Name: analyzing the permeability of the blood-brain barrier by microbial traversal through microvascular endothelial cells
Uploaded: 2020-02-14T12:30:00
Duration: 6 min 26 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analyzing the Permeability of the Blood-Brain Barrier by Microbial Traversal through Microvascular Endothelial Cells at JoVE.com

המחברים מכירים ד ר מרים חוסיין על העבודה הקודמת על שיטה זו, קבוצת המשטרה ד ר קרסטין דאנקר (Charité-אוניברסיטת מדימדיצין, ברלין) לספק את THBMECs ו Juliane וובר על קריאה ביקורתית של כתב היד. מחקר זה היה נתמך על ידי RTK 2155 (מקדם-העבודה).

1. הכנת מאגר וריאגנטים
<ol><li>להכין מלוחים 10x פוספט מאגר (10x PBS) על ידי הוספת 80 g של נתרן כלוריד (הנאל), 2 גר' אשלגן כלוריד (KCl), 14.4 גרם של disodium-מימן-פוספט דימיים (Na2hpo4 · 2h2O) ו 2 גרם של אשלגן-disodium ימן פוספט (KH2PO4) ב 1 אל זכוכית בקבוקון 1 l של מזוקקים כפול H2O. אוטוקלב הפתרון 10x PBS ולדלל 100 mL של פתרון זה ב 900 מ ל של מים מזוקקים כפולים כדי לקבל 1x PBS.<ol>
<li>השתמש האוטוקלב לעקר פתרונות. שימו את הבקבוק זכוכית לתוך הסל, לסגור את המכסה ולעקר אותו 15 דקות ב 121 ° צ' ו 98.9 kPa. הערה: פרוטוקול זה משמש תמיד לפתרונות אוטוקלינג בשלבים נוספים.</li>
	</ol>
</li>
	<li>הכן 10 μg/mL קולגן IV ו 10 μg/mL fibronectin פתרון על-ידי דילול 0.5 mg/mL fibronectin פתרון ו 0.3 mg/mL קולגן הרביעי פתרון כל עם 1x PBS ל 100 mg/μL מיקרו צינורות בשנת 1.5 mL. לאחר מכן, לערבב 100 μL של שניהם ali, עם 1,800 μL של 1x PBS ב 2 מ"ל מיקרו צינורות ולאחסן אותם ב-20 ° c.</li>
	<li>הכנת DMEM דיום/F-12 בינוני על-ידי הוספת 4% סרום פרה עוברי ו 2 מ"מ L-גלוטמין ו 100 mg/L פניצילין/סטרפטומיצין למדיום ולאחסן אותו ב 4 ° c.</li>
	<li>הכינו את התמיסה 1x טריפסין-EDTA על-ידי דילול 5 מ ל של הפתרון המרוכז ב-10x של טריפסין-EDTA עם 45 mL של 1x PBS בצינור 50 mL ולאחסן אותו ב -4 ° c.</li>
	<li>להכין 500 mL של ליברות בינונית על ידי שקילה 10 גרם של בסיס מרק LB ב 500 מ ל זכוכית בקבוקון. הוסף 500 מ ל של מים מעוקר ולאחר החיטוי אותו.</li>
	<li>להכין LB אגר על ידי שקילה 10 גרם של בסיס ציר ליברות ו 7.5 גרם של אגר-אגר ב-500 mL זכוכית בקבוקון. הוסף 500 mL של מים מעוקר לפני autoclaving ללא לסגור את המכסה של הבקבוקון. אוטוקלב ולהשאיר את הפתרון להתקרר עד שהוא חם למגע.</li>
	<li>הכנת מדיום ללא אנטיביוטיקה על-ידי הוספת 4% סרום בפרה העוברי ו 2 מ"מ L-גלוטמין, אבל אין פניצילין/סטרפטומיצין אל DMEM/F-12 בינונית ולאחסן אותו ב 4 ° צ' כמו בשלב 1.3.</li>
</ol>2. צמיחה של דם-מכשול המוח מחקה תאים
<ol><li>כדי להרכיב את הצלחת 12 היטב, לשים את התרבות התאים מוסיף הבארות (איור 2א).<ol>
<li>לפרוק את הצלחת ואת כל הוספת בארון בטיחות ביולוגית ולבצע צעדים נוספים שם. השתמש מלקחיים מעוקר כדי לתפוס את ההכנסה בבסיס הרחב שלה כדי להזיז אותו.</li>
	</ol>
</li>
	<li>מעיל את הקרום הנקבובי של כל הוספה עם 90 μL של 10 μg/mL קולגן IV ו 10 μg/mL fibronectin תערובת. מודקת את הצלחת 12 היטב עבור 24 h ב 37 ° צ' בחממה לתרבות התא (איור 2ב).</li>
	<li>לשטוף את מוסיף פעמיים על-ידי ליטוף 1 מ ל של 1x PBS לתוך כל הוספת ולשאוב את הפתרון עם משאבת ואקום לתרביות תאים.</li>
	<li>הקרום על ידי ליטוף 0.5 מ ל של מדיום/F-12 בינוני בחלק העליון ו 1.5 mL בחדר התחתון. מודקת את הצלחת 30 דקות ב 37 ° c בחממה תרבות התא עם 5% CO2 אווירה (איור 2ג).</li>
	<li>זרע 2 x 105 האדם מיקרוכלי דם בתאי-הדם לתוך כל תא עליון ומודקת את הצלחת 12 היטב ב 37 ° c בחממה תרבות התא (איור 2ד).<ol>
<li>לשאוב את המדיום מתוך הבקבוקון תרבות התאים באמצעות משאבת ואקום לתרביות תאים ולשטוף את המונאולייר על ידי ליטוף 10 מ ל של 1x PBS ו לשאוב את הפתרון לאחר מכן עם משאבת ואקום.</li>
		<li>כסו את התאים לחלוטין בעזרת טריפסין מרוכז של 1 x באמצעות ליטוף 5 מ ל של הפתרון לתוך הבקבוקון של תרבות התא. מודיית את הבקבוקון עבור 3-5 דקות ב 37 ° c בחממה לתרבות התא. הערה: אם התאים אינם מאוודעים, לחץ בחוזקה על הבקבוקון כנגד כף היד כדי להוציא את התאים.</li>
		<li>לקחת 5 מ ל עם פיפטה כמו סדרת מחלקים מן ההשעיה התא בצינור 15 ml ולהוסיף 5 מ ל של fcs המכיל בינונית כדי לעצור את התגובה אנזימטית.</li>
		<li>צנטריפוגה את ההשעיה עבור 3 דקות ב 210 x g, להסיר את supernatant עם משאבת ואקום, ולהשעות מחדש את הגלולה ב 5 מ ל בינונית עם פיפטה.</li>
		<li>השתמש מונה התא על ידי ערבוב 10 μL של השעיית התא עם 10 μL של 0.4% טריפי כתם כחול בשפופרת מיקרו 1.5 mL. הוסף 10 μL של התערובת לתוך שקופית קאמרית ספירה, לשים אותו לתוך הדלפק התא, ולהתחיל ספירה.<ol>
