Name: analyzing the permeability of the blood-brain barrier by microbial traversal through microvascular endothelial cells
Uploaded: 2020-02-14T12:30:00
Duration: 6 min 26 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analyzing the Permeability of the Blood-Brain Barrier by Microbial Traversal through Microvascular Endothelial Cells at JoVE.com

Gli autori riconoscono il Dr. Maryam Hussain per i precedenti lavori su questo metodo, il gruppo del PD Dr. Kerstin Danker (Charité-Universit'tsmedizin, Berlino) per aver fornito i THBMEC e Juliane Weber per la lettura critica del manoscritto. Questo studio è stato supportato dal RTK 2155 (ProMoAge).

1. Preparazione del buffer e dei reagenti
<ol><li>Preparare 10 volte il buffer di fosfato salina (10x PBS) aggiungendo 80 g di cloruro di sodio (NaCl), 2 g di cloruro di potassio (KCl), 14,4 g di disidrato-idrogeno fosfatio (Na2HPO4 2 g di fosfato di diidrogeno di potassio (KH2PO4) in un flaastre di vetro da 1 L in 1 L di doppio distillato H2O. Autoclave la soluzione PBS 10x e diluire 100 mL di questa soluzione in 900 mL di acqua a doppia distillata per ottenere 1x PBS.<ol>
<li>Utilizzare l'autoclave per sterilizzare le soluzioni. Mettere il flacone di vetro nel cestello, chiudere il coperchio e sterilizzarlo per 15 min a 121 e 98,9 kPa. NOTA: questo protocollo viene sempre utilizzato per l'autoclavazione delle soluzioni in ulteriori passaggi.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparare una soluzione di fibronectina iv da 10 g/mL e una soluzione fibronectina da 10 g/mL didiluindo la soluzione fibronectina da 0,5 mg/mL e la soluzione di collagene IV da 0,3 mg/mL ciascuno con 1x DA 1x a 100 mg/Laliquot in micro tubi da 1,5 mL. In seguito, mescolare 100 l l di entrambi con 1.800 gradi l di 1x PBS in 2 mL di micro tubi aliquote e conservarli a -20 gradi centigradi.</li>
	<li>Preparare al mezzo DMEM/F-12 aggiungendo al medio il 4% di siero bovino fetale e 2 mM di lmina e 100 mg/L di penicillina/streptomicina e conservarlo a 4 gradi centigradi.</li>
	<li>Preparare 1x soluzione trypsin-EDTA diluindo 5 mL della soluzione trypsin-EDTA concentrata 10x con 45 mL di 1x PBS in un tubo da 50 mL e conservarla a 4 gradi centigradi.</li>
	<li>Preparare 500 mL di mezzo LB pesando 10 g di base di brodo LB in un flacone di vetro da 500 mL. Aggiungere 500 mL di acqua sterilizzata e autoclamare.</li>
	<li>Preparare l'agar LB pesando 10 g di base di brodo LB e 7,5 g di agar-agar in una fiaschetta di vetro da 500 ml. Aggiungere 500 mL di acqua sterilizzata prima dell'autoclaving e non chiudere il coperchio del pallone. Autoclave e lasciare raffreddare la soluzione fino a quando non è caldo al tatto.</li>
	<li>Preparare il mezzo senza antibiotici aggiungendo il 4% di siero bovino fetale e 2 mM L-glutamine, ma nessuna penicillina/streptomicina al mezzo DMEM/F-12 e conservarlo a 4 gradi centigradi come nel punto 1.3.</li>
</ol>2. Crescita della barriera emato-encefalica che imita le cellule
<ol><li>Per assemblare la piastra 12 pozzo, mettere gli inserti di coltura cellulare nei pozzi (Figura 2A).<ol>
<li>Decomprimere la piastra e ogni inserto in un armadietto di sicurezza biologica ed eseguire ulteriori passi lì. Utilizzare pinze sterilizzate per afferrare l'inserto alla sua ampia base per spostarlo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Rivestire la membrana porosa di ogni inserto con 90 g/mL di collagene IV e una miscela di fibronectina di 1g/mL. Incubare la piastra da 12 pozze per 24 h a 37 gradi centigradi in un'incubatrice di coltura cellulare (Figura 2B).</li>
	<li>Lavare gli inserti due volte con pipettando 1 mL di 1x PBS in ogni inserto e aspirare la soluzione con una pompa a vuoto per le colture cellulari.</li>
	<li>Le membrane con pipettaggio Equilibratta 0,5 mL di preriscaldato DMEM/F-12 medio nella parte superiore e 1,5 mL nella camera inferiore. Incubare la piastra per 30 min a 37 gradi centigradi in un'incubatrice di coltura cellulare con 5% di CO2 atmosfera (Figura 2C).</li>
	<li>Seme 2 x 105 cellule endoteliali microvascolari umane in ogni camera superiore e incubare la piastra di 12 pozzea a 37 gradi centigradi in un'incubatrice dicolturacellulare ( Figura 2D).<ol>
<li>Aspirare il mezzo del flaasto coltura cellulare utilizzando una pompa a vuoto per le colture cellulari e lavare il monostrato pipetting 10 mL di 1x PBS e aspirare la soluzione in seguito con una pompa a vuoto.</li>
		<li>Coprire completamente le cellule con 1x concentrato trypsin-EDTA pipeting 5 mL della soluzione nel flacone di coltura cellulare. Incubare il pallone per 3-5 min a 37 gradi centigradi in un'incubatrice a coltura cellulare. NOTA: Se le celle non sono dissociate, toccare saldamente il pallone contro il palmo della mano per spostare le cellule.</li>
