Name: analyzing the permeability of the blood-brain barrier by microbial traversal through microvascular endothelial cells
Uploaded: 2020-02-14T12:30:00
Duration: 6 min 26 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analyzing the Permeability of the Blood-Brain Barrier by Microbial Traversal through Microvascular Endothelial Cells at JoVE.com

Авторы признают д-ра Марьям Хусейн за предыдущую работу над этим методом, группу PD д-р Керстин Данкер (Шарите-Университет,Университет, Берлин) для предоставления THBMECs и Джулиан Вебер для критическиго чтения рукописи. Это исследование было поддержано RTK 2155 (ProMoAge).

1. Подготовка буфера и реагентов
<ol><li>Подготовка 10x фосфат буфера солевым раствором (10x PBS), добавив 80 г хлорида натрия (NaCl), 2 г хлорида калия (KCl), 14,4 г динатрия-водородно-фосфатного дигидрата (Na2HPO4 - 2H2O) и 2 г фосфаткалия калия-дигидрогена (KH2PO4) в 1 l стеклянной колбе в 1 л двойной дистиллированной H2O. Автоклав 10x PBS раствор и разбавить 100 мл этого раствора в 900 мл двойной дистиллированной воды, чтобы получить 1x PBS.<ol>
<li>Используйте автоклав для стерилизации растворов. Положите стеклянную колбу в корзину, закройте крышку и стерилизуйте ее в течение 15 мин при 121 и 98,9 кПа. ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол всегда используется для автоматического решения в дальнейших шагах.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Приготовьте коллаген IV и 10 мкг/мЛ фибронектина, разбавив раствор фибронектин 0,5 мг/мл и раствор коллагена IV 0,3 мг/мл каждый с 1x PBS до 100 мг/мл аликотов в 1,5 мл микротрубки. После этого смешайте 100 кЛ обоих аникотов с 1800 л 1x PBS в микротрубках 2 мл и храните их при -20 градусов по Цельсию.</li>
	<li>Подготовка DMEM / F-12 среды, добавив 4% плода крупного рогатого скота сыворотки и 2 мМ L-глютамин и 100 мг / l пенициллин / стрептомицин к среде и хранить его при 4 градусах Цельсия.</li>
	<li>Приготовьте раствор 1x trypsin-EDTA, разбавив 5 мл 10-кратного концентрированного раствора трипсин-ЭДТА с 45 мл 1x PBS в трубке 50 мл и храните его при 4 градусах Цельсия.</li>
	<li>Приготовьте 500 мл среды LB весом 10 г бульонной основы LB в стеклянной колбе 500 мл. Добавьте 500 мл стерилизованной воды и автоматически его.</li>
	<li>Приготовьте LB-агар весом 10 г бульонной основы LB и 7,5 г агар-агара в стеклянной колбе 500 мл. Добавьте 500 мл стерилизованной воды перед автоклавированием и не закрывайте крышку колбы. Автоклав и оставить раствор остыть, пока он не тепло на ощупь.</li>
	<li>Подготовка без антибиотиков среды, добавив 4% плода крупного рогатого скота сыворотки и 2 мМ L-глютамин, но не пенициллина / стрептомицина в DMEM / F-12 среды и хранить его при 4 c как в шаге 1.3.</li>
</ol>2. Рост кроветчебного барьера, мимикрирующего клетки
<ol><li>Чтобы собрать 12 хорошо пластины, положить клеточной культуры вставки в колодцы(Рисунок 2A).<ol>
<li>Распакуйте пластину и каждую вставку в шкаф биологической безопасности и выполните дальнейшие шаги там. Используйте стерилизованные щипцы, чтобы захватить вставку на ее широкой основе, чтобы переместить его.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Пальто пористой мембраны каждой вставки с 90 мкг /мл коллагена IV и 10 мкг /мЛ фибронектин смеси. Инкубировать 12 хорошо пластины для 24 ч при 37 КС в инкубаторе клеточной культуры(рисунок 2B).</li>
	<li>Вымойте вставки дважды, пайпетик 1 мл 1x PBS в каждой вставке и аспирации раствор с вакуумным насосом для клеточных культур.</li>
	<li>Уравновесить мембраны путем трубоукладки 0,5 мл предварительно разогретой среды DMEM/F-12 в верхней и 1,5 мл в нижней камере. Инкубировать пластину в течение 30 мин при 37 градусах По Цельсию в инкубаторе клеточной культуры с 5% CO2 атмосферой(рисунок 2C).</li>
	<li>Семена 2 х 105 человека микрососудистых эндотелиальных клеток в каждой верхней камере и инкубировать 12 хорошо пластины при 37 градусов по Цельсию в инкубаторе клеточной культуры(Рисунок 2D).<ol>
<li>Аспирировать среду из колбы клеточной культуры с помощью вакуумного насоса для клеточных культур и мыть монослой путем pipetting 10 мл 1x PBS и аспирации раствора потом с вакуумным насосом.</li>
		<li>Обложка клетки полностью с 1x концентрированный трипсин-EDTA путем pipetting 5 мл раствора в колбу клеточной культуры. Инкубировать колбу в течение 3-5 мин при 37 градусах По Цельсию в инкубаторе клеточной культуры. ПРИМЕЧАНИЕ: Если клетки не разобщены, твердо коснитесь колбу на ладони, чтобы выбить клетки.</li>
		<li>Возьмите 5 мл с пипеткой в качестве аликота из клеточной подвески в трубке 15 мл и добавьте 5 мл fcS-содержащей среды, чтобы остановить ферментативную реакцию.</li>
		<li>Centrifuge подвески в течение 3 мин на 210 х г,удалить супернатант с вакуумным насосом, и resuspend гранулы в 5 мл среды с пипеткой.</li>
		<li>Используйте счетчик клеток, смешивая 10 л клеточной подвески с 10 зл 0,4% пробивной синий пятно в 1,5 мл микро трубки. Добавьте 10 кЛ смеси в слайд счетной камеры, положите его в счетчик ячейки и начните считать.<ol>