<li>התמקד במונה על התאים כך שהקצה שלהם הוא כחול כהה והלבן האמצעי. לאחר מכן, הפעל את התוכנית המתאימה לספירת תאים.</li>
		</ol>
</li>
		<li>כדי לחשב את אמצעי האחסון לכל הוספה, חלק את התאים המתקבלים 2 x 105 להוספה עם הריכוז המחושב של השעיית התא.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. טיפוח המודל המוחי-דם
<ol><li>מודקת את הצלחת 12 היטב עבור 14 ימים ב 37 ° c.</li>
	<li>שינוי 0.5 mL של בינונית עבור החדר העליון ו 1.5 mL של בינוני עבור התחתון כל 2-3 ימים. לחמם את המדיום לפני לשים אותו בבקבוקון התא. מנושף עם משאבת ואקום (איור 2E). הערה: לעבוד בזהירות כדי להימנע מלגעת בקרום.</li>
	<li>בדוק את מצב התאים על ידי הדמיה שלהם עם מיקרוסקופ ולקבוע את השטף. ודא כי השטף הוא 100% לאחר 14 ימים.</li>
</ol>4. הכנת חיידקים
<ol><li>יום לפני מדידה, לשים מושבה של E. coli זן GM2163 לתוך מדיום LB. מודאת שפופרת התרבות במשך 24 שעות ב 37 ° צ' עם 180 סל"ד ב דגירה שייקר (איור 2F).<ol>
<li>לטפח את החיידק E. coli על צלחת ליברות אגר ב 4 ° c. קח מושבה אחת עם בוחר עקר לשים את הבחור בצינור התרבות המוכן עם 3 מ ל של LB בינונית.</li>
		<li>הכינו צלחת LB אגר עבור כל הוספה עם פתרון LB אגר חם ולמלא את מנות פטרי למחצית נפח הכולל שלהם. תן להם להפוך למוצק ולאחסן אותם ב -4 ° c.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. טיפול בתאים
<ol><li>ביום 14 לאחר זריעה, לטפל בתאים עם תרכובות או למדוד את ההתנגדות החשמלית transendoal (העגלון), אם מתוכננת (איור 2G). הערה: תמיד יש תאים לא מטופלות כפקד.<ol>
<li>כדי לטפל בתאים עם מתחם הריבית, דלל את התרכובת לריכוז הסופי במדיום DMEM/F-12. הוסיפו 0.5 מ ל של תערובת זו לתוך החדר העליון ו 1.5 mL לתוך התא התחתון. מודקת את הצלחת בחממה לתרבות התא לזמן הרצוי.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לאחר מכן, להחליף את המדיום השלם עם מדיום ללא אנטיביוטיקה על ידי מלטף עם משאבת ואקום וליטוף (איור 2H).</li>
</ol>6. מדידה של פרמאביליות
<ol><li>כדי לקבל ריכוזים קבועים של חיידקים, למדוד את הצפיפות האופטית עם פומטר באורך הגל של 600 ננומטר. לדלל את הפתרון לילה של חיידקים עם LB בינונית בצינור 50 mL הבז ל OD600 של 0.5 ± 0.05. . לעבוד על קרח<ol>
<li>מילוי 1 mL של בינוני LB לתוך קובט. התחילו את הפומטר והניחו את הקובט פנימה, מסומנים לצד קדימה. לחצו על "Blank" התחתון למדידת הערך הריק לאחר מכן.</li>
		<li>למדוד את הצפיפות של הפתרון החיידקי על ידי מילוי אותו קובט, לשים אותו, ולחיצה על המדגם התחתון. חזור על המדידה במהלך הדילול עד לקבלת הריכוז הסופי.</li>
	</ol>
</li>
	<li>עבודה בקבינט בטיחות ביולוגית שבו חיידקים יכולים להיות מטופלים עם מוכן 12 צלחת הבאר ופתרון חיידקי ב-OD600 = 0.5. הוסף 450 μL של פתרון חיידקי רק לתוך כל תא עליון המכיל 0.5 mL של בינונית (איור 2I).</li>
	<li>מודקת את הצלחת 12 היטב עבור 6 h ב 37 ° c בחממה. הערה: הפרוטוקול מכתיב לעצור כאן.</li>
	<li>לדוגמה 50 μL של המדיום עם פיפטה מכל תא תחתון על-ידי הסרת התותב עם מלקחיים (איור 2J). יש לדאוג שלא לשפוך את המדיום מהחדרים העליונים אל החלק התחתון.</li>
	<li>לוחית כל דוגמה על הצלחת אגר נפרד (איור 2K). שחרר את המדגם על הצלחת לרצף את הפתרון עם שליטת התא.</li>
	<li>מודאת צלחות אגר עבור 24 h ב 37 ° c בחממה.</li>
	<li>לספור את המושבות בכל צלחת (איור 2ל).</li>
</ol>7. ניתוח נתונים
<ol><li>כתוב את הנתונים בטבלה וחשב את סטיית הממוצע והתקן של המושבות הצפות של תאים מטופלים ובעלי מטופל.</li>
	<li>הצגת הממוצע כמספר המוחלט של המושבות.<ol>
<li>כדי לנרמל את התוצאות, חשב את המספר היחסי של מושבות על-ידי חלוקת כל התוצאות עם ערך הפקד.</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60692/60692fig2a.jpg"> איור 2: מצגת מפורטת של השלבים הבודדים בפרוטוקול. (א) לשים את מוסיף עם מלקחיים מעוקר לתוך 12 צלחת הבאר. (ב) מעיל כל הוספה עם 90 μl של fibronectin ו קולגן הרביעי תערובת ו מודלת עבור 24 שעות. (ג) הקרום הממברנות עם מדיום מחומם עבור 30 דקות (ד) זרעי 2 x 105 המוח האנושי מיקרוכלי דם מיקרו-נימי להכניס. (ה) לטפח את הצלחת למשך הזמן המתאים. (ו) יום אחד לפני המדידה, לשים E. coli המושבה לתוך שפופרת התרבות בינונית LB ו דגירה עבור 24 h. (G) לטפל בתאים או למדוד העגלון. (ח) Exchange בינוני מלא עם מדיום ללא אנטיביוטיקה. (I) להוסיף 450 μl של פתרון בקטריאלי (OD600 = 0.5) לתוך כל תא עליון ו-דגירה עבור 6 h. (J) לדוגמה 50 μl של בינוני מכל תא תחתון הסרת הוספת מלקחיים. (K) הצלחת המדגם על צלחות אגר ו הדגירה עבור 24 h. (L) לספור את המושבות ולנתח את הנתונים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60692/60692fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>