		<li>Prendere 5 mL con una pipetta come un dalla sospensione cellulare in un tubo da 15 mL e aggiungere 5 mL del mezzo contenente aliquota FC per fermare la reazione enzimatica.</li>
		<li>Centrifugare la sospensione per 3 min a 210 x g, rimuovere il supernatante con una pompa a vuoto e risospendere il pellet in 5 mL di mezzo con una pipetta.</li>
		<li>Utilizzare il contatore cellulare mescolando 10 l.l della sospensione cellulare con 10 , luna dello 0,4% di una macchia blu di prova dello 0,4% in un micro tubo da 1,5 mL. Aggiungere 10 l della miscela in una diapositiva della camera di conteggio, metterlo nel contatore delle cellule e iniziare a contare.<ol>
<li>Concentrare il contatore sulle celle in modo che il loro bordo sia blu scuro e il bianco centrale. Successivamente, avviare il programma appropriato per il conteggio delle celle.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Per calcolare il volume per ogni inserto, dividere le 2 x 105 celle ottenute per inserto con la concentrazione calcolata della sospensione cellulare.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Coltivazione del modello di barriera sangue-cervello
<ol><li>Incubare il pozzo 12 per 14 giorni a 37 gradi centigradi.</li>
	<li>Cambiare 0,5 mL di mezzo per la camera superiore e 1,5 mL di mezzo per quello inferiore ogni 2-3 giorni. Riscaldare il mezzo prima di metterlo nella fiaschetta cellulare. Aspirare con la pompa a vuoto (Figura 2E). NOTA: Lavorare con attenzione per evitare di toccare la membrana.</li>
	<li>Controllare lo stato delle cellule immaginandole con un microscopio e determinare la confluenza. Assicurarsi che la confluenza sia del 100% dopo 14 giorni.</li>
</ol>4. Preparazione dei batteri
<ol><li>Un giorno prima della misurazione, mettere una colonia del ceppo E. coli GM2163 nel mezzo LB. Incubare il tubo di coltura per 24 h a 37 s con 180 giri/min in uno shaker di incubazione (Figura 2F).<ol>
<li>Coltivare la filtrare E. coli su una piastra di agar LB a 4 gradi centigradi. Prendere una colonia con un plettro sterilizzato e mettere il plettro nel tubo di coltura preparato con 3 mL di LB medio.</li>
		<li>Preparare un piatto di agar LB per ogni inserto con soluzione calda LB agar e riempire i piatti Petri a metà del loro volume totale. Lasciateli diventare solidi e conservarli a 4 gradi centigradi.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Trattamento delle cellule
<ol><li>Il giorno 14 dopo la semina, trattare le cellule con composti o misurare la resistenza elettrica transendoteliale (TEER), se pianificato (Figura 2G). NOTA: avere sempre alcune celle non trattate come controllo.<ol>
<li>Per trattare le cellule con il composto di interesse, diluire il composto alla concentrazione finale nel mezzo DMEM/F-12. Aggiungere 0,5 mL di questa miscela nella camera superiore e 1,5 mL nella camera inferiore. Incubare la piastra in un'incubatrice a coltura cellulare per il tempo desiderato.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Successivamente, scambiare il mezzo completo con un mezzo senza antibiotici aspirando con la pompa a vuoto e il pipettaggio (Figura 2H).</li>
</ol>6. Misurazione della permeabilità
<ol><li>Per ottenere concentrazioni costanti di batteri, misurare la densità ottica con un fotometro ad una lunghezza d'onda di 600 nm. Diluire la soluzione notturna di batteri con mezzo LB in un tubo falco da 50 mL a un OD600 di 0,5 x 0,05. Lavora sul ghiaccio.<ol>
<li>Riempire 1 mL di LB medio in una cuvette. Avviare il fotometro e mettere la cuvette in, segnato lato in avanti. Premere il basso "Vuoto" per misurare il valore vuoto in seguito.</li>
		<li>Misurare la densità della soluzione batterica riempiendola in una cuvette, mettendola dentro e premendo il campione inferiore. Ripetere la misurazione durante la diluizione fino ad ottenere la concentrazione finale.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Lavorare in un armadio di sicurezza biologico dove i batteri possono essere trattati con la piastra da 12 pozze e la soluzione batterica preparata a OD600 - 0,5. Aggiungere 450 l di soluzione batterica solo in ogni camera superiore contenente 0,5 mL di media (Figura 2I).</li>
	<li>Incubare il pozzo 12 per 6 h a 37 gradi centigradi in un'incubatrice. NOTA: il protocollo è in grado di mettere in pausa qui.</li>
	<li>Esempio 50 -L del mezzo con una pipetta da ogni camera inferiore rimuovendo l'inserto con pinze (Figura 2J). Fare attenzione a non versare il mezzo dalle camere superiori a quelle inferiori.</li>
	<li>Piastrare ogni campione su una piastra di agar separata (Figura 2K). Far cadere il campione sulla piastra e striare fuori la soluzione con uno spalmatore di cellule.</li>
	<li>Incubare le placche di agar per 24 h a 37 gradi centigradi in un'incubatrice.</li>
	<li>Contare le colonie in ogni piastra (Figura 2L).</li>
</ol>7. Analisi dei dati
<ol><li>Scrivere i dati in una tabella e calcolare la deviazione media e standard delle colonie osservate di cellule trattate e non trattate.</li>
