Name: analyzing the permeability of the blood-brain barrier by microbial traversal through microvascular endothelial cells
Uploaded: 2020-02-14T12:30:00
Duration: 6 min 26 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analyzing the Permeability of the Blood-Brain Barrier by Microbial Traversal through Microvascular Endothelial Cells at JoVE.com

Forfatterne erkjenner Dr. Maryam Hussain for tidligere arbeid på denne metoden, gruppen av PD Dr. Kerstin Danker (Charité-Universitätsmedizin, Berlin) for å gi THBMECs og Juliane Weber for kritisk lesing manuskriptet. Denne studien ble støttet av RTK 2155 (ProMoAge).

1. Utarbeidelse av buffer- og reagenser
<ol><li>Forbered 10x fosfatbuffersaltvann (10x PBS) ved å legge til 80 g natriumklorid (NaCl), 2 g kaliumklorid (KCl), 14,4 g disodium-hydrogen-fosfatdihydrat (Na2HPO4 · 2H2O) og 2 g kaliumdihydrogenfosfat (KH2PO4) i en 1 L glasskolbe i 1 L dobbeltdestillert H2O. Autoklav 10x PBS-oppløsning og fortynn 100 ml av denne løsningen i 900 ml dobbeltdestillert vann for å få 1x PBS.<ol>
<li>Bruk autoklaven til å sterilisere løsninger. Sett glasskolben i kurven, lukk lokket og steriliser den i 15 min ved 121 °C og 98,9 kPa. MERK: Denne protokollen brukes alltid til autoklavingsløsninger i ytterligere trinn.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Forbered en 10 μg/ml kollagen IV og 10 μg/ml fibronectinoppløsning ved å fortynne 0,5 mg/ml fibronectinoppløsning og 0,3 mg/ml kollagen IV-oppløsning hver med 1x PBS til 100 mg/μL aliquots i 1,5 ml mikrorør. Bland deretter 100 μL av begge aliquots med 1800 μL 1x PBS i 2 ml mikrorør og oppbevar dem ved -20 °C.</li>
	<li>Forbered DMEM/F-12 medium ved å legge til 4% føtal storfe serum og 2 mM L-glutamin og 100 mg / L penicillin / streptomycin til mediet og lagre den ved 4 ° C.</li>
	<li>Forbered 1x trypsin-EDTA-oppløsningved å fortynne 5 ml av 10x konsentrert trypsin-EDTA-oppløsning med 45 ml 1x PBS i et 50 ml rør og oppbevar den ved 4 °C.</li>
	<li>Forbered 500 ml LB medium ved å veie 10 g LB kjøttkraft base i en 500 ml glasskolbe. Tilsett 500 ml sterilisert vann og autoklav.</li>
	<li>Forbered LB agar ved å veie 10 g LB kjøttkraft base og 7,5 g agar-agar i en 500 ml glasskolbe. Tilsett 500 ml sterilisert vann før autoklaving og ikke lukk lokket på kolben. Autoklavog la oppløsningen avkjøles til den er varm å ta på.</li>
	<li>Forbered antibiotikafritt medium ved å legge til 4% føtal storfe serum og 2 mM L-glutamin, men ingen penicillin / streptomycin til DMEM / F-12 medium og lagre den ved 4 ° C som i trinn 1.3.</li>
</ol>2. Vekst av blod-hjerne barrieren etterligne celler
<ol><li>For å montere 12 brønnplaten, sett cellekulturen setter inn i brønnene (Figur 2A).<ol>
<li>Pakk ut platen og hver innsats i et biologisk sikkerhetsskap og utfør ytterligere trinn der. Bruk steriliserte tang for å ta tak i innsatsen på sin brede base for å flytte den.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bekle porøse membranen i hver innsats med 90 μL på 10 μg/ml kollagen IV og 10 μg/ml fibronectinblanding. Inkuber 12 brønnplate i 24 timer ved 37 °C i en cellekulturinkubator (figur 2B).</li>
	<li>Vask innsatsene to ganger ved å pipettere 1 ml 1x PBS i hver innsats og aspirere løsningen med en vakuumpumpe for cellekulturer.</li>
	<li>Equilibrate membranene ved pipettering 0,5 ml prewarmed DMEM / F-12 medium i øvre og 1,5 ml i nedre kammer. Inkuber platen i 30 min ved 37 °C i en cellekulturinkubator med 5 % CO2-atmosfære (figur 2C).</li>
	<li>Frø 2 x 105 humane mikrovaskulære endotelceller i hvert øvre kammer og inkuber 12 brønnplate ved 37 °C i en cellekulturinkubator (Figur 2D).<ol>
<li>Aspirer mediet fra cellekulturkolben ved hjelp av en vakuumpumpe for cellekulturer og vask monolayer ved å pipettere 10 ml 1x PBS og aspirere løsningen etterpå med en vakuumpumpe.</li>
		<li>Dekk cellene helt med 1x konsentrert trypsin-EDTA ved å pipettere 5 ml av løsningen inn i cellekulturkolben. Inkuber kolben i 3-5 min ved 37 °C i en cellekulturinkubator. MERK: Hvis cellene ikke er dissosiert, trykk på kolben godt mot håndflaten for å løsne cellene.</li>
		<li>Ta 5 ml med en pipette som en aliquot fra cellesuspensjonen i et 15 ml rør og tilsett 5 ml av FCS-holdig medium for å stoppe den enzymatiske reaksjonen.</li>
		<li>Sentrifuge suspensjonen i 3 min ved 210 x g,fjern supernatanten med en vakuumpumpe, og resuspender pellet i 5 ml medium med pipett.</li>
		<li>Bruk celletelleren ved å blande 10 μL av cellesuspensjonen med 10 μL 0,4 % trypanblå beis i et 1,5 ml mikrorør. Tilsett 10 μL av blandingen i et tellekammerlysbilde, legg den inn i celletelleren og begynn å telle.<ol>
<li>Fokuser telleren på cellene slik at kanten er mørk blå og den midterste hvite. Deretter starter du det riktige programmet for celletelling.</li>
		</ol>
</li>