. למחברים אין מה לגלות

תובנה מוגבלת לתוך הפתוגנזה של לחציית חיידקים מגביל התפתחות נוספת של טיפולים POD או דלקת קרום הריאה. התמותה והתחלואה של מחלות אלו דורשות טיפול טוב יותר במטופלים, מחייבים מחקר על המנגנונים הבסיסיים, וזקוקים לפלטפורמה איתנה להקרנה מורכבת. ניתן ללמוד את האירועים רב-עצרת עם BMECs של האדם. מספר נוהלי בידוד מוצלחים של bmecs ממספר מינים הראו אובדן של מאפייני התאים חתימה מולקולרית52,53. THBMECs המתוארים בהליך זה היו מזוהמים בפסקאות מוקדמות מאוד, שם הם הציגו מאפיינים ספציפיים של תא במוח העצם ושמרו אותם43. זה חשוב, כי לא כל השלבים במסלולים המושפעים התגלו עד כה, ומודל זה נראה לחקות BMECs קונבנציונלי. המודל המוצג שלנו מראה השפעות ישירות על מסכת ה-BMECs והעברת החיידקים דרך BBB.
הטיפול בתאי THBMEC הוא פשוט, והציוד הטכני הנדרש קיים ברוב מעבדות מדעי החיים. המודל שלנו מאפשר התחלה מיידית של הליכי חקירה לאחר THBMECs בנו מונאולייר הדוק. שדה היישומים יכול להיות נרחב בגלל השילובים האפשריים בין בדיקות חדשות ומוסר קונבנציונאלי כגון מדידה העגלון או תיוג עםמ54. ניתן גם להוסיף האסטרוציטים או קרום הלב כדי ליצור מודל שיתוף או תרבות משולשת. השפעת התרופות על הבקטריה יכולה להיבדק גם במודל שלנו על-ידי טיפול ב-THBMECs עם תרכובות לפני התייחסות לחדר העליון עם חיידקים. למעשה, ניתן לרכוש מוסיף עם מסננים עבור 96 היטב צלחות המאפשרות אוטומציה של ההליך. זה יכול להקל על יישום של מערכות סינון סמים בתפוקה גבוהה כדי להאיץ את גילוי הסמים נגד המחלות המוזכרות ולהפחית תופעות לוואי על BBB במהלך פיתוח התרופה.
שלב קריטי בשיטה המוצגת הוא זמן הדגירה לאחר הוספת החיידקים לחדר העליון. חשוב להשתמש בשעות כצירי זמן בפרוטוקול, מכיוון שזמן הדור של E. coli הוא רק 20 דקות55. אחרת, השימוש בנקודות זמן שונות עלול להוביל לתוצאות מטעה. יש גם סיכון אפשרי של זיהום בין התא העליון והתחתון במהלך החשיפה חיידקי אם הצלחות לא מטופלים עם טיפול. כל שינוי לצלחת 12 הבאר בשלב זה יכול לזהם את המדיום בתא התחתון.
E. coli הוא אחד ידוע, הגורם הנפוץ מאוד של דלקת הקרום החיידק. חקירות נוספות צריך לבדוק חיידקים שונים הקשורים גם דלקת קרום הריאה, כגון מנינגקוקוס56 או סטרפטוקוקס דלקת ריאותה57. אלה נראים להשתמש מנגנונים שונים כדי לחצות את BBB וצריך להיות הבינו טוב יותר לטיפול בחולים. בחולים קשישים, השכיחות של POD מגביר את26 , כמו גם את מספר המתרחש בתחלואה. ידוע כי קיימים אינטראקציות בין מחלות שונות, במיוחד כאלה מערכתית כמו סוכרת. במודל שלנו, ניתן לדמות תנאים אלה או לטפל בתאים לפני הוספת החיידקים.
המודל מוגבל על ידי מגע ישיר של THBMECs וחיידקים, ומחקר נוסף הכרחי כדי לחקור מנגנונים פוטנציאליים של מגע כדי לזהות את מסלולים מעורבים וחלבונים. עם זאת, ניתן להסיר מוסיף ולקצור את התאים לניתוח נוסף. העגלון של המודל הוא נמוך יותר לעומת מודלים תא גזע38,39,40. אנו מאשרים זאת באמצעות ריכוז חיידקי כי לא חצה את BBB בתאים לא מטופל אחרי 6 h.
לסיכום, שיטה זו מייצגת פלטפורמה חזקה לניתוח החציית החיידקים באמצעות BBB עם הפוטנציאל להרחיב אותה לצורך הקרנת תרופות בתפוקה גבוהה.