	<li>Visualizzare la media come numero assoluto di colonie.<ol>
<li>Per normalizzare i risultati, calcolare il numero relativo di colonie dividendo tutti i risultati con il valore di controllo.</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60692/60692fig2a.jpg"> Figura 2: presentazione dettagliata dei singoli passaggi del protocollo. (A) Mettere gli inserti con pinze sterilizzate nella piastra 12 pozzo. (B) Coprire ogni inserto con 90 - L di miscela fibronectina e collagene IV e incubare per 24 h. (C) Equilibrate le membrane con mezzo preriscaldato per 30 min. (D) Seed 2 x 105 cellule endoteliali microvascolari cerebrali umane per inserto. (E) Coltivare la piastra per un periodo di tempo appropriato. (F) Un giorno prima della misurazione, mettere una colonia di E. coli in un tubo di coltura media LB e incubare per 24 h. (G) Trattare le cellule o misurare TEER. (H) Scambio completo medio con mezzo senza antibiotici. (I) Aggiungere 450 l di soluzione batterica (OD600 x 0,5) in ogni camera superiore e incubare per 6 h. (J) Campione 50 - L di mezzo da ogni camera inferiore rimuovendo l'inserto con pinze. (K) Piastrare il campione su piastre di agar e incubare per 24 h. (L) Contare le colonie e analizzare i dati. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60692/60692fig2large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Una comprensione limitata della patogenesi dell'attraversamento microbico limita l'ulteriore sviluppo delle terapie per POD o meningite. La mortalità e la morbilità di queste malattie richiedono un migliore trattamento dei pazienti, richiedono una migliore ricerca dei meccanismi sottostanti e richiedono una solida piattaforma per lo screening composto. Gli eventi multifattoriali possono essere studiati con i BMEC umani. Diverse procedure di isolamento riportate di successo di BMEC da un certo numero di specie hanno mostrato una perdita delle caratteristiche delle cellule firma molecolare52,53. I THBMEC descritti in questa procedura sono stati trafettati in passaggi molto precoce, dove hanno mostrato specifiche caratteristiche delle cellule endoteliali cerebrali e le hanno conservate43. Questo è importante, perché non tutti i passaggi nei percorsi interessati sono stati scoperti finora, e questo modello sembra imitare i BMEC convenzionali. Il nostro modello presentato mostra influenze dirette sui BMEC e sull'attraversamento microbico attraverso il BBB.
La gestione delle cellule THBMEC è semplice e le attrezzature tecniche necessarie esistono nella maggior parte dei laboratori di scienze biologiche. Il nostro modello consente un avvio immediato delle procedure investigative dopo che i THBMEC hanno costruito un monostrato stretto. Il campo delle applicazioni può essere ampio a causa delle possibili combinazioni tra nuovi test e saggi convenzionali come la misurazione TEER o l'etichettatura con traccianti54. È anche possibile aggiungere astrociti o periciti per creare un modello di co- o a tre colture. L'influenza dei farmaci sull'attraversamento microbico potrebbe anche essere testata nel nostro modello trattando i THBMEC con composti prima di inoculare la camera superiore con batteri. Infatti, è possibile acquistare inserti con filtri per 96 pozze di pozzo permettendo l'automazione della procedura. Ciò può facilitare l'implementazione di sistemi di screening farmacologico ad alto consumo per accelerare la scoperta di farmaci contro le malattie menzionate e per ridurre gli effetti collaterali sulla BBB durante lo sviluppo di farmaci.
Un passo critico nel metodo presentato è il tempo di incubazione dopo l'aggiunta dei batteri alla camera superiore. È importante utilizzare le ore come sequenze temporali nel protocollo, perché il tempo di generazione di E. coli è solo 20 min55. In caso contrario, l'uso di punti temporali diversi potrebbe portare a risultati fuorvianti. C'è anche un possibile rischio di contaminazione tra camera superiore e inferiore durante l'esposizione batterica se le piastre non vengono maneggiate con cura. Eventuali alterazioni alla piastra 12 pozzo a questo punto potrebbero contaminare il mezzo nella camera inferiore.
E. coli è una causa ben nota, molto comune di meningite batterica. Ulteriori indagini dovrebbero testare diversi batteri che sono anche associati con meningite, come Neisseria meningitidis56 o Streptococcus pneumoniae57. Questi sembrano utilizzare diversi meccanismi per attraversare la BBB e devono essere meglio compresi per il trattamento dei pazienti. Nei pazienti anziani, l'incidenza del POD aumentadi 26 e il numero di comorbidità che si verificano. È noto che ci sono interazioni tra diverse malattie, in particolare quelle sistemiche come il diabete. Nel nostro modello, è possibile simulare tali condizioni o trattare le cellule prima di aggiungere i batteri.