<li>Сосредоточьте счетчик на клетках так, чтобы их край был темно-синим и средним белым. После этого начните соответствующую программу для подсчета клеток.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Чтобы рассчитать объем для каждой вставки, разделите полученные 2 х 105 ячеек на вставку с расчетной концентрацией клеточной подвески.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Культивирование модели барьера кровеносного мозга
<ol><li>Инкубировать 12 хорошо пластины в течение 14 дней при 37 градусов по Цельсию.</li>
	<li>Изменение 0,5 мл среднего для верхней камеры и 1,5 мл среднего для нижней каждые 2-3 дня. Разогрейте среду, прежде чем положить его в клеточной колбе. Аспират с вакуумным насосом(Рисунок 2E). ПРИМЕЧАНИЕ: Работайте тщательно, чтобы не касаться мембраны.</li>
	<li>Проверьте состояние клеток, визуав их с помощью микроскопа и определите выпуклость. Убедитесь, что выпуклость составляет 100% через 14 дней.</li>
</ol>4. Подготовка бактерий
<ol><li>За день до измерения, положить колонии штамма кишечной палочки GM2163 в LB среды. Инкубировать культурную трубку на 24 ч при 37 градусах по Цельсию с 180 об/мин в инкубационном шейкере(рисунок 2F).<ol>
<li>Культивировать E. coli нагрузку на LB агар пластины при 4 градусах Цельсия. Возьмите одну колонию со стерилизованные забрать и положить забрать в подготовленной культуры трубки с 3 мл среды LB.</li>
		<li>Приготовьте тарелку агара LB для каждой вставки с теплым раствором агара LB и заполните блюда Петри до половины их общего объема. Пусть они становятся твердыми и хранить их при 4 градусах Цельсия.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Лечение клеток
<ol><li>На 14 день после посева, лечить клетки с соединениями или измерить трансэндотелиальной электрической устойчивости (TEER), если планируется(Рисунок 2G). ПРИМЕЧАНИЕ: Всегда есть некоторые необработанные клетки в качестве контроля.<ol>
<li>Для лечения клеток с составом интереса, разбавить соединение до конечной концентрации в DMEM /F-12 среды. Добавьте 0,5 мл этой смеси в верхнюю камеру и 1,5 мл в нижнюю палату. Инкубировать пластину в инкубаторе клеточной культуры на нужное время.</li>
	</ol>
</li>
	<li>После этого, обмен полной среде с антибиотиками свободной среде, аспирируя с вакуумным насосом и пипеттинг(Рисунок 2H).</li>
</ol>6. Измерение проницаемости
<ol><li>Чтобы получить постоянную концентрацию бактерий, измерьте оптическую плотность с помощью фотометра на длине волны 600 нм. Разбавить ночной раствор бактерий с помощью носителя LB в соколиной трубке 50 мл до OD600 из 0,5 и 0,05. Работа на льду.<ol>
<li>Заполните 1 мл среднего LB в кювет. Запустите фотометр и положите кювет в, отмеченную сторону вперед. Нажмите на дно "Пустой" для измерения пустой стоимости после этого.</li>
		<li>Измерьте плотность бактериального раствора, заполнив его в кювет, поместив его в, и нажав на нижний образец. Повторите измерение во время разбавления до получения окончательной концентрации.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Работа в биологическом шкафу безопасности, где бактерии могут быть обработаны с подготовленными 12 хорошо пластины и бактериального раствора на OD600 и 0,5. Добавить 450 л бактериального раствора только в каждую верхнюю камеру, содержащую 0,5 мл среднего(рисунок 2I).</li>
	<li>Инкубировать 12 хорошо пластины для 6 ч при 37 градусов по Цельсию в инкубаторе. ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол диктует сделать паузу здесь.</li>
	<li>Образец 50 зл и носителя с пипеткой из каждой нижней камеры, удалив вставку с щипками(рисунок 2J). Позаботьтесь, чтобы не пролить среду из верхних камер в нижние.</li>
	<li>Плита каждого образца на отдельной агар-пластине(рисунок 2K). Бросьте образец на тарелку и вычеркните раствор с помощью клеточного распределителя.</li>
	<li>Инкубировать агар пластины для 24 ч при 37 градусов по Цельсию в инкубаторе.</li>
	<li>Подсчитайте колонии в каждой пластине(рисунок 2L).</li>
</ol>7. Анализ данных
<ol><li>Напишите данные в таблице и вычислите среднее и стандартное отклонение наблюдаемых колоний обработанных и необработанных клеток.</li>
	<li>Отобразите среднее количество колоний.<ol>
<li>Чтобы нормализовать результаты, вычислите относительное количество колоний, разделив все результаты с контрольным значением.</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60692/60692fig2a.jpg"> Рисунок 2: Детальное представление отдельных шагов в протоколе. (A) Положите вставки со стерилизованные щипцы в 12 хорошо пластины. (B) Пальто каждой вставки с 90 QL фибронектина и коллагена IV смеси и инкубировать на 24 ч. (C) Equilibrate мембраны с предварительной среде в течение 30 мин. (D) Семена 2 х 105 мозга человека микрососудистых эндотелиальных клеток на вставку. (E) Культивировать пластины для соответствующего количества времени. (F) За день до измерения, положить e. coli колонии в LB средней культуры трубки и инкубировать на 24 ч. (G) Лечить клетки или измерения TEER. (H) Обмен полной среде с антибиотиками свободной среде. (Я) Добавить 450 л бактериального раствора (OD600 и 0,5) в каждой верхней камере и инкубировать в течение 6 ч. (J) Образец 50 qL среды от каждой нижней камеры удаления вставки с щипточками. (K) Плита образец на агар пластин и инкубировать на 24 ч. (L) Рассчитывать колоний и анализировать данные. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60692/60692fig2large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>