BBB האנושי הוא גבול ייחודי של רקמת המוח, המפריד את המוח מהדם. זה בהחלט מווסת את המעבר של מולקולות גדולות והידרופילית, חוסם הפרפוזיות, ושומר על הומאוסטזיס המוח. הוא גם מגן על המוח מפני תנודות פלזמה, רעלים, חיידקים, ומדריכים תאים דלקתיים כחלק ממערכת העצבים המרכזית (CN) חסינות. מאז גילויו לפני מאה שנה1, מחקרים רבים בוצעו כדי להבין את המבנה והתפקוד של bbb. האינטראקציות המורכבות של תאים, חלבונים ואותות מתוך ביקוש המוח והדם עדיין בחקירה ובמודלים נוספים.
Bbb האנושי מורכב משלושה סוגי תאים: תאי המוח מיקרוכלי דם אנדותל (bmecs), קרום הלב, ו אסטרוציטים2,3. ה-bmecs שונים מרוב תאי האנדותל בגוף בכך שהם בעלי מספר גבוה של צמתים הדוקים וצמתים מקומדים4, פעילות pinocytotic נמוכה2,5, וממברנה מרתף רציפה6,7 כדי לחסום דיפוזיה. מולקולות ליפופילית קטנות יכולות לפזר ולעבור את BBB בעקבות מעבר הריכוז שלהם; גדול יותר ומולקולות הידרופיאליות להיכנס או לעזוב את המוח רק באמצעות מקוטב הביע מערכות תעבורה סלקטיבית8. תקנה זו גורמת להתנגדות חשמלית גבוהה של טראנסנדותל (העגלון) של 1500-2000 Ω · ס מ2 שהוא בקורלציה הפיכה לחדירות9,10. למרות bmecs לבנות מכשול חזק, הם יכולים להגיב על אותות מקומיים והיקפיים11,12. יש אינטראקציה קרובה בין bmecs ו אסטרוציטים13; the אסטרוציט קצה הרגליים לבנות שכבה סביב כלי הדם ולגרום היווצרות של צמתים הדוקים13,14. הם מעורבים התבגרות bbb עם גורמים שונים, כולל שינוי מקדם צמיחה-β (tgf-β)15,16. בנוסף, ממלאים לקרום החזה תפקיד מרכזי בוויסות האנגיוגנזה17 ומניעת אפופטוזיס של האנדותל בבידול תאי18 (איור 1). הם משובצים בקרום המרתף ומספקים יציבות מבנית של קיר הספינה19.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60692/60692fig1.jpg"> איור 1: מבנה סכימטי של מכשול המוח בדם. המבנה הייחודי של BBB האנושי מורכב משלושה סוגי תאים שונים. לומן המיקרוכלי מוקף בתאי אנדותל, אשר מועשרים בצמתים הדוקים, ואינם מדורגים. , הם משובצים בקרום המרתף. כמו בקרום הלב תאים אלה חשובים עבור יציבות מבנית של הקיר כלי ולשחק תפקיד בפיתוח של BBB ליד האסטרוציטים. הרגליים הקצה שלהם לבנות שכבה קרובה סביב הכלי ולתמוך את הבניין של צמתים הדוקים. כל הרכיבים של BBB חשובים לפונקציונליות פיזיולוגית. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60692/60692fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
פתווגיות שונות רבות קשורות התמוטטות של BBB (למשל, ספיגה אנצפלופתיה). החולים המושפעים הגדילו את רמות החלבון בנוזל השדרה20, ואת המוח בתוך מכרסמים מושפעים מראה ספיגה מוגברת של תחמוצת הברזל המסומנים ברזל וחומצות אמינו21,22. תוצאות אלו מצביעות לקראת חדירות מוגברת של BBB המתרחשת לצד פינוציטוזה מוגברת ב-BMECs21 והפעלת אנדותל23. מחלה נוספת הקשורה ב-BBB משתנה היא דלקת קרום המוח, חירום רפואי ודלקת מורכבת המלווה בבצקת מוחית שיכולה להוביל למוות של תאים עצביים. אתר הכניסה העיקרי של חיידקים במחזור אמור להיות מיקרואוניות24; עם זאת, BBB מונע כניסת חיידקים. החדירות של BBB אינו מקושר תמיד לגידול בדלקת קרום העין המטסוגגניים25 והמנגנון יכול להיות רב עצרת. צירוף מקרים של אלח דם עם הזיות לאחר הניתוח (POD)26 ואת הקשר עם זיהומים טרום ניתוח27,28 מציין את הצורך במודל bbb המאפשר חשיפה ישירה חיידקים כדי לקבל הבנה טובה יותר בפתוגנזה חיידקית.
יש הרבה פערים בהבנת החיידקים וכביכמת העוברים דרך BBB. לכן, פיתחנו מודל המאפשר בדיקה נוחה של גורמים ותנאים שונים עם קשר ישיר בין חציית החיידקים והשפעות על החדירות של BBB. העבודה הקודמת התמקדה חדירות הפרתאי וכללה מדידה הטיר ו שטף מעקב. בנוסף, המקרומולקולה התחבורה נותחו על ידי מולקולות או נוגדנים מצובית, לפיה דגמים שונים המשתמשים רק בתאי האנדותל או בשילובים עם האסטרוציטים וקרום הלב פותחו. בשל הקושי בהשגת רקמה אנושית על בסיס קבוע, נעשה שימוש בדגמים רבים המבוססים על חיות. בתאי המוח מקור של שור ו חזירי טופס מוצא הדוק עם כייר גבוה שיוצרים היטב בצורת קוטביות apical-בסיס מתאימים לחקירות של מולקולה קטנה הובלה דרך bbb. החלבונים שונים ברצף מhomologues האנושיים שלהם29,30, ביצוע חקירה של נוגדנים טיפולית קשה. מסיבה זו, ייתכן שתהיה עדיפות למודלים של מורנה או של התרבות האנושית. עכבר או חולדות כמו מקורות לדוגמה יש את היתרון של להיות מושגת מינים מאופיין אך תשואה כמה תאים למטרות לימוד. זה יכול להיות מוקף על ידי שימוש של המוח עכבר מונצח אנדותל (סוף) קווי תא לכופף. 3, להתכופף .5 או cend31,32,33.
תאים מתורבתים ראשוניים מרקמת האדם קשים להשגה ולטיפול בקביעות. לכן, רוב הדגמים הסלולריים האנושיים המשמשים במחקר חקירת ה-BBB האנושי הם שורות תא מונצח. קו התא שפורסם הוא המוח האנושי מיקרוסקולרית קו התאים הכדורית/D3, אשר מתאים גם ללמוד ספיגת סמים והוא קל לטפל. התאים לבנות דופלקס ולבטא את החלבונים האופייניים הצומת הדוק של bbb34, ואילו רמת הביטוי של קלודין-5 מדווחת להיות נמוך יותר מאשר במיקרו מיקרואוניות35 ומובילים ספציפיים רבים זוהו ב תעתיק רמה36 כמו גם במחקרים פרוטאומית34. בעלי מנוע נמוך יחסית בטווח של 30-50 Ω · ס"מ2 הוא עדיין אתגר37. מקור נוסף לתאי המוח באנדותל הם תאי גזע בעלי עוצמה של האדם (hPSCs)38 ותאי גזע אנושיים בעלי השפעה של מחזורי מחולל שורש, ולינבטיים39,40. שני הפרוטוקולים של בידול התוצאה בתא הדוקה monolayers וערכי העגלון גבוה (g., 1,450 Ω · cm2 ב שיתוף תרבויות)38. אלה מודלים תא גזע דורשים טיפול קיצוני לטיפוח, עדיין מציעים את ההזדמנות ללמוד את ההשפעה של ויסות הורמונים41 או מחלות עם רקעים גנטיים42 על פיתוח bbb.
במחקר זה, הקמנו מוהקים המוח האנושי מיקרוכלי שורה של תא בשיטת מיקרו-דם, THBMEC43, כדי לחקות את bbb וללמוד חציית חיידקים. תאים נזרע על מסנן וגדלו ל 100% השטף במודל זה של תרבות התא. החיידק מחוסן בחלקו העליון של חדר התרבות של התא. אנו משתמשים ב- es, coli (E. coli) במחקר לדוגמה שלנו בגלל השכיחות הגבוהה של E. coli דלקת קרום השכל44. הוכח כי החדירות הנמוכות ביותר של תא מונאולייר מתרחשת בין יום 13 ליום 15 לאחר זריעת45. לכן, הטיפול במונאולייר של THBMEC מבוצע לאחר זמן זה וחיידקים מחוסנת לאחר מכן במדיום על פני השטח הרשמי של המונאולייר. לאחר זמן דגירה, חיידקים שהיו מסוגלים לחצות את המכשול הם כימות באמצעות ציפוי בינוני עם החיידקים על צלחות אגר וספירת המושבות. מספר גדל של מושבות התואם לחציית חיידקים גבוהה יותר דרך BBB. העגלון הוא על 70 Ω · ס"מ246. עם זאת, אין צורך למדוד את העגלון בשיטה המתוארת. למרות שזהו ערך מבוסס על החדירות של BBB, נראה שאין לו כל השפעה על החציית החיידקים באמצעות BBB. תאים לא מטופלות לשמש שליטה של האטימות במודל שלנו. זה הוכח בעבודה הקודמת כי התאים מסוגלים להגיב על ציטוקינים proinflammatory ו לבטא אופייניה47חלבונים הצומת הדוק. זה מאפשר הקרנה מורכבת ואימות של קבוצה גדולה יותר של מצעים טרנספורטר וקולטנים.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agar - Agar</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>6494.3</td>
			<td>BioScience-Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclave</td>
			<td>Systec</td>
			<td>VX-150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacteria E.coli strain GM2163</td>
			<td>Fermentas Life Sciences, Lithuania</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photometer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>6131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cells THBMEC</td>
			<td>Group of M. F. Stins</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture flasks</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>658175</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Universal 320</td>
			<td>Hettrichlab</td>
			<td>1401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen IV</td>
			<td>SIGMA Aldrich</td>
			<td>C6745</td>
			<td>from human cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess Automated Cell Counter with cell counting chamber slides and Trypan Blue stain 0.4%</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C10311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture tubes</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>191180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cuvettes</td>
			<td>BRAND</td>
			<td>759015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Di sodium hydrogen phosphate di hydrate</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>1065800500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12</td>
			<td>GIBCO/ Thermo Sc.</td>
			<td>11330032</td>
			<td>HEPES</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tubes 15 ml</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>188271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tubes 50 ml</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>227261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>GIBCO/ Thermo Sc.</td>
			<td>10270</td>
			<td>value FBS -Brazil</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>SIGMA Aldrich</td>
			<td>F0556</td>
			<td>solution human fibroblasts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heracell 150 CO2 Incubator</td>
			<td>Heraeus</td>
			<td>50116047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator shaker I 26 New Brunswick</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>M1324-0000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inoculation loop</td>
			<td>Dr. Ilona Schubert - Laborfachhandel</td>
			<td>641000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth Base</td>
			<td>GIBCO/ Thermo Sc.</td>
			<td>12780029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>GIBCO/ Thermo Sc.</td>
			<td>25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microbial incubator B 6200</td>
			<td>Heraeus</td>
			<td>51015192</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microbiological Safety Cabinet AURA 2000 M.A.C. Class II</td>
			<td>BIOAIR</td>
			<td>12469</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope inverse</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>TELAVAL 31</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro tubes 2 ml</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>72,695,400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro tubes 1,5 ml</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>72,706,400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin / Streptomycin</td>
			<td>GIBCO/ Thermo Sc.</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Dr. Ilona Schubert - Laborfachhandel</td>
			<td>464-800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Roth</td>
			<td>HN02.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium-di-hydrogen phosphate</td>
			<td>Roth</td>
			<td>P018.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Roth</td>
			<td>9265.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThinCerts + Multiwell Plates</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>665631</td>
			<td>12 well, pore size 3.0 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin - EDTA</td>
			<td>GIBCO/ Thermo Sc.</td>
			<td>15400054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuumpump Laboport</td>
			<td>KNF</td>
			<td>N 86 KT.18</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analyzing the permeability of the blood-brain barrier by microbial traversal through microvascular endothelial cells