		<li>For å beregne volumet for hver innsats, del de oppnådde 2 x 105 cellene per innsats med den beregnede konsentrasjonen av cellesuspensjonen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Dyrking av Blod-hjerne barrieren modell
<ol><li>Inkuber 12 brønnplate i 14 dager ved 37 °C.</li>
	<li>Endre 0,5 ml medium for det øvre kammeret og 1,5 ml medium for den nedre hver 2-3 dager. Varm mediet før du legger det i cellekolben. Aspirer med vakuumpumpen (Figur 2E). MERK: Arbeid forsiktig for å unngå å berøre membranen.</li>
	<li>Kontroller statusen til cellene ved å forestille dem med et mikroskop og bestem samløpet. Sørg for at samløpet er 100% etter 14 dager.</li>
</ol>4. Fremstilling av bakterier
<ol><li>En dag før måling, sette en koloni av E. coli belastning GM2163 i LB medium. Inkuber kulturrøret i 24 timer ved 37 °C med 180 o/min i en inkubasjonsshaker (Figur 2F).<ol>
<li>Dyrke E. coli-stammen på en LB agarplate ved 4 °C. Ta en koloni med en sterilisert plukke og sette plukke i forberedt kultur tube med 3 ml LB medium.</li>
		<li>Forbered en LB agar plate for hver innsats med varm LB agar løsning og fyll Petri retter til halvparten av sitt totale volum. La dem bli solide og lagre dem ved 4 °C.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Behandling av celler
<ol><li>På dag 14 etter seeding behandler du celler med forbindelser eller måler den transendotheliale elektriske motstanden (TEER), hvis det er planlagt (figur 2G). MERK: Ha alltid noen ubehandlede celler som kontroll.<ol>
<li>For å behandle celler med sammensatt av interesse, fortynn forbindelsen til den endelige konsentrasjonen i DMEM / F-12 medium. Tilsett 0,5 ml av denne blandingen i det øvre kammeret og 1,5 ml inn i det nedre kammeret. Inkuber platen i en cellekulturinkubator for ønsket tid.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Etterpå børser du hele mediet med antibiotikafritt medium ved å aspirere med vakuumpumpen og pipetteringen (figur 2H).</li>
</ol>6. Måling av permeabilitet
<ol><li>For å få konstante konsentrasjoner av bakterier, mål den optiske tettheten med et fotometer med en bølgelengde på 600 nm. Fortynn nattens løsning av bakterier med LB medium i et 50 ml falkerør til en OD600 på 0,5 ± 0,05. Arbeid på is.<ol>
<li>Fyll 1 ml LB medium i en cuvette. Start fotometeret og sett inn kuklasten, merket side fremover. Trykk på bunnen "Tom" for å måle den tomme verdien etterpå.</li>
		<li>Mål tettheten av bakterieoppløsningen ved å fylle den inn i en cuvette, sette den inn og trykke på den nederste prøven. Gjenta målingen under fortynningen til du får den endelige konsentrasjonen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Arbeid i et biologisk sikkerhetsskap hvor bakterier kan håndteres med den tilberedte 12 brønnplate- og bakterieløsningen ved OD600 = 0,5. Tilsett 450 μL bakteriell oppløsning bare i hvert øvre kammer som inneholder 0,5 ml medium(figur 2I).</li>
	<li>Inkuber 12 brønnplate i 6 timer ved 37 °C i en inkubator. MERK: Protokollen tilsier å ta en pause her.</li>
	<li>Prøv 50 μL av mediet med en pipette fra hvert nedre kammer ved å fjerne innsatsen med tang (Figur 2J). Pass på at du ikke søler mediet fra de øvre kamrene til de nedre.</li>
	<li>Plate hver prøve på en separat agar-plate (Figur 2K). Slipp prøven på platen og strek ut løsningen med en cellespreder.</li>
	<li>Inkuber agarplatene i 24 timer ved 37 °C i en inkubator.</li>
	<li>Tell koloniene i hver plate (figur 2L).</li>
</ol>7. Analysere data
<ol><li>Skriv dataene i en tabell og beregn gjennomsnittlig og standardavvik for de observerte koloniene av behandlede og ubehandlede celler.</li>
	<li>Vis gjennomsnittet som det absolutte antallet kolonier.<ol>
<li>For å normalisere resultatene, beregn det relative antallet kolonier ved å dele alle resultater med kontrollverdien.</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60692/60692fig2a.jpg"> Figur 2: Detaljert presentasjon av de enkelte trinnene i protokollen. (A) Sett innsatsene med steriliserte tang i 12 brønnplaten. (B) Coat hver innsats med 90 μL fibronectin og kollagen IV blanding og inkubator i 24 timer. (C) Equilibrate membranene med prewarmed medium i 30 min. (D) Seed 2 x 105 humanhjerne mikrovaskulærendotelielle celler per innsats. (E) Dyrke platen for riktig tid. (F) En dag før måling, legg en E. coli koloni i en LBmiddels kultur rør og inkuber i 24 timer . (H) Bytt komplett medium med antibiotikafritt medium. (I) Tilsett 450 μL bakteriell oppløsning (OD600 = 0,5) i hvert øvre kammer og inkubator i 6 timer . (J) Prøv 50 μL medium fra hvert nedre kammer fjerner innsats med tang. (K) Plate prøven på agar plater og inkubator i 24 timer. (L) Telle koloniene og analysere dataene. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60692/60692fig2large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.</a>