Авторам нечего раскрывать.

Ограниченное понимание патогенеза микробных ограничений по обходу способствует дальнейшему развитию методов лечения POD или менингита. Смертность и заболеваемость этих заболеваний требуют более эффективного лечения пациентов, требуют исследования основных механизмов и нуждаются в надежной платформе для комплексного скрининга. Многофакторные события можно изучать с помощью бМЭК человека. Несколько успешных отчетных процедур изоляции БМЭК от ряда видов показали потерю характеристик клеток молекулярной сигнатурой52,53. Описанные THBMECs в этой процедуре были трансфицированы в очень ранних проходах, где они проявляли специфические характеристики эндотелиальных клеток мозга и сохранили их43. Это важно, потому что не все шаги в пострадавших путей были обнаружены до сих пор, и эта модель, кажется, имитирует обычные BMECs. Наша представленная модель показывает прямое влияние на BMECs и микробных обхода через BBB.
Обработка клеток THBMEC проста, и необходимое техническое оборудование существует в большинстве лабораторий науки о жизни. Наша модель позволяет немедленно начать следственные процедуры после того, как THBMECs построили плотный монослой. Поле применения может быть обширным из-за возможных комбинаций между новыми испытаниями и обычными assays such as измерение TEER или маркировка с трассерами54. Также можно добавить астроциты или перициты, чтобы сделать модель совместной или тройной культуры. Влияние наркотиков на микробные обходы также может быть проверено в нашей модели путем лечения THBMECs с соединениями, прежде чем привить верхней камеры с бактериями. На самом деле можно приобрести вставки с фильтрами для 96 колодцев, что позволяет автоматизировать процедуру. Это может способствовать внедрению высокопроизводительных систем скрининга лекарственных средств для ускорения обнаружения лекарств против упомянутых заболеваний и уменьшения побочных эффектов на BBB во время разработки лекарств.
Критическим шагом в представленном методе является время инкубации после добавления бактерий в верхнюю камеру. Важно использовать часы в качестве сроков в протоколе, потому что время генерации кишечной палочки составляет всего 20 мин55. В противном случае использование различных временных точек может привести к вводящим в заблуждение результатам. Существует также возможный риск загрязнения между верхней и нижней камерой во время бактериального воздействия, если пластины не обрабатываются с осторожностью. Любые изменения в 12 скважин пластины на данный момент может загрязнять среду в нижней камере.
E. coli является одной из известных, очень распространенной причиной бактериального менингита. Дальнейшие исследования должны проверить различные бактерии, которые также связаны с менингитом, такие как Neisseria meningitidis56 или Streptococcus pneumoniae57. Они, кажется, используют различные механизмы, чтобы пересечь BBB и должны быть лучше поняты для лечения пациентов. У пожилых пациентов, заболеваемость POD увеличивается26, а также число происходящих сопутствующих заболевания. Известно, что существуют взаимодействия между различными заболеваниями, особенно системными, как диабет. В нашей модели, можно смоделировать эти условия или лечить клетки, прежде чем добавлять бактерии.
Модель ограничена непосредственным контактом THBMECs и бактерий, и необходимы дальнейшие исследования для исследования потенциальных механизмов контакта для обнаружения соответствующих путей и белков. Тем не менее, можно удалить вставки и урожай клеток для дальнейшего анализа. TEER модели ниже по сравнению с моделями стволовых клеток38,39,40. Мы подтвердили это с помощью бактериальной концентрации, которая не пересекла BBB в необработанных клетках после 6 ч.
Таким образом, этот метод представляет собой надежную платформу для анализа обхода бактерий через BBB с потенциалом, чтобы расширить его для высокой пропускной связи наркотиков скринингов.