מחסום הדם-מוח האנושי (BBB) מאופיין בחדירות נמוכות מאוד לbiomolecules על מנת להגן ולווסת את חילוף החומרים של המוח. BBB הוא בעיקר מתוך תאים אנדותל מוטבע קולגן הרביעי ו fibronectin-המרתף עשיר ממברנות. מספר פתווגיות נובעות מתפקוד של BBB ואחריו לחציית מחיידקים, גרימת מחלות כגון דלקת קרום העין. כדי לבחון את ההשפעה של פרמטרים מרובים, כולל תרופות שונות והרדמה, על החדירות של BBB הקמנו מודל התרבות התא האנושי הרומן מחקה את BBB עם המוח האנושי מיקרוכלי דם אנדותל. התאים האנדותל הם גדלו על קולגן IV ו-fibronectin מצופה יחידות מסנן עד למפגש והוא יכול להיות מטופלים עם תרכובות שונות של ריבית. על מנת להדגים את השטח, החדר העליון עם המשטח הפנימי של תאי האנדותל מחוסן בפני חיידקים. לאחר תקופת דגירה, מצופה דגימות של החדר התחתון על לוחות אגר והמושבות המתקבלות נספרות, ובכך מספר המושבות מתאם את החדירות של BBB. ניתן לנתח את גורמי הסלולר האנדוגניים בהגדרה ניסיונית זו כדי להבהיר מנגנונים סלולאריים בסיסיים של תאי האנדותל התורמים ל-BBB. בנוסף, פלטפורמה זו מאפשרת ביצוע מסך עבור תרכובות שעלולות להשפיע על חדירות התאים האנדותל. לבסוף, ניתן לחקור ולקשר בין הפתווגיות שונות, כגון דלקת קרום העין. זה יכול להיות אפשרי להאריך את המודל ולנתח את המסלולים של החיידקים דרך BBB. במאמר זה, אנו מספקים פרוטוקול מפורט של השיטה המתוארת לחקור את החדירות של BBB.