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Begrenset innsikt i patogenesen av mikrobiell traversering begrenser videre utvikling av terapier for POD eller meningitt. Dødeligheten og sykeligheten til disse sykdommene krever bedre pasientbehandling, krever forskning på de underliggende mekanismene, og trenger en robust plattform for sammensatt screening. De multifaktorielle hendelsene kan studeres med menneskelige BMECer. Flere vellykkede rapporterte isolasjonsprosedyrer av BMECer fra en rekke arter har vist tap av cellenes egenskaper molekylær signatur52,53. De beskrevne THBMECs i denne prosedyren ble transinfisert i svært tidlige passasjer, hvor de viste spesifikke hjerneendotelcelleegenskaper og bevarte dem43. Dette er viktig, fordi ikke alle trinnene i de berørte banene har blitt oppdaget så langt, og denne modellen ser ut til å etterligne konvensjonelle BMECs. Vår presenterte modell viser direkte påvirkninger på BMECs og mikrobiell traversgjennom BBB.
Håndteringen av THBMEC-celler er enkel, og det nødvendige tekniske utstyret finnes i de fleste biovitenskapelige laboratorier. Vår modell åpner for en umiddelbar start på undersøkende prosedyrer etter at THBMECs har bygget et stramt monolayer. Bruksområder kan være omfattende på grunn av mulige kombinasjoner mellom nye tester og konvensjonelle analyser som TEER-måling eller merking med tracers54. Det er også mulig å legge til astrocytter eller pericytes for å lage en co- eller trippel-kultur modell. Påvirkningen av legemidler på mikrobiell traverskan også testes i vår modell ved å behandle THBMECs med forbindelser før inokulering av det øvre kammeret med bakterier. Faktisk er det mulig å kjøpe innsatser med filtre for 96 brønnplater slik at automatisering av prosedyren. Dette kan lette gjennomføringen av høy gjennomstrømning narkotika screening systemer for å akselerere oppdagelsen av narkotika mot nevnte sykdommer og redusere bivirkninger på BBB under narkotikautvikling.
Et kritisk skritt i den presenterte metoden er inkubasjonstiden etter å ha tillagt bakteriene til det øvre kammeret. Det er viktig å bruke timer som tidslinjer i protokollen, fordi generasjonstiden til E. coli er bare 20 min55. Ellers kan bruk av forskjellige tidspunkter føre til villedende resultater. Det er også en mulig risiko for forurensning mellom øvre og nedre kammer under bakteriell eksponering hvis platene ikke håndteres med forsiktighet. Eventuelle endringer i 12 brønnplaten på dette tidspunktet kan forurense mediet i det nedre kammeret.
E. coli er en velkjent, svært vanlig årsak til bakteriell meningitt. Videre undersøkelser bør teste forskjellige bakterier som også er forbundet med meningitt, som Neisseria meningitidis56 eller Streptococcus pneumoniae57. Disse ser ut til å bruke forskjellige mekanismer for å krysse BBB og må forstås bedre for behandling av pasienter. Hos eldre pasienter øker forekomsten for POD26, samt antall forekommende komorbiditeter. Det er kjent at det er interaksjoner mellom ulike sykdommer, spesielt systemiske som diabetes. I vår modell er det mulig å simulere disse forholdene eller behandle cellene før du legger til bakteriene.
Modellen er begrenset av direkte kontakt med THBMECs og bakterier, og videre forskning er nødvendig for å undersøke potensielle kontaktmekanismer for å oppdage de involverte veier og proteiner. Det er imidlertid mulig å fjerne innsatser og høste cellene for videre analyse. TEER-en til modellen er lavere sammenlignet med stamcellemodellene38,39,40. Vi bekreftet dette ved hjelp av en bakteriell konsentrasjon som ikke krysset BBB i ubehandlede celler etter 6 timer.
Oppsummert representerer denne metoden en robust plattform for å analysere traversering av bakterier gjennom BBB med potensial til å utvide den for høy gjennomstrømning narkotika screenings.