Человеческий BBB является уникальной границей мозговой ткани, отделяющей мозг от крови. Он строго регулирует прохождение более крупных и гидрофильных молекул, блокирует параклеточное диффузию и поддерживает гомеостаз мозга. Он также защищает мозг от плазменных колебаний, токсинов, микробов и направляет воспалительные клетки как часть иммунитета центральной нервной системы (ЦНС). С момента своего открытия сто лет назад1, многие исследования были проведены, чтобы понять структуру и функцию BBB. Сложные взаимодействия клеток, протеинов, и сигналов от мозга и крови требуют все еще более дальнеишее исследование и модели.
БББ человека состоит из трех типов клеток: микрососудистые эндотелиальные клетки мозга (БМЭК), перициты и астроциты2,3. BMECs отличаются от большинства эндотелиальных клеток в организме в том, что они обладают большим количеством плотных узлов и придерживается узлов4, низкая пиноцитотическая активность2,5, и непрерывный подвал мембраны6,7 блокировать параклеточной диффузии. Малые липофильные молекулы могут рассеиваться и проходить BBB после их градиента концентрации; более большие и гидрофильные молекулы входят или выходят мозг только через поляризованные выраженные селективные транспортные системы8. Эта регулировка приводит к высокой трансэндотелиальной электрической резистентности (TEER) в размере 1500-2000 см2, что наоборот коррелирует с проницаемостью9,10. Хотя BMECs построить жесткий барьер, они могут реагировать на местные и периферийные сигналы11,12. Существует тесное взаимодействие между BMECs и астроцитов13; астроцитов конца ноги построить слой вокруг судов и вызвать формирование плотных узлов13,14. Они участвуют в созревании BBB с различными факторами, втом ными преобразованиями фактора роста -15,16. Кроме того, перициты играют ключевую роль в регуляции ангиогенеза17 и предотвращении апоптоза эндотелия в клеточной дифференциации18 (Рисунок 1). Они встроены в мембрану подвала и обеспечивают структурную устойчивость стенки сосуда19.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60692/60692fig1.jpg"> Рисунок 1: Схематическая структура гематоэнцефалического барьера. Уникальная структура человека BBB состоит из трех различных типов клеток. Просвет микрососуд окружен эндотелиальными клетками, которые обогащаются в тесных узлах и не являются fenestrated. Они встроены в мембрану подвала, как перициты. Эти клетки важны для структурной устойчивости стенки сосуда и играют роль в развитии BBB рядом с астроцитами. Их конечные ноги построить тесный слой вокруг судна и поддерживать строительство плотных узлов. Все компоненты BBB важны для физиологической функциональности. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60692/60692fig1large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
Много различных патологий связано с коллапсом BBB (например, септической энцефалопатии). Пострадавшие пациенты имеют повышенный уровень белка в спинномозговой жидкости20, и мозг паренхима у пораженных грызунов показывает увеличение поглощения отмеченных коллоидных оксида железа и аминокислот21,22. Эти результаты указывают на повышенную проницаемость BBB, что происходит наряду с увеличением пиноцитоз в BMECs21 и эндотелиальной активации23. Другой связанной патологией, связанной с измененным BBB является менингит, неотложная медицинская помощь и комплексное воспаление сопровождается отеками головного мозга, что может привести к гибели нейрональных клеток. Основным местом входа циркулирующих бактерий, как предполагается, являются микрососуды24; однако, BBB предотвращает вход бактерий. Проницаемость BBB не всегда связана с увеличением экспериментального гематогенного менингита25 и механизмы могут быть многофакторными. Совпадение сепсиса с послеоперационным бредом (POD)26 и связь с предоперационными инфекциями27,28 указывает на необходимость модели BBB, которая позволяет прямое воздействие бактерий, чтобы получить лучшее понимание бактериального патогенеза.
Есть много пробелов в понимании и количественной оценки микробных обхода через BBB. Поэтому мы разработали модель, которая позволяет удобно тестировать различные факторы и условия с прямой корреляцией между бактериальным обходом и влиянием на проницаемость BBB. Предыдущая работа была сосредоточена на параклеточной проницаемости и включала измерения TEER и поток трассировщика. Кроме того, был проанализирован перенос макромолекулы с помощью конъюгированных молекул или антител, в которых разрабатывались различные модели, использующие только эндотелиальные клетки или комбинации с астроцитами и перицитами. Из-за трудностей в получении человеческих тканей на регулярной основе, многие животные модели используются. Мозг эндотелиальных клеток быка и свиного происхождения образуют плотные монослои с высоким TEER, которые образуют хорошо сформированную атикально-базальную полярность и подходят для исследования малых молекул транспорта через BBB. Белки отличаются по последовательности от своих человеческих homologues29,30, что делает исследование терапевтических антител трудно. По этой причине предпочтительнее может быть моделя мурина или человеческой культуры. Мышь или крысы в качестве образец источников имеют то преимущество, что получают от хорошо охарактеризованных видов, но дают несколько клеток для учебных целей. Это может быть обойден с помощью увековеченной мыши мозга эндотелиомы (END) клеточные линии bEND.3, bEND.5 или CEND31,32,33.
Первичные культивированные клетки из тканей человека трудно получить и обрабатывать на регулярной основе. Таким образом, большинство человеческих клеточных моделей, используемых в исследованиях, исследующих человеческий BBB являются увековеченными эндотелиальных клеточных линий. Опубликованная клеточная линия является микрососудистой эндотелиальной клеточной линией человека hCMEC/D3, которая хорошо подходит для изучения употребления наркотиков и проста в обращении. Клетки строят монослой и выражают характерные плотные белки соединения BBB34,тогда как уровень экспрессии claudin-5 сообщено, что более низок, чем в неповрежденных микрососудах35 и много специфических транспортеров были обнаружены на уровне транскрипта36 также, как в протеомических изучениях34. Относительно низкий TEER в диапазоне 30-50 х см2 по-прежнему является проблемой37. Другим источником эндотелиальных клеток мозга являются человеческие плюрипотентные стволовые клетки (HPSCs)38 и стволовые клетки из пуповинной крови, полученные от циркулирующих эндотелиальных прародителей и гематопоиетических линий39,40. Оба протокола дифференциации приводят к плотным клеточным монослоям и высоким значениям TEER (например, 1450 х см2 в со-культурах)38. Эти модели стволовых клеток требуют крайней осторожности для выращивания, но предлагают возможность изучить влияние регулирования гормонов41 или заболеваний с генетическим фоном42 на развитие BBB.
В этом исследовании мы установили увековеченную трансинфицированную микрососудистую эндотелиальную линию мозга человека, THBMEC43,для имитации BBB и изучения бактериального обхода. Клетки посеяны на фильтре и выросли до 100% стопроцентной в этой модели клеточной культуры. Бактерии прививаются в верхней части камеры клеточной культуры. Мы используем Escherichia coli (E. coli) в нашем выборке исследования из-за высокой заболеваемости менингитом кишечной палочки 44. Было показано, что низкая проницаемость клеточного монослой происходит между днем 13 и днем 15 после посева45. Поэтому после этого проводится обработка монослойthTH THBMEC, и бактерии затем прививаются в среде на апической поверхности монослойной поверхности. После инкубационного времени, бактерии, которые смогли пересечь барьер количественно с помощью покрытия среды с бактериями на агар пластин и подсчета колоний. Увеличение числа колоний коррелирует с более высоким бактериальным обходом через BBB. TEER составляет около 70 см246. Однако нет необходимости измерять TEER в описанном методе. Хотя это устоявленное значение для проницаемости BBB, кажется, не влияет на прохождение бактерий через BBB. Необработанные клетки служат контролем герметичности в нашей модели. В предыдущей работе было показано, что клетки способны реагировать на провоспалительные цитокины и выражать типичные плотные соединения белков47. Это позволяет для комплексного скрининга и проверки большего набора транспортер субстратов и рецепторов.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agar - Agar</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>6494.3</td>
			<td>BioScience-Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclave</td>
			<td>Systec</td>
			<td>VX-150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacteria E.coli strain GM2163</td>
			<td>Fermentas Life Sciences, Lithuania</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photometer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>6131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cells THBMEC</td>
			<td>Group of M. F. Stins</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture flasks</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>658175</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Universal 320</td>
			<td>Hettrichlab</td>
			<td>1401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen IV</td>
			<td>SIGMA Aldrich</td>
			<td>C6745</td>
			<td>from human cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess Automated Cell Counter with cell counting chamber slides and Trypan Blue stain 0.4%</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C10311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture tubes</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>191180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cuvettes</td>
			<td>BRAND</td>
			<td>759015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Di sodium hydrogen phosphate di hydrate</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>1065800500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12</td>
			<td>GIBCO/ Thermo Sc.</td>
			<td>11330032</td>
			<td>HEPES</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tubes 15 ml</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>188271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tubes 50 ml</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>227261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>GIBCO/ Thermo Sc.</td>
			<td>10270</td>
			<td>value FBS -Brazil</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>SIGMA Aldrich</td>
			<td>F0556</td>
			<td>solution human fibroblasts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heracell 150 CO2 Incubator</td>
			<td>Heraeus</td>
			<td>50116047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator shaker I 26 New Brunswick</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>M1324-0000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inoculation loop</td>
			<td>Dr. Ilona Schubert - Laborfachhandel</td>
			<td>641000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth Base</td>
			<td>GIBCO/ Thermo Sc.</td>
			<td>12780029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>GIBCO/ Thermo Sc.</td>
			<td>25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microbial incubator B 6200</td>
			<td>Heraeus</td>
			<td>51015192</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microbiological Safety Cabinet AURA 2000 M.A.C. Class II</td>
			<td>BIOAIR</td>
			<td>12469</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope inverse</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>TELAVAL 31</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro tubes 2 ml</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>72,695,400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro tubes 1,5 ml</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>72,706,400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin / Streptomycin</td>
			<td>GIBCO/ Thermo Sc.</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Dr. Ilona Schubert - Laborfachhandel</td>
			<td>464-800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Roth</td>
			<td>HN02.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium-di-hydrogen phosphate</td>
			<td>Roth</td>
			<td>P018.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Roth</td>
			<td>9265.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThinCerts + Multiwell Plates</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>665631</td>
			<td>12 well, pore size 3.0 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin - EDTA</td>
			<td>GIBCO/ Thermo Sc.</td>
			<td>15400054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuumpump Laboport</td>
			<td>KNF</td>
			<td>N 86 KT.18</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analyzing the permeability of the blood-brain barrier by microbial traversal through microvascular endothelial cells