בעקבות הפרוטוקול, התאים הופרה, ומודל BBB נבנה. ביום 14 לאחר זריעה, התאים טופלו glyoxal כמו אלדהיד תגובתי. מטרת הניסוי הייתה לחקור את הקורלציה בין גיל וסוכרת ב POD27 ואת השכיחות הגבוהה של דלקת קרום השכל בחולים קשישים48. הרמות הגבוהות של מוצרים מתקדמים לסיום הגליקטיון (גילאי) בגיל וסוכרת49 דורשים בדיקה נוספת של השפעת גליקטיון בפתוגנזה של חציית חיידקים דרך bbb. גליקטיון היא תגובה לא-אנזימטית של קבוצות אמינו חופשיות בחלבונים עם שימוש בקבוצות קרבונקסיל, הפחתת פחמימות או תרכובות קרבונקסיל אחרות. גלוקוז ידוע היטב כתורם לקבוצות קרבונקסיל; עם זאת, יש יותר תגובתי מוכרות. לאחר בניית בסיס של שיף לא יציב, הם מסדרים מחדש לתרכובות דיקרבקסיל יציבות ותגובתי יותר כמו glyoxal. הגילאים, המוצרים הסופיים, יכול לגרום לקרוס קישורים בין חלבונים50. הם יכולים לפגוע במבנים סלולריים ולשנות את הפונקציה התאית על ידי אינטראקציה עם קולטן של גילאי (זעם)51.
תאים טופלו עם 0.05 ו 0.15 mM glyoxal (GO) פתרון עבור 1 h, תאים לא מטופלים שימשו כפקד. גליקטיון זוהה באמצעות מאבחן חיסוני וזיהוי עם נוגדן נגד גיל (איור 3). המושבות החיידקית המתקבלות נספרו והוצגו כמספר המוחלט של מושבות (איור 4א) או מספר המושבות היחסי הנורמלי לשליטה (איור 4ב'). המדיום נלקח מבארות עם תאים לא מטופל יצרו מושבות מעטים מאוד. תוצאה זו הוכיחה כי תאים לא מטופל הצליחו לבנות מכשול והוא יכול לשמש כפקד. דגימות שטופלו glyoxal הציג מספר גדל של מושבות, המוביל למסקנה כי יש השפעה של glyoxal על THBMECs ואת צפיפות המכשול הסלולר, כי מספר המושבות הפגינו הבדל משמעותי בין תאים לא מטופלים וטופלו. המעבר חיידקי מוגבר של המכשול לאחר הטיפול עם glyoxal יכול להסביר מדוע סוכרת מתואם מחלות עם התמוטטות BBB.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60692/60692fig3a.jpg"> איור 3: זיהוי גליקטיון חלבונים באמצעות החיסונית. THBMECs טופלו עם GO בריכוזים שונים עבור 1 h. חלבון סה כ היה מבודד והופרד באמצעות SDS-PAGE. גליקטיון של החלבונים זוהה באמצעות חיסוני האנטי-אייג '-הנוגדן (CML-26). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60692/60692fig3alarge.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
בסביבה אחרת, החלבון של THBMECs נגרם על ידי גלוקוז. גלוקוז מעוקר נוספה כדי Dמאמ/F-12 בינונית כדי להגביר את ריכוז הגלוקוז ממדיום גלוקוז רגיל (NG) עם 17.5 מ"מ בינוני גלוקוז גבוה (HG) עם 42.5 mM. THBMECs היו מעובדים בשני מבחנות שונות של תרבות התא: אחד ב גלוקוז רגיל (NG) בינונית והשני במדיום גבוהה (HG). שני מדיה שונים אלה שימשו גם לצמיחה של BBB על מסננים ב 12 צלחות היטב. תאים שטיפחו במדיום NG שימשו כבקרת. המושבות המתקבלות מיוצגות כמספר מוחלט של מושבות (איור 4ג) או המספר היחסי של המושבות הנורמלות לשליטה (איור 4ד). התוצאות מצביעות על השפעה משמעותית על החציית החיידקים באמצעות BBB האנושי, המוביל למסקנה כי ההשפעה של NG נגד HG לא היתה חמורה מספיק כדי להשפיע על שלמות של BBB. התרחישים השונים תוכננו כדי להוכיח את המודל ואת שלמות התאים מחקה את BBB.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60692/60692fig4d.jpg"> איור 4: מספר מוחלט ויחסי של מושבות חיידקיים שנספרו במודל BBB עם THBMECs. THBMECs טופלו עם 0.15 mM GO עבור 1 h, תאים לא מטופלים שימשו כפקד. סך של 450 μL של E. coli ההשעיה (OD600 = 0.5) התווסף כל תא עליון. בינוני מן התאים הנמוכים היה מצופה על צלחות אגר לאחר 6 ה. (א) הגרף מראה את הממוצע ממוצע +/-SEM של המושבות נספר. (ב) הגרף מציג את המושבות הנספרות הנורמלות לתאים שאינם מטופלות כפקד +/-SEM (n = 4). ב (ג) ו-(ד), thbmecs היו מעובדים בינוני וכספית. סך של 450 μL של E. coli ההשעיה (OD600 = 0.5) התווסף כל תא עליון. בינוני מהתא התחתון היה מצופה על צלחות אגר לאחר 6 h. (ג) הגרף מראה את הממוצע הממוצעים +/-SEM של מושבות שנספרו. (ד) הגרף מציג את המושבות הנספרות הנורמלות לתאים שאינם מטופלות כפקד +/-SEM (n = 3). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60692/60692fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Analyzing the Permeability of the Blood-Brain Barrier by Microbial Traversal through Microvascular Endothelial Cells at JoVE.com