Den menneskelige BBB er en unik grense for hjernevev, som skiller hjernen fra blodet. Det regulerer strengt passasjen av større og hydrofile molekyler, blokkerer paracellulær diffusjon, og opprettholder hjernenhomeostase. Det beskytter også hjernen mot plasmasvingninger, giftstoffer, mikrober og guider inflammatoriske celler som en del av sentralnervesystemet (CNS) immunitet. Siden oppdagelsen for hundre år siden1, mange studier har blitt utført for å forstå strukturen og funksjonen til BBB. De komplekse interaksjonene mellom celler, proteiner og signaler fra hjerne- og blodkrever fortsatt videre undersøkelse og modeller.
Den menneskelige BBB består av tre celletyper: hjernemikrovaskulærendotelceller (BMECer), pericytes og astrocytter2,3. BMECs skiller seg fra flertallet av endotelcellene i kroppen ved at de har et høyt antall tette veikryss og fester veikryss4, lav pinocytotisk aktivitet2,5og en kontinuerlig kjellermembran6,7 for å blokkere paracellulær diffusjon. Små lipofile molekyler kan spre og passere BBB etter konsentrasjonsgradienten; større og hydrofile molekyler kommer inn eller forlater hjernen bare gjennom polariserte uttrykte selektive transportsystemer8. Denne forskriften resulterer i en høy transendothelial elektrisk motstand (TEER) på 1500-2000 Ω·cm2 som er omvendt korrelert til permeabilitet9,10. Selv om BMECs bygger en stram barriere, kan de reagere på lokale og perifere signaler11,12. Det er en tett interaksjon mellom BMECs og astrocytter13; de astrocyttende endeføttene bygger et lag rundt fartøyene og induserer dannelsen av stramme veikryss13,14. De er involvert i BBB modning med ulike faktorer, inkludert transformere vekstfaktor-β (TGF-β)15,16. I tillegg spiller pericytes en nøkkelrolle i reguleringen av angiogenese17 og forhindrer apoptose av endotelet i cellulær differensiering18 (Figur 1). De er innebygd i kjellermembranen og gir strukturell stabilitet av fartøyetveggen19.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60692/60692fig1.jpg"> Figur 1: Skjematisk struktur av blod-hjernebarrieren. Den unike strukturen til den menneskelige BBB består av tre forskjellige celletyper. Mikrokarlumen er omgitt av endotelceller, som er beriket i trange veikryss, og er ikke fenestrated. De er innebygd i kjellermembranen, som pericytes. Disse cellene er viktige for strukturell stabilitet av fartøyetveggen og spiller en rolle i utviklingen av BBB ved siden av astrocytter. Deres ende-føtter bygge et nært lag rundt fartøyet og støtte bygging av trange veikryss. Alle komponenter i BBB er viktige for fysiologisk funksjonalitet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60692/60692fig1large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.</a>
Mange forskjellige patologier er relatert til sammenbruddet av BBB (f.eks. septisk encefalopati). De berørte pasientene har økt proteinnivåer i cerebrospinalvæsken20,og hjerneparenchyma hos berørte gnagere viser økt opptak av markert kolloidalt jernoksid og aminosyrer21,22. Disse resultatene peker mot økt permeabilitet av BBB som oppstår sammen med en økt pinocytose i BMECs21 og endotelaktivering23. En annen assosiert patologi relatert til en endret BBB er meningitt, en medisinsk nødsituasjon og en kompleks betennelse ledsaget av cerebralt ødem som kan føre til nevronal celledød. Det primære inngangsstedet for sirkulerende bakterier skal være mikrofartøyene24; BBB forhindrer imidlertid at bakterier kommer inn. Permeabiliteten til BBB er ikke alltid knyttet til en økning i eksperimentell hematogen meningitt25 og mekanismene kan være multifaktorielle. Tilfeldighet av sepsis med postoperativ delirium (POD)26 og foreningen med preoperative infeksjoner27,28 indikerer behovet for en BBB-modell som gjør det mulig for direkte eksponering for bakterier å få en bedre forståelse i bakteriell patogenese.
Det er mange hull i å forstå og kvantifisere mikrobiell traversgjennom BBB. Derfor utviklet vi en modell som muliggjør en praktisk testing av ulike faktorer og forhold med en direkte sammenheng mellom bakteriell traversog påvirkningpå permeabiliteten til BBB. Tidligere arbeid fokuserte på paracellulær permeabilitet og inkluderte TEER-måling og tracer flux. I tillegg ble makromolekyltransport analysert av konjugerte molekyler eller antistoffer, der forskjellige modeller som bare brukte endotelceller eller kombinasjoner med astrocytter og pericytes ble utviklet. På grunn av vanskeligheten med å skaffe menneskelig vev regelmessig, brukes mange dyrebaserte modeller. Hjerneendotelceller av storfe og svineopprinnelse danner stramme monolag med høy TEER som danner velformet apikal-basal polaritet og er egnet for undersøkelser av små molekyltransport gjennom BBB. Proteinene varierer i rekkefølge fra deres menneskelige homologer29,30, noe som gjør undersøkelse av terapeutiske antistoffer vanskelig. Av denne grunn kan murine eller menneskelig kultur modeller være å foretrekke. Mus eller rotter som utvalgskilder har fordelen av å bli hentet fra velkarakteriserte arter, men gir få celler for studieformål. Dette kan omgås ved bruk av udødeliggjort mus hjernen endothelioma (END) cellelinjer bEND.3, bEND.5 eller cEND31,32,33.
Primære kultiverte celler fra menneskelig vev er vanskelig å oppnå og å håndtere regelmessig. Derfor er de fleste menneskelige cellulære modeller som brukes i forskning som undersøker den menneskelige BBB udødeliggjort endotelcellelinjer. En publisert cellelinje er human cerebral mikrovaskulær endotelcellelinje hCMEC/D3, som er godt egnet for å studere legemiddelopptak og er lett å håndtere. Cellene bygger en monolayer og uttrykker de karakteristiske tette koblingsproteinene til BBB34, mens uttrykksnivået for claudin-5 rapporteres å være lavere enn i intakte mikrofartøy35 og mange spesifikke transportører har blitt oppdaget på transkripsjonsnivå36, samt i proteomiske studier34. En relativt lav TEER i området 30-50 Ω·cm2 er fortsatt en utfordring37. En annen kilde for hjerneendotelceller er humane pluripotente stamceller (hPSCs)38 og humane ledningen blod-avledede stamceller av sirkulerende endotelstamceller og hematopoetiske linjer39,40. Begge protokollene for differensiering resulterer i trange cellemonolag og høye TEER-verdier (f.eks. 1450 Ω·cm2 i co-kulturer)38. Disse stamcellemodellene krever ekstrem omsorg for dyrking, men gir likevel mulighet til å studere påvirkning av å regulere hormoner41 eller sykdommer med genetisk bakgrunn42 på BBB utvikling.