Человеческий гематоэнцефалический барьер (BBB) характеризуется очень низкой проницаемостью для биомолекул для того, чтобы защитить и регулировать метаболизм мозга. BBB в основном формируется из эндотелиальных клеток, встроенных в коллаген IV и фибронектин богатых мембраны подвала. Несколько патологий являются результатом дисфункции BBB следуют микробные обхода, вызывая такие заболевания, как менингит. Для того, чтобы проверить влияние нескольких параметров, в том числе различных препаратов и анестезии, на проницаемость BBB мы создали новую модель культуры клеток человека, имитирующую BBB с микрососудистыми эндотелиальными клетками мозга человека. Эндотелиальные клетки выращиваются на коллагена IV и фибронектина покрытием фильтр единиц до слияния, а затем могут быть обработаны с различными соединениями интереса. Для того, чтобы продемонстрировать микробный обход, верхняя камера с актической поверхностью эндотелиальных клеток привитается бактериями. После инкубационного периода образцы нижней камеры покрываются на агарных пластинах и подсчитываютполученныеся колонии, в результате чего количество колоний коррелирует с проницаемостью BBB. Эндогенные клеточные факторы могут быть проанализированы в этой экспериментальной настройки для того, чтобы выяснить основные клеточные механизмы эндотелиальных клеток, способствующих BBB. Кроме того, эта платформа позволяет выполнять экран для соединений, которые могут повлиять на проницаемость эндотелиальных клеток. Наконец, бактериальный обход может быть изучен и связан с различными патологиями, такими как менингит. Это может быть возможным, чтобы расширить модель и проанализировать пути бактерий через BBB. В этой статье мы предоставляем подробный протокол описанного метода для исследования проницаемости BBB.