Analyzing the Permeability of the Blood-Brain Barrier by Microbial Traversal through Microvascular Endothelial Cells

מחסום הדם-מוח האנושי באופן סלקטיבי מונע חדירה של מולקולות הידרופילית ופתוגנים לתוך המוח. מספר פתווגיות, כולל דלקת קרום המוח והזיות פוסט-אופרטיביות, קשורות לחדירות מוגברות של מחסום הדם-מוחי. כאן, אנו מתארים מודל של התרבות התא האנדותל כדי לבדוק את חדירות המכשול על ידי החציית מחיידקים.

ניתוח חדירות של מכשול המוח-הדם על ידי חציית מיקרודם באמצעות תאי מיקרו-כלי

The human blood-brain barrier (BBB) is characterized by a very low permeability for biomolecules in order to protect and regulate the metabolism of the ...

שיטה זו מאפשרת לנתח את מחסום הדם - מוח האנושי על ידי מדידת חציית חיידקים על טיפולים שונים. זה עשוי לעזור לגלות את הפתוגנזה של דלקת קרום המוח חיידקי הזיות לאחר הניתוח. זוהי שיטה פשוטה ואת ההשפעות של הטיפול מיוצגים ישירות על ידי מספר החיידקים.זה יכול להיות שונה כדי לאפשר ניתוח תפוקה גבוהה של תרכובות על התאים אנדותל. התחל בהרכבת צלחת 12 בארות בארון בטיחות ביולוגי. לפרוק את הצלחת וכל הכנס, ולאחר מכן להשתמש מדפים מעוכלים לתפוס את המכניסים בבסיס שלהם ולשים אותם לתוך בארות.מצפים את הממברנה הנקבובית של כל הכנס עם 90 מיקרוליטרים של 10 מיקרוגרם לכל קולגן מיקרוליטר IV ותערובת פיברונקטין ו דגירה את הצלחת באינקובטור תרבות התא ב 37 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות. לאחר הדגירה, לשטוף את מוסיף פעמיים על ידי צינור מיליליטר אחד של PBS לתוך כל הכנס ושואב אותו עם משאבת ואקום. לאחר מכן לצייד את הממברנות על ידי צינורות DMEM F12 מראש המלחמה בינוני בתאים העליונים והתחתונים להדגיר את הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני.כדי לזרוע את תאי ה אנדותל מיקרווסקיים אנושיים, שאפו את המדיום מבקבוק תרבות התאים ושטפו את התאים עם 10 מיליליטר של PBS. מכסים את התאים לחלוטין עם חמישה מיליליטר של טריפסין EDTA ו דגירה הבקבוק במשך שלוש עד חמש דקות ב 37 מעלות צלזיוס. להעביר חמישה מיליליטר של התאים לתוך צינור 15 מיליליטר ולהוסיף חמישה מיליליטר של FCS המכיל בינוני כדי לעצור את התגובה אנזימטית.צנטריפוגה ההשעיה במשך שלוש דקות ב 210 פעמים g, להסיר את supernatant ולתלות את גלולת התא בחמישה מיליליטר של מדיום. הוסיפו 10 מיקרוליטרים של מתלי התא ל-10 מיקרוליטרים של כתם כחול 0.4%, ולאחר מכן הוסיפו 10 מיקרוליטרים של התערובת לתא ספירה. שים את תא הספירה לתוך מונה התאים והתחל את התוכנית המתאימה כדי לוודא שהדלפק ממוקד.לאחר הספירה, זרע 200, 000 תאים לתוך כל תא עליון על הצלחת 12 היטב דגירה הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס במשך 14 ימים שינוי התקשורת בתא העליון והתחתון כל יומיים עד שלושה ימים. לאחר 14 ימים, ודא כי קונפליונציית התא היא 100%על ידי דימות אותם עם מיקרוסקופ. יום אחד לפני מדידת חלילות, לשים מושבה אחת של זן E.coli GM2163 לתוך שלושה מיליליטר של מדיום LB.תרבו את התאים ב-37 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות בשייקר דגירה. כדי לטפל בתאים עם תרכובת של ריבית, לדלל אותו לריכוז הסופי שלה בגודל DMEM F12 ולהוסיף תערובת זו לתאים העליונים והתחתונים בצלחת 12 היטב, ולאחר מכן לדגר את הצלחת באינקובטור תרבות התא. לאחר הדגירה, להחליף את המדיום המלא עם מדיום ללא אנטיביוטיקה.לקבוע את הריכוז של תרבות החיידקים לילה על ידי מדידת הצפיפות האופטית שלה ב 600 ננומטר, ולאחר מכן לדלל אותו OD600 של 0.5 בצינור פלקון 50 מיליליטר. בארון בטיחות ביולוגי, מוסיפים 450 מיקרוליטרים של פתרון החיידקים לכל תא עליון של צלחת 12 בארות, ואז דגירה את הצלחת במשך שש שעות ב 37 מעלות צלזיוס. לאחר הדגירה, להסיר את הכנס עם מדפים מדגם 50 microliters של המדיום מכל תא תחתון דואג לא לשפוך את המדיום מן התאים העליונים לתוך התחתונים.חשוב להפריד בקפדנות את התקשורת של התא העליון והתחתון כמו זליגה מחיידקים של התא העליון יוביל לתוצאות חיוביות שגויות. זרוק כל דגימה על צלחת אגר נפרדת פסים הפתרון עם מפזר תאים. דגירה הצלחות ב 37 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות, ואז לספור את המושבות.כדי לחקור את ההשפעה של glycation על חצייה מיקרוביאלית דרך מחסום הדם - מוח, תאים טופלו עם 0.5 ו 0.15 מילימולר גליוקסל פתרון במשך שעה אחת עם תאים מטופלים המשמשים פקד. לאחר מכן התגלה הגליקציה באמצעות אימונובלוט עם נוגדנים אנטי-AGE. המושבות החיידקיות שהושגו נספרו והוצגו כמספר המוחלט של מושבות או כמספר המושבות היחסי שנורמלו לשליטה.דגימות שטופלו גליוקסל הציגו מספר גדל והולך של מושבות המציין כי הטיפול יש השפעה על צפיפות מחסום הסלולר. כדי לחקור את גליקציה חלבון הנגרמת על ידי גלוקוז, THBMECs היו מעובדים גלוקוז נורמלי בינוני גלוקוז גבוה. המספר המוחלט של המושבות והמספר היחסי של מושבות מנורמלות לשליטה הצביעו על כך שלגלוקוז לא הייתה השפעה משמעותית על שלמות מחסום הדם - מוח.תאים אנדותל מטופלים ניתן לנתח עוד יותר על ידי גישות פרוטומיקה, למשל ספקטרומטריית מסה, כדי לנתח שינויים בפרוטאום. טכניקה זו מסייעת בהבנת מחסום הדם - מוח האנושי וחוצה חיידקים. זה עשוי לשמש כדי לגלות היבטים של הזדקנות ומחלות ניווניות כגון מחלת אלצהיימר.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Separation of Single-stranded DNA, Double-stranded DNA and RNA from an Environmental Viral Community Using Hydroxyapatite Chromatography