Il modello è limitato dal contatto diretto di THBMEC e batteri, e sono necessarie ulteriori ricerche per studiare potenziali meccanismi di contatto per rilevare le vie e le proteine coinvolte. Tuttavia, è possibile rimuovere gli inserti e raccogliere le cellule per ulteriori analisi. Il TEER del modello è più basso rispetto ai modelli di cellule staminali38,39,40. Lo abbiamo confermato utilizzando una concentrazione batterica che non ha attraversato la BBB in cellule non trattate dopo 6 h.
In sintesi, questo metodo rappresenta una solida piattaforma per analizzare l'attraversamento dei batteri attraverso la BBB con il potenziale di espanderlo per screening farmacologici ad alto consumo.

Il BBB umano è un confine unico del tessuto cerebrale, che separa il cervello dal sangue. Regola rigorosamente il passaggio di molecole più grandi e idrofile, blocca la diffusione paracellulare e mantiene l'omeostasi cerebrale. Protegge anche il cervello dalle fluttuazioni del plasma, tossine, microbi, e guida le cellule infiammatorie come parte dell'immunità del sistema nervoso centrale (SNC). Dalla sua scoperta di un secolofa,molti studi sono stati condotti per comprendere la struttura e la funzione della BBB. Le complesse interazioni di cellule, proteine e segnali provenienti dal cervello e dalla domanda di sangue sono ancora ulteriori indagini e modelli.
Il BBB umano è composto da tre tipi di cellule: cellule endoteliali microvascolari cerebrali (BMEC), periciti e astrociti2,3. I BMEC differiscono dalla maggior parte delle cellule endoteliali nel corpo in quanto possiedono un elevato numero di giunzioni strette e aderenti giunzioni4, bassa attività pinocitotica2,5, e una membrana seminterrato continua6,7 per bloccare la diffusione paracellulare. Piccole molecole lipofiliche possono diffondersi e passare la BBB dopo il loro gradiente di concentrazione; molecole più grandi e idrofile entrano o lasciano il cervello solo attraverso sistemi di trasporto selettivo polarizzati espressi8. Questo regolamento si traduce in un'elevata resistenza elettrica transetteliale (TEER) di 1.500-2.000, che è inversamente correlata alla permeabilità9,10. Anche se i BMEC costruiscono una barriera stretta, possono reagire ai segnali locali e periferici11,12. C'è una stretta interazione tra BMEC e astrociti13; gli astrociti piedi finali costruiscono uno strato intorno ai vasi e inducono la formazione di giunzioni strette13,14. Essi sono coinvolti nella maturazione della BBB con diversi fattori, tra cui la trasformazione del fattore di crescita -z (TGF-z)15,16. Inoltre, i periciti svolgono un ruolo chiave nella regolazione dell'angiogenesi17 e prevenendo l'apoptosi dell'endotelio nella differenziazione cellulare18 (Figura 1). Essi sono incorporati nella membrana seminterrato e forniscono stabilità strutturale della parete del vaso19.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60692/60692fig1.jpg"> Figura 1: Struttura schematica della barriera emato-encefalica. La struttura unica della BBB umana è composta da tre diversi tipi di cellule. Il lume del microvaso è circondato da cellule endoteliali, che sono arricchite in giunzioni strette e non sono fenestrated. Sono incorporati nella membrana del seminterrato, come i periciti. Queste cellule sono importanti per la stabilità strutturale della parete della nave e svolgono un ruolo nello sviluppo della BBB accanto agli astrociti. I loro piedi finali costruiscono uno strato vicino intorno alla nave e sostengono la costruzione di giunzioni strette. Tutti i componenti della BBB sono importanti per la funzionalità fisiologica. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60692/60692fig1large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Molte patologie diverse sono legate al collasso del BBB (ad esempio, encefalopatia settica). I pazienti affetti hanno aumentato i livelli di proteine nel liquido cerebrospinale20, e il parenchyma cerebrale nei roditori colpiti mostra un aumento dell'ossido di ferro colloidale marcato e degli amminoacidi21,22. Questi risultati indicano una maggiore permeabilità della BBB che si verifica insieme a una pinocitosi aumentata nei BMEC21 e all'attivazione endoteliale23. Un'altra patologia associata relativa a una BBB alterata è la meningite, un'emergenza medica e un'infiammazione complessa accompagnata da edema cerebrale che può portare alla morte delle cellule neuronali. Il sito di ingresso primario dei batteri circolanti dovrebbe essere il microvasi24; tuttavia, la BBB impedisce l'ingresso di batteri. La permeabilità del BBB non è sempre legata ad un aumento della meningite ematogena sperimentale25 e i meccanismi possono essere multifattoriali. La coincidenza della sepsi con delirio postoperatorio (POD)26 e l'associazione con infezioni preoperatorie27,28 indica la necessità di un modello BBB che consente l'esposizione diretta ai batteri per ottenere una migliore comprensione della patogenesi batterica.