Следуя протоколу, ячейки были посеяны, и была построена модель BBB. На 14-й день после посева клетки лечились глиоксалом как реактивным альдегидом. Целью эксперимента было исследование корреляции между возрастом и диабетом в POD27 и высокой заболеваемости менингитом у пожилых пациентов48. Повышенные уровни передовых конечных продуктов гликации (AGEs) как в возрасте, так и в диабете49 требуют дальнейшего изучения влияния гликации в патогенеза микробного обхода через BBB. Гликация является неферментатической реакцией свободных аминокислотных групп в белках с карбоновыми группами, уменьшающих углеводы или другие соединения карбонила. Глюкоза хорошо известна как донор групп углерода; однако, есть более реактивные известные. После создания нестабильной базы Шиффа, они перестраиваются на более стабильные и реактивные дикарбониловые соединения, такие как глиоксал. AGEs, конечные продукты, может вызвать перекрестные связи между белками50. Они могут повредить клеточные структуры и изменить клеточную функцию путем взаимодействия с рецептором AGEs (RAGE)51.
Клетки лечились раствором глиоксала 0,05 и 0,15 мм (GO) на 1 ч, а необработанные клетки служили элементом контроля. Гликация была обнаружена с помощью иммуноблоттинга и обнаружения с анти-AGE антитела(рисунок 3). Полученные бактериальные колонии были подсчитаны и представлены как абсолютное число колоний(рисунок 4A) или относительное число колоний, нормализованных для контроля(рисунок 4B). Среда, взятая из скважин с необработанными клетками, образовала очень мало колоний. Этот результат показал, что необработанные клетки способны построить барьер и могут служить в качестве контроля. Образцы, обработанные глиоксалом, показали увеличение количества колоний, что привело к выводу, что есть влияние глиоксала на THBMECs и плотность клеточного барьера, потому что количество колоний продемонстрировало существенную разницу между необработанными и обработанными клетками. Увеличение бактериального скрещивания барьера после лечения глиоксалом может объяснить, почему диабет коррелирует с заболеваниями с распадом BBB.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60692/60692fig3a.jpg"> Рисунок 3: Обнаружение гликации белка с помощью иммуноблоттинга. THBMECs лечились GO в разных концентрациях на 1 ч. Общий белок был выделен и отделен с помощью SDS-PAGE. Гликирование белков было обнаружено с помощью иммуноблоттинга с помощью анти-AGE-антитела (CML-26). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60692/60692fig3alarge.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
В другой обстановке, гликирование белка THBMECs было индуцировано глюкозой. Стерилизованная глюкоза была добавлена в среду DMEM/F-12 для повышения концентрации глюкозы от нормальной среды глюкозы (NG) с 17,5 мм до высокой среды глюкозы (HG) с 42,5 мм. THBMECs культивировались в двух различных колбах клеточной культуры: один в нормальной среде глюкозы (NG), а другой в среде с высоким содержанием глюкозы (HG). Эти два различных носителя были также использованы для роста BBB на фильтрах в 12 скважинных пластинах. Клетки, культивируемые в среде NG, служили элементом контроля. Полученные колонии представлены как абсолютное число колоний(рисунок 4С)или относительное количество колоний, нормализованных для контроля(рисунок 4D). Результаты не показывают существенного влияния на прохождение бактерий через человека BBB, что привело к выводу, что эффект НГ против HG не был достаточно серьезным, чтобы повлиять на целостность BBB. Различные сценарии были разработаны, чтобы доказать модель и целостность клеток, имитирующих BBB.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60692/60692fig4d.jpg"> Рисунок 4: Абсолютное и относительное число подсчитанных бактериальных колоний в модели BBB с THBMECs. THBMECs лечили с 0,15 мМ GO на 1 ч, необработанные клетки служили в качестве контроля. В общей сложности в каждой верхней камере было добавлено 450 суспензий кишечной палочки (OD600 и 0,5). Средний из нижних камер был покрыт на агар пластин после 6 ч. (A) График показывает среднее среднее значение /- SEM подсчитанных колоний. (B) График показывает подсчитанные колонии, нормализованные к необработанным клеткам в качестве контроля no/- SEM (n No 4). В (C) и (D, THBMECs были культивированы в NG и HG среде. В общей сложности в каждой верхней камере было добавлено 450 суспензий кишечной палочки (OD600 и 0,5). Средний из нижней камеры был покрыт на агар пластин после 6 ч. (C) График показывает среднее среднее значение /- SEM подсчитанных колоний. (D) График показывает подсчитанные колонии, нормализованные к необработанным клеткам в качестве контроля no/- SEM (n No 3). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60692/60692fig4large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Analyzing the Permeability of the Blood-Brain Barrier by Microbial Traversal through Microvascular Endothelial Cells at JoVE.com