I denne studien etablerte vi en udødeliggjort transinfisert human hjerne mikrovaskulær endotelcellelinje, THBMEC43, for å etterligne BBB og for å studere bakteriell traversal. Celler seedes på et filter og dyrkes til 100% samflyt i denne cellekulturmodellen. Bakterier er vaksinert i den øvre delen av cellekulturkammeret. Vi bruker Escherichia coli (E. coli) i vår prøvestudie på grunn av den høye forekomsten av E. coli meningitt44. Det har vist seg at den laveste permeabiliteten til cellemonolayer oppstår mellom dag 13 og dag 15 etter seeding45. Derfor utføres behandling av THBMEC monolayer etter denne tiden, og bakterier inokulerer etterpå i mediet på monolayerens apikale overflate. Etter en inkubasjonstid kvantifiseres bakterier som var i stand til å krysse barrieren via platingmedium med bakteriene på agarplater og teller koloniene. Et økt antall kolonier korrelerer med høyere bakteriell traversering gjennom BBB. TEER er ca 70 Ω·cm246. Det er imidlertid ikke nødvendig å måle TEER i den beskrevne metoden. Selv om det er en veletablert verdi for permeabiliteten til BBB, synes det ikke å ha noen innvirkning på traverseringen av bakterier gjennom BBB. Ubehandlede celler tjener som en kontroll av tetthet i vår modell. Det har blitt vist i tidligere arbeid at cellene er i stand til å reagere på proinflammatoriske cytokiner og uttrykke typiske stramme koblingsproteiner47. Dette gjør det mulig for sammensatt screening og validering av et større sett med transportørsubstrater og reseptorer.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agar - Agar</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>6494.3</td>
			<td>BioScience-Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclave</td>
			<td>Systec</td>
			<td>VX-150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacteria E.coli strain GM2163</td>
			<td>Fermentas Life Sciences, Lithuania</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photometer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>6131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cells THBMEC</td>
			<td>Group of M. F. Stins</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture flasks</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>658175</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Universal 320</td>
			<td>Hettrichlab</td>
			<td>1401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen IV</td>
			<td>SIGMA Aldrich</td>
			<td>C6745</td>
			<td>from human cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess Automated Cell Counter with cell counting chamber slides and Trypan Blue stain 0.4%</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C10311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture tubes</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>191180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cuvettes</td>
			<td>BRAND</td>
			<td>759015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Di sodium hydrogen phosphate di hydrate</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>1065800500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12</td>
			<td>GIBCO/ Thermo Sc.</td>
			<td>11330032</td>
			<td>HEPES</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tubes 15 ml</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>188271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tubes 50 ml</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>227261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>GIBCO/ Thermo Sc.</td>
			<td>10270</td>
			<td>value FBS -Brazil</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>SIGMA Aldrich</td>
			<td>F0556</td>
			<td>solution human fibroblasts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heracell 150 CO2 Incubator</td>
			<td>Heraeus</td>
			<td>50116047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator shaker I 26 New Brunswick</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>M1324-0000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inoculation loop</td>
			<td>Dr. Ilona Schubert - Laborfachhandel</td>
			<td>641000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth Base</td>
			<td>GIBCO/ Thermo Sc.</td>
			<td>12780029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>GIBCO/ Thermo Sc.</td>
			<td>25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microbial incubator B 6200</td>
			<td>Heraeus</td>
			<td>51015192</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microbiological Safety Cabinet AURA 2000 M.A.C. Class II</td>
			<td>BIOAIR</td>
			<td>12469</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope inverse</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>TELAVAL 31</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro tubes 2 ml</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>72,695,400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro tubes 1,5 ml</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>72,706,400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin / Streptomycin</td>
			<td>GIBCO/ Thermo Sc.</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Dr. Ilona Schubert - Laborfachhandel</td>
			<td>464-800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Roth</td>
			<td>HN02.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium-di-hydrogen phosphate</td>
			<td>Roth</td>
			<td>P018.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Roth</td>
			<td>9265.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThinCerts + Multiwell Plates</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>665631</td>
			<td>12 well, pore size 3.0 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin - EDTA</td>
			<td>GIBCO/ Thermo Sc.</td>
			<td>15400054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuumpump Laboport</td>
			<td>KNF</td>
			<td>N 86 KT.18</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analyzing the permeability of the blood-brain barrier by microbial traversal through microvascular endothelial cells