Ci sono molte lacune nella comprensione e nella quantificazione dell'attraversamento microbico attraverso la BBB. Pertanto, abbiamo sviluppato un modello che consente un comodo test di diversi fattori e condizioni con una correlazione diretta tra attraversamento batterico e influenze sulla permeabilità del BBB. Il lavoro precedente si è concentrato sulla permeabilità paracellulare e ha incluso la misurazione TEER e il flusso tracciante. Inoltre, il trasporto di macromolecole è stato analizzato da molecole coniugate o anticorpi, per cui sono stati sviluppati diversi modelli che utilizzano solo cellule endoteliali o combinazioni con astrociti e periciti. A causa della difficoltà nell'ottenere tessuto umano su base regolare, vengono utilizzati molti modelli di origine animale. Le cellule endoteliali cerebrali di origine bovina e porcina formano monostrati stretti con un ALTO TEER che formano una polarità apicale-basale ben sagomata e sono adatte per le indagini sul trasporto di piccole molecole attraverso il BBB. Le proteine differiscono in sequenza dai loro omologhi umani29,30, rendendo difficile lo studio degli anticorpi terapeutici. Per questo motivo, i modelli di cultura murina o umana possono essere preferibili. Topi o ratti come fonti campione hanno il vantaggio di essere ottenuti da specie ben caratterizzate, ma producono poche cellule a scopo di studio. Questo può essere aggirato con l'uso di linee cellulari endotelioma (END) del mouse immortalato bEND.3, bEND.5 o cEND31,32,33.
Le cellule coltivate primarie del tessuto umano sono difficili da ottenere e da gestire regolarmente. Pertanto, la maggior parte dei modelli cellulari umani utilizzati nella ricerca che studia nocciuto sono immortalati linee cellulari endoteliali. Una linea cellulare pubblicata è la linea cellulare microvascolare cerebrale umana hCMEC/D3, che è adatta per studiare l'assorbimento di farmaci ed è facile da gestire. Le cellule costruiscono un monostrato ed esprimono le caratteristiche proteine di giunzione strette del BBB34, mentre il livello di espressione di claudin-5 è segnalato per essere inferiore rispetto a microvessels intatti35 e molti trasportatori specifici sono stati rilevati a livello transcript36 così come negli studi proteomici34. Un TEER relativamente basso nell'intervallo di 30-50 cm2 è ancora una sfida37. Un'altra fonte di cellule endoteliali cerebrali sono le cellule staminali pluripotenti umane (hPSC)38 e le cellule staminali derivate dal sangue del cordone umano di progenitore endoteliale circolante e lignaggi ematopoietici39,40. Entrambi i protocolli di differenziazione si traducono in monostrati cellulari stretti e valori TEER elevati (ad es., 1.450 cm2 nelle co-culture)38. Questi modelli di cellule staminali richiedono estrema cura per la coltivazione, ma offrono l'opportunità di studiare l'influenza della regolazione degli ormoni41 o malattie con background genetico42 sullo sviluppo di BBB.
In questo studio, abbiamo stabilito una linea cellulare endoteliale microvascolare trastratta immortalata, THBMEC43, per imitare il BBB e studiare l'attraversamento batterico. Le cellule vengono semiate su un filtro e cresciute fino al 100% di confluenza in questo modello di coltura cellulare. I batteri vengono inoculati nella parte superiore della camera di coltura cellulare. Usiamo Escherichia coli (E. coli) nel nostro studio di campione a causa dell'alta incidenza di E. coli meningite44. È stato dimostrato che la permeabilità più bassa del monostrato cellulare si verifica tra il giorno 13 e il giorno 15 dopo il semina45. Pertanto, il trattamento del monostrato THBMEC viene eseguito dopo questo tempo e i batteri vengono inoculati in seguito nel mezzo sulla superficie apicale del monostrato. Dopo un periodo di incubazione, i batteri che sono stati in grado di attraversare la barriera vengono quantificati tramite mezzo di placcatura con i batteri sulle piastre di agar e contando le colonie. Un aumento del numero di colonie è correlato a un maggiore attraversamento batterico attraverso la BBB. Il TEER è di circa 70 cm246. Tuttavia, non è necessario misurare il TEER nel metodo descritto. Anche se è un valore ben consolidato per la permeabilità del BBB, sembra non avere alcun impatto sull'attraversamento dei batteri attraverso il BBB. Le cellule non trattate fungono da controllo della tenuta nel nostro modello. È stato dimostrato nel lavoro precedente che le cellule sono in grado di reagire alle citochine infiammatorie ed esprimere proteine di giunzione strette tipiche47. Ciò consente lo screening composto e la convalida di un insieme più ampio di substrati e recettori trasportatori più grandi.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agar - Agar</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>6494.3</td>
			<td>BioScience-Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclave</td>
			<td>Systec</td>
			<td>VX-150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacteria E.coli strain GM2163</td>
			<td>Fermentas Life Sciences, Lithuania</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photometer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>6131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cells THBMEC</td>
			<td>Group of M. F. Stins</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture flasks</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>658175</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Universal 320</td>
			<td>Hettrichlab</td>
			<td>1401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen IV</td>
			<td>SIGMA Aldrich</td>
			<td>C6745</td>
			<td>from human cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess Automated Cell Counter with cell counting chamber slides and Trypan Blue stain 0.4%</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C10311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture tubes</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>191180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cuvettes</td>
			<td>BRAND</td>