Analyzing the Permeability of the Blood-Brain Barrier by Microbial Traversal through Microvascular Endothelial Cells

Человеческий гематоэнцефалический барьер избирательно предотвращает проникновение в мозг гидрофильных молекул и патогенов. Несколько патологий, в том числе менингит и послеоперационный бред, связаны с повышенной проницаемостью гематоэнцефалического барьера. Здесь мы описываем модель эндотелиальной культуры клеток, чтобы проверить проницаемость барьера микробным обходом.

Анализ проницаемости барьера кровяных мозговых клеток микробным обходом через микрососудистые эндотелиальные клетки

The human blood-brain barrier (BBB) is characterized by a very low permeability for biomolecules in order to protect and regulate the metabolism of the ...

Этот метод позволяет анализировать гемово-мозговой барьер человека путем измерения бактериального обхода на различных методах лечения. Это может помочь обнаружить патогенез бактериального менингита и послеоперационный бред. Это простой метод и последствия лечения непосредственно представлены количество бактерий.Он может быть изменен, чтобы обеспечить высокую пропускную способность анализа соединений на эндотелиальных клетках. Начните с сборки пластины из 12 колодец в шкафу биологической безопасности. Распаковать пластину и каждую вставку, а затем использовать стерилизованные типсы, чтобы захватить вставки у их основания и положить их в колодцы.Пальто пористой мембраны каждой вставки с 90 микролитров 10 микрограммов на микролитр коллагена IV и фибронектина смеси и инкубировать пластину в инкубаторе клеточной культуры при 37 градусов по Цельсию в течение 24 часов. После инкубации, мыть вставки в два раза путем пипетки один миллилитр PBS в каждой вставке и аспирации его с вакуумным насосом. Затем эквилибрировать мембраны путем трубопроводов довоенной DMEM F12 среды в верхней и нижней камерах и инкубировать пластины при 37 градусов по Цельсию и 5%углекислого газа.Для семян микрососудистых эндотелиальных клеток человека, аспирировать среду из колбы клеточной культуры и мыть клетки с 10 миллилитров PBS. Обложка клетки полностью с пятью миллилитров трипсина EDTA и инкубировать колбу в течение трех-пяти минут при 37 градусов по Цельсию. Перенесите пять миллилитров клеток в 15 миллилитровую трубку и добавьте пять миллилитров FCS, содержащих среду, чтобы остановить энзиматические реакции.Центрифуга подвески в течение трех минут при 210 раз г, удалить супернатант и повторно клеточной гранулы в пять миллилитров среднего. Добавьте 10 микролитров клеточной подвески в 10 микролитров 0,4% трипана синего пятна, затем добавьте 10 микролитров смеси в счетную камеру. Поместите счетную камеру в счетчик ячеек и запустите соответствующую программу, убедившись, что счетчик сфокусирован.После подсчета, семена 200000 клеток в каждой верхней камере на 12-хорошо пластины и инкубировать пластины при 37 градусов по Цельсию в течение 14 дней изменения средств массовой информации в верхней и нижней палате каждые два-три дня. Через 14 дней убедитесь, что слияние клеток на 100% путем визуализации их с помощью микроскопа. За день до измерения проницаемости поместите одну колонию штамма E.coli GM2163 в три миллилитров среды LB.Культура клеток при 37 градусах по Цельсию в течение 24 часов в инкубационный шейкер. Для лечения клеток с соединением интереса, разбавить его до окончательной концентрации в DMEM F12 среды и добавить эту смесь в верхней и нижней камер в 12-хорошо пластины, а затем инкубировать пластины в инкубаторе культуры клеток. После инкубации, обмен полной среде с антибиотиками свободной среде.Определите концентрацию ночной бактериальной культуры, измерив ее оптическую плотность на 600 нанометров, затем разбавьте ее до OD600 из 0,5 в 50-миллилитровой трубке Falcon. В кабинет биологической безопасности добавьте 450 микролитров бактериального раствора в каждую верхнюю камеру пластины из 12 колодец, затем инкубировать пластину в течение шести часов при 37 градусах Цельсия. После инкубации снимите вставку с помощью типсов и отведать 50 микролитров среды из каждой нижней камеры, заботясь о том, чтобы не выплескить среду из верхних камер в нижние.Важно строго отделить средства массовой информации верхней и нижней палаты, так как побочный эффект от бактерий верхней палаты приведет к ложноположительному результату. Брось каждый образец на отдельную агар-пластину и скоой раствор с помощью распределитель клеток. Инкубировать пластины при 37 градусах по Цельсию в течение 24 часов, а затем рассчитывать колоний.Чтобы исследовать влияние гликации на микробный обход через геммоемафальный барьер, клетки лечились с 0,5 и 0,15 миллимолярского гликсалового раствора в течение одного часа с необработанными клетками, выступающей в качестве контроля. Затем гликация была обнаружена с помощью иммуноблотинга с антителами против AGE. Полученные бактериальные колонии были подсчитаны и представлены как абсолютное количество колоний или относительное количество колоний, нормализованных к контролю.Образцы, обработанные глиоксалом, показали увеличение количества колоний, указывающих на то, что лечение влияет на плотность клеточного барьера. Для исследования глюкозно-индуцированной гликации белка, THBMECs культивировались в нормальной глюкозы и высокой глюкозы среды. Абсолютное количество колоний и относительное количество колоний, нормализованных до контроля, показали, что глюкоза не имеет существенного влияния на целостность гем blood-brain barrier.Обработанные эндотелиальные клетки могут быть дополнительно проанализированы протеомическими подходами, например масс-спектрометрией, для анализа изменений в протеоме. Этот метод помогает в понимании гемово-мозгового барьера человека и бактериального обхода. Он может быть использован для обнаружения аспектов старения и нейродегенеративных заболеваний, таких как болезнь Альцгеймера.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Separation of Single-stranded DNA, Double-stranded DNA and RNA from an Environmental Viral Community Using Hydroxyapatite Chromatography