Den menneskelige blod-hjernebarrieren (BBB) er preget av en svært lav permeabilitet for biomolekyler for å beskytte og regulere metabolismen av hjernen. BBB er hovedsakelig dannet ut av endotelceller innebygd i kollagen IV og fibronectin-rike kjellermembraner. Flere patologier skyldes dysfunksjon av BBB etterfulgt av mikrobiell traversering, forårsaker sykdommer som meningitt. For å teste effekten av flere parametere, inkludert forskjellige stoffer og bedøvelse, på permeabiliteten til BBB etablerte vi en ny menneskelig cellekulturmodell som etterlignet BBB med humane hjernemikrovaskulære endotelceller. Endotelcellene dyrkes på kollagen IV og fibronectinbelagte filterenheter til samløpet og kan deretter behandles med forskjellige forbindelser av interesse. For å demonstrere en mikrobiell traversering, er det øvre kammeret med den apikale overflaten av endotelcellene inokulert med bakterier. Etter en inkubasjonsperiode er prøver av det nedre kammeret belagt på agarplater og de oppnådde koloniene telles, hvorantall kolonier korrelerer med permeabiliteten til BBB. Endogene cellulære faktorer kan analyseres i dette eksperimentelle oppsettet for å belyse grunnleggende cellulære mekanismer i endotelcellene som bidrar til BBB. I tillegg gjør denne plattformen det mulig å utføre en skjerm for forbindelser som kan påvirke permeabiliteten til endotelcellene. Til slutt kan bakteriell traversering studeres og knyttes til forskjellige patologier, som meningitt. Det kan være mulig å utvide modellen og analysere bakterienes veier gjennom BBB. I denne artikkelen gir vi en detaljert protokoll av den beskrevne metoden for å undersøke permeabiliteten til BBB.