ההפרדה של ה-DNA חד גדילי, פעמיים תקועים DNA ו-RNA מהקהילה ויראלי הסביבה באמצעות כרומטוגרפיה hydroxyapatite

Viruses, particularly bacteriophages (phages), are the most numerous biological entities on Earth1,2.  Viruses modulate host cell abundance and diversity, ...

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

בעקבות Cell-גורל ב<em&gt; א coli</em&gt; לאחר זיהום על ידי phage מבדה

The system comprising bacteriophage (phage) lambda and the bacterium E. coli has long served as a paradigm for cell-fate determination1,2. Following the ...

Generation of Recombinant Arenavirus for Vaccine Development in FDA-Approved Vero Cells

דור של Arenavirus רקומביננטי לפיתוח חיסון בתאי Vero-FDA

The development and implementation of arenavirus reverse genetics represents a significant breakthrough in the arenavirus field  4. The use of cell-based ...

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

כמותי<em&gt; במבחנה</em&gt; Assay כדי למדוד הידבקות נויטרופילים לתאים מופעלים עיקריים אדם אנדותל כלי הדם בתנאים סטטיים

The vascular  endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the  acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are ...

Analyzing the Effects of Stromal Cells on the Recruitment of Leukocytes from Flow

ניתוח ההשפעות של תאי סטרומה על הגיוס של לויקוציטים מתזרים

Stromal cells regulate the recruitment of circulating leukocytes during inflammation through cross-talk with neighboring endothelial cells. Here we ...

An In Vitro Model of the Blood-brain Barrier Using Impedance Spectroscopy: A Focus on T Cell-endothelial Cell Interaction

An In Vitro Model of the Blood-brain Barrier Using Impedance Spectroscopy: A Focus on T Cell-endothelial Cell Interaction

<em&gt; במבחנה</em&gt; דגם של מחסום דם-מוח באמצעות ספקטרוסקופיית עכבה: התמקדות T Cell-אנדותל אינטראקציה תא

Breakdown of the blood-brain barrier (BBB) is a critical step in the development of autoimmune diseases such as multiple sclerosis (MS) and its animal ...

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

ניתוח של לימפוציטים extravasation שימוש<em&gt; במבחנה</em&gt; דגם של מחסום אנושי דם-מוח

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte ...

High-throughput Measurement of Plasma Membrane Resealing Efficiency in Mammalian Cells

תפוקה גבוהה מדידה של קרום פלזמה חתימת יעילות בתאים בתרבית

In their physiological environment, mammalian cells are often subjected to mechanical and biochemical stresses that result in plasma membrane damage. In ...

Digestion of the Murine Liver for a Flow Cytometric Analysis of Lymphatic Endothelial Cells

העיכול של הכבד מאתר של ניתוח Cytometric זרימת הלימפה תאי אנדותל

Within the liver, lymphatic vessels are found within the portal triad, and their described function is to remove interstitial fluid from the liver to the ...