			<td>759015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Di sodium hydrogen phosphate di hydrate</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>1065800500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12</td>
			<td>GIBCO/ Thermo Sc.</td>
			<td>11330032</td>
			<td>HEPES</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tubes 15 ml</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>188271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tubes 50 ml</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>227261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>GIBCO/ Thermo Sc.</td>
			<td>10270</td>
			<td>value FBS -Brazil</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>SIGMA Aldrich</td>
			<td>F0556</td>
			<td>solution human fibroblasts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heracell 150 CO2 Incubator</td>
			<td>Heraeus</td>
			<td>50116047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator shaker I 26 New Brunswick</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>M1324-0000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inoculation loop</td>
			<td>Dr. Ilona Schubert - Laborfachhandel</td>
			<td>641000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth Base</td>
			<td>GIBCO/ Thermo Sc.</td>
			<td>12780029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>GIBCO/ Thermo Sc.</td>
			<td>25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microbial incubator B 6200</td>
			<td>Heraeus</td>
			<td>51015192</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microbiological Safety Cabinet AURA 2000 M.A.C. Class II</td>
			<td>BIOAIR</td>
			<td>12469</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope inverse</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>TELAVAL 31</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro tubes 2 ml</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>72,695,400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro tubes 1,5 ml</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>72,706,400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin / Streptomycin</td>
			<td>GIBCO/ Thermo Sc.</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Dr. Ilona Schubert - Laborfachhandel</td>
			<td>464-800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Roth</td>
			<td>HN02.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium-di-hydrogen phosphate</td>
			<td>Roth</td>
			<td>P018.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Roth</td>
			<td>9265.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThinCerts + Multiwell Plates</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>665631</td>
			<td>12 well, pore size 3.0 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin - EDTA</td>
			<td>GIBCO/ Thermo Sc.</td>
			<td>15400054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuumpump Laboport</td>
			<td>KNF</td>
			<td>N 86 KT.18</td>
			<td></td>
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analyzing the permeability of the blood-brain barrier by microbial traversal through microvascular endothelial cells

La barriera emato-encefalica umana (BBB) è caratterizzata da una permeabilità molto bassa per le biomolecole al fine di proteggere e regolare il metabolismo del cervello. Il BBB è costituito principalmente da cellule endoteliali incorporate nelle membrane basement ricche di collagene e fibronectine. Diverse patologie derivano da disfunzione del BBB seguita da attraversamento microbico, causando malattie come la meningite. Al fine di testare l'effetto di più parametri, tra cui diversi farmaci e anestetici, sulla permeabilità del BBB abbiamo stabilito un nuovo modello di coltura cellulare umana che imita la BBB con cellule endoteliali microvascolari cerebrali umane. Le cellule endoteliali vengono coltivate su unità filtranti rivestite di collagene IV e fibronectina fino alla confluenza e possono quindi essere trattate con diversi composti di interesse. Per dimostrare un attraversamento microbico, la camera superiore con la superficie apicale delle cellule endoteliali viene inoculata con batteri. Dopo un periodo di incubazione, i campioni della camera bassa sono placcati su piastre di agar e vengono conteggiate le colonie ottenute, per cui il numero di colonie è correlato alla permeabilità del BBB. I fattori cellulari endogeni possono essere analizzati in questo set-up sperimentale al fine di chiarire i meccanismi cellulari di base delle cellule endoteliali che contribuiscono alla BBB. Inoltre, questa piattaforma consente di eseguire uno schermo per i composti che potrebbero influenzare la permeabilità delle cellule endoteliali. Infine, l'attraversamento batterico può essere studiato e collegato a diverse patologie, come la meningite. Potrebbe essere possibile estendere il modello e analizzare le vie dei batteri attraverso il BBB. In questo articolo viene fornito un protocollo dettagliato del metodo descritto per analizzare la permeabilità del BBB.

Seguendo il protocollo, le cellule sono state semiate, e il modello BBB è stato costruito. Al giorno 14 dopo la semina, le cellule sono state trattate con gliossal come aldeide reattiva. Lo scopo dell'esperimento era quello di studiare la correlazione tra età e diabete nel POD27 e l'alta incidenza di meningite nei pazienti anziani48. L'aumento dei livelli di prodotti finali avanzati di glicazione (AGE) sia in età che in diabete49 richiedono un ulteriore esame dell'effetto della glicazione nella patogenesi dell'attraversamento microbico attraverso la BBB. La glicazione è una reazione non enzimatica di mimietigruppi di aminoacidi liberi nelle proteine con gruppi carbonili di riduzione dei carboidrati o di altri composti carbonili. Il glucosio è ben noto come donatore di gruppi carbonili; tuttavia, ci sono quelli più reattivi noti. Dopo aver costruito una base instabile di Schiff, si riorganizzano in composti diburili più stabili e reattivi come il gliossicolo. Gli AGE, i prodotti finali, possono causare collegamenti incrociati tra le proteine50. Possono danneggiare le strutture cellulari e alterare la funzione cellulare mediante l'interazione con il recettore degli AGE (RAGE)51.