Etter protokollen ble cellene seedet, og BBB-modellen ble bygget. På dag 14 etter seeding ble cellene behandlet med glysaal som reaktiv aldehyd. Målet med eksperimentet var å undersøke sammenhengen mellom alder og diabetes hos POD27 og den høye forekomsten av meningitt hos eldre pasienter48. De økte nivåene av avanserte glykasjonssluttprodukter (AgEs) i både alder og diabetes49 krever ytterligere undersøkelse av effekten av glykasjon i patogenesen av mikrobiell traversgjennom BBB. Glycation er en ikke-enzymatisk reaksjon av frie aminogrupper i proteiner med karbonylgrupper for å redusere karbohydrater eller andre karbonylforbindelser. Glukose er kjent som donor av karbonylgrupper; Det er imidlertid mer reaktive kjent. Etter å ha bygget en ustabil Schiffbase, omorganiserer de seg til mer stabile og reaktive dikarbonylforbindelser som glyoksal. AgEs, de endelige produktene, kan forårsake krysskoblinger mellom proteiner50. De kan skade cellulære strukturer og endre cellulær funksjon ved interaksjon med reseptoren av AGEs (RAGE)51.
Cellene ble behandlet med en 0,05 og 0,15 mM glysoksal (GO) oppløsning i 1 t, og ubehandlede celler fungerte som en kontroll. Glykasjon ble påvist via immunblotting og deteksjon med anti-AGE antistoff (figur 3). De oppnådde bakterielle koloniene ble regnet og representert som det absolutte antallkolonier (figur 4A) eller det relative antallet kolonier normalisert til kontrollen (Figur 4B). Mediet tatt fra brønner med ubehandlede celler dannet svært få kolonier. Dette resultatet viste at de ubehandlede cellene var i stand til å bygge en barriere og kunne tjene som en kontroll. Prøver behandlet med glyoksal viste et økt antall kolonier, noe som førte til konklusjonen at det er en effekt av glysall på THBMECs og cellulær barrieretetthet, fordi antall kolonier viste en signifikant forskjell mellom ubehandlede og behandlede celler. Den økte bakterielle kryssingen av barrieren etter behandling med glysaal kan forklare hvorfor diabetes er korrelert med sykdommer med bbbsammenbrudd.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60692/60692fig3a.jpg"> Figur 3: Påvisning av proteinglykasjon via immunblotting. THBMECs ble behandlet med GO ved forskjellige konsentrasjoner i 1 t. Totalt protein ble isolert og separert ved hjelp av SDS-PAGE. Glyksjon av proteinene ble påvist via immunblotting ved hjelp av anti-AGE-antistoff (KML-26). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60692/60692fig3alarge.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.</a>
I en annen setting ble proteinglykasjon av THBMECer indusert av glukose. Sterilisert glukose ble lagt til DMEM/F-12-mediet for å øke glukosekonsentrasjonen fra normalt glukosemedium (NG) med 17,5 mM til høyt glukosemedium (HG) med 42,5 mM. THBMECs ble dyrket i to forskjellige cellekulturflasker: en i normal glukose (NG) medium og den andre i høy glukose (HG) medium. Disse to forskjellige mediene ble også brukt til vekst av BBB på filtre i 12 brønnplater. Celler dyrket i NG medium fungerte som en kontroll. De oppnådde koloniene er representert som det absolutte antallkolonier (figur 4C)eller det relative antallet kolonier normalisert til kontrollen (Figur 4D). Resultatene indikerer ingen signifikant effekt på traversering av bakterier gjennom humanBBB, noe som fører til konklusjonen at effekten av NG vs. HG ikke var alvorlig nok til å påvirke integriteten til BBB. De ulike scenariene ble designet for å bevise modellen og integriteten til cellene som etterligner BBB.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60692/60692fig4d.jpg"> Figur 4: Absolutt og relativt antall talte bakteriekolonier i BBB-modellen med THBMECs. THBMECs ble behandlet med 0,15 mM GO i 1 t, ubehandlede celler fungertsom en kontroll. Totalt 450 μL E. coli suspensjon (OD600 = 0,5) ble lagt til hvert øvre kammer. Medium fra de nedre kamrene ble belagt på agarplater etter 6 h. (A) Grafen viser gjennomsnittlig gjennomsnitt +/- SEM av teltkolonier. (B) Grafen viser de tellede koloniene normalisert til de ubehandlede cellene som kontroll +/- SEM (n = 4). I (C) og (D), ble THBMECs dyrket i NG og HG medium. Totalt 450 μL E. coli suspensjon (OD600 = 0,5) ble lagt til hvert øvre kammer. Medium fra det nedre kammeret ble belagt på agarplater etter 6 timer (C) Grafen viser gjennomsnittlig gjennomsnitt +/- SEM av talte kolonier. (D) Grafen viser de tellede koloniene normalisert til de ubehandlede cellene som kontroll +/- SEM (n = 3). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60692/60692fig4large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Analyzing the Permeability of the Blood-Brain Barrier by Microbial Traversal through Microvascular Endothelial Cells at JoVE.com

