonies normalisées au contrôle.Les échantillons traités au glyoxal présentaient un nombre accru de colonies indiquant que le traitement a un effet sur la densité des barrières cellulaires. Pour étudier la glycation induite par le glucose, les THBMECs ont été cultivés dans le glucose normal et le milieu élevé de glucose. Le nombre absolu de colonies et le nombre relatif de colonies normalisées à la lutte ont indiqué que le glucose n’avait aucun effet significatif sur l’intégrité de la barrière céphalo-encéphalique.Les cellules endothéliales traitées peuvent être analysées davantage par des approches protéomiques, par exemple la spectrométrie de masse, pour analyser les changements du protéome. Cette technique aide à comprendre la barrière céphalo-cérébrale humaine et la traversée bactérienne. Il peut être utilisé pour découvrir des aspects du vieillissement et des maladies neurodégénératives telles que la maladie d’Alzheimer.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Separation of Single-stranded DNA, Double-stranded DNA and RNA from an Environmental Viral Community Using Hydroxyapatite Chromatography

Séparation de l&#39;ADN simple brin, double brin de l&#39;ADN et l&#39;ARN à partir d&#39;un environnement communautaire viral en utilisant chromatographie d&#39;hydroxyapatite

Viruses, particularly bacteriophages (phages), are the most numerous biological entities on Earth1,2.  Viruses modulate host cell abundance and diversity, ...

Recherche

Immunologie et infection

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

Après Cell-sort<em&gt; E. coli</em&gt; Après infection par le phage Lambda

The system comprising bacteriophage (phage) lambda and the bacterium E. coli has long served as a paradigm for cell-fate determination1,2. Following the ...

Generation of Recombinant Arenavirus for Vaccine Development in FDA-Approved Vero Cells

Génération de Arenavirus recombinant pour le développement de vaccins approuvés par la FDA des cellules Vero

The development and implementation of arenavirus reverse genetics represents a significant breakthrough in the arenavirus field  4. The use of cell-based ...

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Quantitative<em&gt; In vitro</em&gt; Test pour mesurer l&#39;adhésion des neutrophiles à Activé cellules endothéliales microvasculaires humaines primaires dans des conditions statiques

The vascular  endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the  acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are ...

Analyzing the Effects of Stromal Cells on the Recruitment of Leukocytes from Flow

Analyser les effets des cellules stromales sur le recrutement des leucocytes de débit

Stromal cells regulate the recruitment of circulating leukocytes during inflammation through cross-talk with neighboring endothelial cells. Here we ...

An In Vitro Model of the Blood-brain Barrier Using Impedance Spectroscopy: A Focus on T Cell-endothelial Cell Interaction

An In Vitro Model of the Blood-brain Barrier Using Impedance Spectroscopy: A Focus on T Cell-endothelial Cell Interaction

Un<em&gt; In vitro</em&gt; Modèle de la barrière hémato-encéphalique utilisant la spectroscopie d&#39;impédance: un regard sur T Cell-endothélial cellulaire Interaction

Breakdown of the blood-brain barrier (BBB) is a critical step in the development of autoimmune diseases such as multiple sclerosis (MS) and its animal ...

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Analyse des Lymphocytes extravasation L&#39;utilisation d&#39;un<em&gt; In vitro</em&gt; Modèle de la barrière hématoencéphalique humaine

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte ...

High-throughput Measurement of Plasma Membrane Resealing Efficiency in Mammalian Cells

Haut débit mesure de Membrane plasmique réapposition de sceau sur l’efficacité des cellules de mammifères

In their physiological environment, mammalian cells are often subjected to mechanical and biochemical stresses that result in plasma membrane damage. In ...

Digestion of the Murine Liver for a Flow Cytometric Analysis of Lymphatic Endothelial Cells

Digestion du foie murin pour une cytométrie de cellules endothéliales lymphatiques

Within the liver, lymphatic vessels are found within the portal triad, and their described function is to remove interstitial fluid from the liver to the ...