Le cellule sono state trattate con una soluzione glioxal (GO) da 0,05 e 0,15 mM per 1 h e le cellule non trattate fungevano da controllo. La glicazione è stata rilevata tramite immunoblotting e rilevamento con un anticorpo anti-ETÀ (Figura 3). Le colonie batteriche ottenute sono state conteggiate e rappresentate come il numero assoluto di colonie (Figura 4A) o il numero relativo di colonie normalizzate al controllo (Figura 4B). Il mezzo prelevato dai pozzi con le cellule non trattate formava pochissime colonie. Questo risultato ha dimostrato che le cellule non trattate erano in grado di costruire una barriera e poteva fungere da controllo. I campioni trattati con gliossiale mostravano un aumento del numero di colonie, portando alla conclusione che c'è un effetto di gliossico sui THBMEC e sulla densità della barriera cellulare, perché il numero di colonie ha dimostrato una differenza significativa tra cellule non trattate e trattate. L'aumento dell'attraversamento batterico della barriera dopo il trattamento con gliossali potrebbe spiegare perché il diabete è correlato alle malattie con una ripartizione BBB.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60692/60692fig3a.jpg"> Figura 3: Rilevamento del glicazione proteica tramite immunoblotting. I THBMEC sono stati trattati con GO a concentrazioni diverse per 1 h. La proteina totale è stata isolata e separata utilizzando SDS-PAGE. La glicazione delle proteine è stata rilevata tramite immunoblotting utilizzando anticorpi anti-ETÀ (CML-26). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60692/60692fig3alarge.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
In un ambiente diverso, il glicazione proteica dei THBMEC è stato indotto dal glucosio. Il glucosio sterilizzato è stato aggiunto al mezzo DMEM/F-12 per aumentare la concentrazione di glucosio dal normale mezzo di glucosio (NG) con 17,5 mM a un alto livello di glucosio (HG) con 42,5 mM. I THBMEC sono stati coltivati in due diversi flasks per colture cellulari: uno nel normale mezzo di glucosio (NG) e l'altro in mezzo ad alto glucosio (HG). Questi due diversi supporti sono stati utilizzati anche per la crescita del BBB sui filtri in 12 piastre di pozzo. Le cellule coltivate nel mezzo NG servivano come controllo. Le colonie ottenute sono rappresentate come il numero assoluto di colonie (Figura 4C) o il numero relativo di colonie normalizzate al controllo (Figura 4D). I risultati non indicano alcun effetto significativo sull'attraversamento dei batteri attraverso il BBB umano, portando alla conclusione che l'effetto di NG vs HG non è stato abbastanza grave da influenzare l'integrità del BBB. I diversi scenari sono stati progettati per dimostrare il modello e l'integrità delle cellule che imitano la BBB.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60692/60692fig4d.jpg"> Figura 4: Numero assoluto e relativo di colonie batteriche conteggiate nel modello BBB con THBMEC. I THBMEC sono stati trattati con 4,15 mM GO per 1 h, cellule non trattate fungevano da controllo. Ad ogni camera superiore è stato aggiunto un totale di 450-L di sospensione E. coli (OD600 x 0,5). Medium dalle camere inferiori è stato placcato su piastre di agar dopo 6 h. (A) Il grafico mostra la media media di s/- SEM delle colonie contate. (B) Il grafico mostra le colonie conteggiate normalizzate alle cellule non trattate come controllo :/- SEM (n ) . In (C) e (D), i THBMET sono stati coltivati in NG e HG medio. Ad ogni camera superiore è stato aggiunto un totale di 450-L di sospensione E. coli (OD600 x 0,5). Media dalla camera inferiore è stata placcata su piastre di agar dopo 6 h. (C) Il grafico mostra la media media delle colonie contate. (D) Il grafico mostra le colonie conteggiate normalizzate nelle cellule non trattate come controllo (/- SEM) (n ) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60692/60692fig4large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

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Analyzing the Permeability of the Blood-Brain Barrier by Microbial Traversal through Microvascular Endothelial Cells

La barriera emato-encefalica umana previene selettivamente la penetrazione di molecole idrofile e patogeni nel cervello. Diverse patologie, tra cui meningite e delirio postoperatorio, sono associate a una maggiore permeabilità della barriera emato-encefalica. Qui, descriviamo un modello di coltura cellulare endoteliale per testare la permeabilità della barriera mediante attraversamento microbico.

Analisi della permeabilità della barriera sangue-encefalica attraverso l'attraversamento microbico attraverso le cellule endoteliali microvascolari

The human blood-brain barrier (BBB) is characterized by a very low permeability for biomolecules in order to protect and regulate the metabolism of the ...