Analyzing the Permeability of the Blood-Brain Barrier by Microbial Traversal through Microvascular Endothelial Cells

Den menneskelige blod-hjernebarrieren forhindrer selektivt penetrasjon av hydrofile molekyler og patogener inn i hjernen. Flere patologier, inkludert meningitt og postoperativ delirium, er forbundet med økt permeabilitet av blod-hjernebarrieren. Her beskriver vi en endotelcellekulturmodell for å teste barrierenpermeabiliteten ved mikrobiell traversering.

Analysere permeabiliteten til blod-hjernebarrieren ved mikrobiell traversal gjennom mikrovaskulære endotelceller

The human blood-brain barrier (BBB) is characterized by a very low permeability for biomolecules in order to protect and regulate the metabolism of the ...

Denne metoden gjør det mulig å analysere den menneskelige blod-hjernebarrieren ved å måle bakteriell traversering ved ulike behandlinger. Det kan bidra til å oppdage patogenesen av bakteriell meningitt og postoperativ delirium. Det er en enkel metode, og effekten av behandlingen er direkte representert ved antall bakterier.Det kan endres for å muliggjøre høy gjennomstrømning analyse av forbindelser på endotelceller. Begynn med å montere 12-brønnsplaten i et biologisk sikkerhetsskap. Pakk ut platen og hver innsats, og bruk deretter steriliserte tang for å ta tak i innsatsene ved basen og legg dem inn i brønnene.Coat porøse membranen av hver innsats med 90 mikroliter på 10 mikrogram per mikroliter kollagen IV og fibronectin blanding og inkubere platen i en celle kultur inkubator ved 37 grader Celsius i 24 timer. Etter inkubasjonen vasker du innsatsene to ganger ved å pipettere en milliliter PBS i hver innsats og aspirere den med en vakuumpumpe. Deretter likevekt membranene ved å pipettering prewarmed DMEM F12 medium i øvre og nedre kamre og inkubere platen ved 37 grader Celsius og 5% karbondioksid.For å så de menneskelige mikrovaskulære endotelcellene, aspirer mediet fra cellekulturkolben og vask cellene med 10 milliliter PBS. Dekk cellene helt med fem milliliter trypsin EDTA og inkubere kolben i tre til fem minutter ved 37 grader Celsius. Overfør fem milliliter av cellene til et 15 milliliter rør og tilsett fem milliliter FCS som inneholder medium for å stoppe den enzymatiske reaksjonen.Sentrifuger suspensjonen i tre minutter ved 210 ganger g, fjern supernatanten og gjenoppuss cellepelleten i fem milliliter medium. Tilsett 10 mikroliter av cellesuspensjonen til 10 mikroliter på 0,4% trypan blå flekk, og tilsett deretter 10 mikroliter av blandingen til et tellekammer. Sett tellekammeret i celletelleren og start det aktuelle programmet og sørg for at telleren er fokusert.Etter telling, frø 200, 000 celler i hvert øvre kammer på 12-brønns plate og inkubere platen ved 37 grader Celsius i 14 dager endre media i øvre og nedre kammer hver to til tre dager. Etter 14 dager må du sørge for at cellekonfluens er 100%ved å forestille dem med et mikroskop. En dag før permeabilitetsmåling, sett en koloni av E.coli stamme GM2163 i tre milliliter lb medium.Kultur cellene ved 37 grader Celsius i 24 timer i en inkubasjonshaker. For å behandle celler med en sammensatt interesse, fortynne den til sin endelige konsentrasjon i DMEM F12 medium og tilsett denne blandingen i de øvre og nedre kamrene i 12-brønnplaten, og inkuber deretter platen i en cellekultur inkubator. Etter inkubasjonen, bytt hele mediet med antibiotikafritt medium.Bestem konsentrasjonen av bakteriekulturen over natten ved å måle den optiske tettheten ved 600 nanometer, og fortynne den deretter til en OD600 på 0,5 i et 50 milliliter Falcon-rør. I et biologisk sikkerhetsskap, legg til 450 mikroliter av bakterieoppløsningen i hvert øvre kammer av 12-brønnplaten, og inkuber deretter platen i seks timer ved 37 grader Celsius. Etter inkubasjonen, fjern innsatsen med tang og prøv 50 mikroliter av mediet fra hvert nedre kammer, og ta vare på å ikke søle mediet fra de øvre kamrene inn i de nedre.Det er viktig å strengt skille media av øvre og nedre kammer som en søl fra bakterier i det øvre kammeret ville føre til falske positive resultater. Slipp hver prøve på en egen agarplate og strek løsningen med en cellespreder. Inkuber platene ved 37 grader Celsius i 24 timer, og tell deretter koloniene.For å undersøke effekten av glykasjon på mikrobiell traversal gjennom blod-hjernebarrieren, ble cellene behandlet med en 0,5 og en 0,15 millimolar glyoksal løsning i en time med ubehandlede celler som fungerte som en kontroll. Glykosasjonen ble deretter oppdaget via immunoblotting med anti-AGE antistoffer. De oppnådde bakterielle koloniene ble regnet og representert som det absolutte antall kolonier eller det relative antall kolonier normalisert til kontrollen.Prøver behandlet med glyoksal viste et økt antall kolonier som indikerer at behandlingen har en effekt på cellulær barrieretthet. For å undersøke glukoseindusert proteinglyksjon ble THBMECer dyrket i normalt glukose og høyt glukosemedium. Det absolutte antallet kolonier og det relative antallet kolonier normalisert til kontrollen indikerte at glukose ikke hadde noen signifikant effekt på integriteten til blod-hjernebarrieren.Behandlede endotelceller kan analyseres ytterligere ved proteomikktilnærminger, for eksempel massespektrometri, for å analysere endringer i proteomet. Denne teknikken bidrar til å forstå den menneskelige blod-hjernebarrieren og bakteriell traversal. Det kan brukes til å oppdage aspekter av aldring og nevrodegenerative sykdommer som Alzheimers sykdom.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Separation of Single-stranded DNA, Double-stranded DNA and RNA from an Environmental Viral Community Using Hydroxyapatite Chromatography

Viruses, particularly bacteriophages (phages), are the most numerous biological entities on Earth1,2.  Viruses modulate host cell abundance and diversity, ...

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

The system comprising bacteriophage (phage) lambda and the bacterium E. coli has long served as a paradigm for cell-fate determination1,2. Following the ...

Generation of Recombinant Arenavirus for Vaccine Development in FDA-Approved Vero Cells

Generasjon av rekombinant arenavirus for Vaccine Development i FDA-godkjente Vero Cells

The development and implementation of arenavirus reverse genetics represents a significant breakthrough in the arenavirus field  4. The use of cell-based ...

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Kvantitativ<em&gt; In vitro</em&gt; Analysen for å måle Neutrophil vedheft til Aktiverte primære humane mikrovaskulær endotelceller under statiske betingelser

The vascular  endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the  acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are ...

Analyzing the Effects of Stromal Cells on the Recruitment of Leukocytes from Flow

Analysere effekten av stromalceller på rekruttering av leukocytter fra Flow

Stromal cells regulate the recruitment of circulating leukocytes during inflammation through cross-talk with neighboring endothelial cells. Here we ...

An In Vitro Model of the Blood-brain Barrier Using Impedance Spectroscopy: A Focus on T Cell-endothelial Cell Interaction

An In Vitro Model of the Blood-brain Barrier Using Impedance Spectroscopy: A Focus on T Cell-endothelial Cell Interaction

en<em&gt; In Vitro</em&gt; Modell av blod-hjernebarrieren Bruke impedansspektroskopi: En Fokus på T Cell-endotelceller Interaksjon

Breakdown of the blood-brain barrier (BBB) is a critical step in the development of autoimmune diseases such as multiple sclerosis (MS) and its animal ...

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Analyse av lymfocytt-ekstravasasjon ved hjelp av en<em&gt; In Vitro</em&gt; Modell av det menneskelige blod-hjernebarrieren

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte ...

High-throughput Measurement of Plasma Membrane Resealing Efficiency in Mammalian Cells

Høy gjennomstrømming-måling av Plasma membran Resealing effektivitet i pattedyrceller

In their physiological environment, mammalian cells are often subjected to mechanical and biochemical stresses that result in plasma membrane damage. In ...

Digestion of the Murine Liver for a Flow Cytometric Analysis of Lymphatic Endothelial Cells

Fordøyelsen av Murine leveren for en flyt Cytometric analyse av lymfatisk endotelceller

Within the liver, lymphatic vessels are found within the portal triad, and their described function is to remove interstitial fluid from the liver to the ...