Разделение одноцепочечных ДНК двухцепочечной ДНК и РНК из экологического сообщества Вирусный Использование гидроксиапатита хроматографии

Viruses, particularly bacteriophages (phages), are the most numerous biological entities on Earth1,2.  Viruses modulate host cell abundance and diversity, ...

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

После Cell-судьба<em&gt; E. палочки</em&gt; После заражения фагом лямбда

The system comprising bacteriophage (phage) lambda and the bacterium E. coli has long served as a paradigm for cell-fate determination1,2. Following the ...

Generation of Recombinant Arenavirus for Vaccine Development in FDA-Approved Vero Cells

Генерация рекомбинантного ареновирус для разработки вакцины в FDA-Approved клетках Веро

The development and implementation of arenavirus reverse genetics represents a significant breakthrough in the arenavirus field  4. The use of cell-based ...

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Количественный<em&gt; В пробирке</em&gt; Анализе на определение адгезию нейтрофилов к активированным Первичные человеческие эндотелиальные клетки микрососудов в статических условиях

The vascular  endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the  acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are ...

Analyzing the Effects of Stromal Cells on the Recruitment of Leukocytes from Flow

Анализ влияния стромальных клеток на вербовкой лейкоцитов из потока

Stromal cells regulate the recruitment of circulating leukocytes during inflammation through cross-talk with neighboring endothelial cells. Here we ...

An In Vitro Model of the Blood-brain Barrier Using Impedance Spectroscopy: A Focus on T Cell-endothelial Cell Interaction

An In Vitro Model of the Blood-brain Barrier Using Impedance Spectroscopy: A Focus on T Cell-endothelial Cell Interaction

<em&gt; In Vitro</em&gt; Модель гематоэнцефалического барьера Использование импедансной спектроскопии: основноевнимание- Т-клеток-эндотелиальной клеточное взаимодействие

Breakdown of the blood-brain barrier (BBB) is a critical step in the development of autoimmune diseases such as multiple sclerosis (MS) and its animal ...

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Анализ лимфоцитов экстравазации спользование<em&gt; In Vitro</em&gt; Модель человеческого гематоэнцефалический барьер

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte ...

High-throughput Measurement of Plasma Membrane Resealing Efficiency in Mammalian Cells

Высок объём измерение плазматической мембраны запечатывания эффективность в клетках млекопитающих

In their physiological environment, mammalian cells are often subjected to mechanical and biochemical stresses that result in plasma membrane damage. In ...

Digestion of the Murine Liver for a Flow Cytometric Analysis of Lymphatic Endothelial Cells

Пищеварение мышиных печени для анализа гранулярных поток лимфы эндотелиальных клеток

Within the liver, lymphatic vessels are found within the portal triad, and their described function is to remove interstitial fluid from the liver to the ...