Questo metodo consente di analizzare la barriera ematico-encefalica umana misurando la traversata batterica su diversi trattamenti. Può aiutare a scoprire la patogenesi della meningite batterica e delirio postoperatorio. È un metodo semplice e gli effetti del trattamento sono direttamente rappresentati dal numero di batteri.Può essere modificato per consentire un'analisi ad alta produttività dei composti sulle cellule endoteliali. Inizia assemblando la piastra da 12 po 'in un armadietto di sicurezza biologico. Spacchettare la piastra e ogni inserto, quindi utilizzare le forcep sterilizzate per afferrare gli inserti alla loro base e metterli nei pozzi.Rivestire la membrana porosa di ogni inserto con 90 microlitri di 10 microgrammi per microlitro collagene IV e miscela di fibronectina e incubare la piastra in un incubatore di coltura cellulare a 37 gradi Celsius per 24 ore. Dopo l'incubazione, lavare gli inserti due volte pipettando un millilitro di PBS in ogni inserto e aspirarlo con una pompa per vuoto. Quindi equilibrare le membrane pipettando il mezzo DMEM F12 prebellico nelle camere superiore e inferiore e incubare la piastra a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica.Per seminare le cellule endoteliali microvascolari umane, aspirare il mezzo dal pallone di coltura cellulare e lavare le cellule con 10 millilitri di PBS. Coprire completamente le cellule con cinque millilitri di EDTA di tripside e incubare il pallone per tre o cinque minuti a 37 gradi Celsius. Trasferire cinque millilitri delle cellule in un tubo da 15 millilitri e aggiungere cinque millilitri di FCS contenenti mezzo per fermare la reazione enzimatica.Centrifugare la sospensione per tre minuti a 210 volte g, rimuovere il supernatante e rimescolare il pellet cellulare in cinque millilitri di mezzo. Aggiungere 10 microlitri della sospensione cellulare a 10 microlitri dello 0,4% di macchia blu trypan, quindi aggiungere 10 microlitri della miscela a una camera di conteggio. Mettere la camera di conteggio nel contatore della cella e avviare il programma appropriato assicurandosi che il contatore sia focalizzato.Dopo il conteggio, seminare 200.000 cellule in ogni camera superiore sulla piastra da 12 pozzi e incubare la piastra a 37 gradi Celsius per 14 giorni cambiando il supporto nella camera superiore e inferiore ogni due o tre giorni. Dopo 14 giorni, assicurarsi che la confluenza cellulare sia al 100% imaging con un microscopio. Un giorno prima della misurazione della permeabilità, mettere una colonia di ceppo E.coli GM2163 in tre millilitri di mezzo LB.Coltura delle cellule a 37 gradi Celsius per 24 ore in uno shaker di incubazione. Per trattare le cellule con un composto di interesse, diluirlo alla sua concentrazione finale nel mezzo DMEM F12 e aggiungere questa miscela nelle camere superiore e inferiore nella piastra da 12 po ', quindi incubare la piastra in un incubatore di coltura cellulare. Dopo l'incubazione, scambiare il mezzo completo con un mezzo privo di antibiotici.Determinare la concentrazione della coltura batterica durante la notte misurando la sua densità ottica a 600 nanometri, quindi diluirla in un OD600 di 0,5 in un tubo Falcon da 50 millilitri. In un armadio di sicurezza biologico, aggiungere 450 microlitri della soluzione batterica in ogni camera superiore della piastra da 12 po ', quindi incubare la piastra per sei ore a 37 gradi Celsius. Dopo l'incubazione, rimuovere l'inserto con le forcep e campionare 50 microlitri del mezzo da ogni camera inferiore facendo attenzione a non versare il mezzo dalle camere superiori in quelle inferiori.È importante separare rigorosamente i supporti della camera superiore e inferiore poiché una fuoriuscita dai batteri della camera superiore porterebbe a risultati falsi positivi. Far cadere ogni campione su una piastra di agar separata e striature la soluzione con uno spargitore di cellule. Incubare le piastre a 37 gradi Celsius per 24 ore, quindi contare le colonie.Per studiare l'effetto della glicazione sull'attraversamento microbico attraverso la barriera ematica- encefalica, le cellule sono state trattate con una soluzione glimosale da 0,5 e 0,15 millimolare per un'ora con cellule non trattate che fungono da controllo. La glicazione è stata quindi rilevata tramite immunoblotting con anticorpi anti-AGE. Le colonie batteriche ottenute furono contate e rappresentate come il numero assoluto di colonie o il numero relativo di colonie normalizzate al controllo.Campioni trattati con glioxale mostravano un numero maggiore di colonie che indicavano che il trattamento ha un effetto sulla densità della barriera cellulare. Per studiare la glicazione proteica indotta dal glucosio, i THBMEC sono stati coltivati in glucosio normale e mezzo di glucosio elevato. Il numero assoluto di colonie e il numero relativo di colonie normalizzate al controllo indicavano che il glucosio non aveva alcun effetto significativo sull'integrità della barriera ematico-encefalica.Le cellule endoteliali trattate possono essere ulteriormente analizzate mediante approcci proteomici, ad esempio la spettrometria di massa, per analizzare i cambiamenti nel proteoma. Questa tecnica aiuta a comprendere la barriera ematico-encefalica umana e il traverso batterico. Può essere utilizzato per scoprire aspetti dell'invecchiamento e malattie neurodegenerative come il morbo di Alzheimer.

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