Name: analyzing the permeability of the blood-brain barrier by microbial traversal through microvascular endothelial cells
Uploaded: 2020-02-14T12:30:00
Duration: 6 min 26 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analyzing the Permeability of the Blood-Brain Barrier by Microbial Traversal through Microvascular Endothelial Cells at JoVE.com

Los autores reconocen a la Dra. Maryam Hussain por trabajos anteriores sobre este método, el grupo de PD Dr. Kerstin Danker (Charité-Universitétsmedizin, Berlín) por proporcionar a los THBMC y Juliane Weber para la lectura crítica del manuscrito. Este estudio fue apoyado por el RTK 2155 (ProMoAge).

1. Preparación de tampón y reactivos
<ol><li>Preparar 10x solución salina tampón de fosfato (10x PBS) añadiendo 80 g de cloruro de sodio (NaCl), 2 g de cloruro de potasio (KCl), 14,4 g de disódico-hidrógeno-fosfato dihidrato (Na2HPO4 x 2H2O) y 2 g de fosfato de potasio-dihidrógeno (KH2PO4) en un matraz de vidrio de 1 L en 1 L de doble destilado H2O. Autoclave la solución 10x PBS y diluir 100 mL de esta solución en 900 ml de agua destilada doble para obtener 1x PBS.<ol>
<li>Utilice el autoclave para esterilizar soluciones. Poner el matraz de vidrio en la cesta, cerrar la tapa y esterilizarla durante 15 min a 121oC y 98,9 kPa. NOTA: Este protocolo siempre se utiliza para autoclave de soluciones en pasos posteriores.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparar una solución de fibronectina de colágeno IV de 10 g/ml y 10 g/ml diluyendo 0,5 mg/ml de fibronectina y la solución IV de colágeno de 0,3 mg/ml, cada una con 1 x a 100 mg de alícuotas en microtubos de 1,5 ml. A partir de entonces, mezclar 100 ml de ambas alícuotas con 1.800 éL de 1pbS en microtubos de 2 ml y almacenarlos a -20 oC.</li>
	<li>Preparar el medio DMEM/F-12 añadiendo un 4% de suero bovino fetal y 2 mM de L-glutamina y 100 mg/L de penicilina/estreptomicina al medio y almacenarlo a 4oC.</li>
	<li>Preparar 1 x solución de trippsina-EDTA diluyendo 5 ml de la solución 10x concentrado de trippsina-EDTA con 45 ml de 1x PBS en un tubo de 50 ml y guárdela a 4 oC.</li>
	<li>Prepare 500 ml de medio LB pesando 10 g de base de caldo LB en un matraz de vidrio de 500 ml. Añadir 500 ml de agua esterilizada y autoclave.</li>
	<li>Prepare el agar LB pesando 10 g de base de caldo LB y 7,5 g de agar-agar en un matraz de vidrio de 500 ml. Añadir 500 ml de agua esterilizada antes de autoclave y no cerrar la tapa del matraz. Autoclave y dejar la solución para enfriar hasta que esté caliente al tacto.</li>
	<li>Preparar un medio libre de antibióticos añadiendo un 4% de suero bovino fetal y 2 mM de L-glutamina, pero sin penicilina/estreptomicina al medio DMEM/F-12 y guárdelo a 4oC como en el paso 1.3.</li>
</ol>2. Crecimiento de las células que imitan la barrera hematoencefálica
<ol><li>Para ensamblar la placa de 12 pocillos, coloque las plaquitas de cultivo celular en los pozos(Figura 2A).<ol>
<li>Desembale la placa y cada plaquita en un armario de seguridad biológica y realice más pasos allí. Utilice fórceps esterilizados para agarrar la plaquita en su amplia base para moverla.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Recubrir la membrana porosa de cada inserto con 90 ml de colágeno de 10 g/ml IV y mezcla de fibronectina de 10 g/ml. Incubar la placa de 12 pocillos durante 24 h a 37oC en una incubadora de cultivo celular(Figura 2B).</li>
	<li>Lave las plaquitas dos veces pipeteando 1 ml de 1x PBS en cada plaquita y aspire la solución con una bomba de vacío para cultivos celulares.</li>
	<li>Equilibrar las membranas pipeteando 0,5 ml de medio DMEM/F-12 precalentado en la parte superior y 1,5 ml en la cámara inferior. Incubar la placa durante 30 min a 37 oC en una incubadora de cultivo celular con una atmósfera deCO2 del 5%(Figura 2C).</li>
	<li>Semilla 2 x 105 células endoteliales microvasculares humanas en cada cámara superior e incubar la placa de 12 pocillos a 37oC en una incubadora de cultivo celular(Figura 2D).<ol>
<li>Aspirar el medio del matraz de cultivo celular utilizando una bomba de vacío para cultivos celulares y lavar la monocapa pipeteando 10 ml de 1x PBS y aspirando la solución después con una bomba de vacío.</li>
		<li>Cubra las células completamente con 1x concentrado trypsin-EDTA pipeteando 5 ml de la solución en el matraz de cultivo celular. Incubar el matraz durante 3-5 min a 37oC en una incubadora de cultivo celular. NOTA: Si las células no se disocian, toque firmemente el matraz contra la palma de la mano para desalojar las células.</li>
		<li>Tomar 5 ml con una pipeta como alícuota de la suspensión celular en un tubo de 15 ml y añadir 5 ml del medio que contiene FCS para detener la reacción enzimática.</li>
		<li>Centrifugar la suspensión durante 3 min a 210 x g,retirar el sobrenadante con una bomba de vacío y resuspender el pellet en 5 ml de medio con una pipeta.</li>
		<li>Utilice el contador de células mezclando 10 ml de la suspensión celular con 10 ml de mancha azul trypan al 0,4% en un microtubo de 1,5 ml. Agregue 10 s de la mezcla en una diapositiva de la cámara de conteo, colóquela en el contador de celdas y comience a contar.<ol>
<li>Enfoque el contador en las celdas para que su borde sea de color azul oscuro y el blanco medio. A partir de entonces, inicie el programa adecuado para el conteo de celdas.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Para calcular el volumen de cada plaquita, divida las 2 x 105 celdas obtenidas por plaquita con la concentración calculada de la suspensión celular.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Cultivo del Modelo de Barrera Blood-brain
<ol><li>Incubar la placa de 12 pocillos durante 14 días a 37oC.</li>
	<li>Cambiar 0,5 ml de medio para la cámara superior y 1,5 ml de medio para el inferior cada 2-3 días. Caliente el medio antes de ponerlo en el matraz celular. Aspirar con la bomba de vacío (Figura 2E). NOTA: Trabaje cuidadosamente para evitar tocar la membrana.</li>
	<li>Compruebe el estado de las células imágenes con un microscopio y determine la confluencia. Asegúrese de que la confluencia sea del 100% después de 14 días.</li>
</ol>4. Preparación de bacterias
<ol><li>Un día antes de la medición, ponga una colonia de la cepa E. coli GM2163 en medio LB. Incubar el tubo de cultivo durante 24 h a 37 oC con 180 rpm en una coctelera de incubación(Figura 2F).<ol>
<li>Cultivar la cepa de E. coli en una placa de agar LB a 4 oC. Tome una colonia con un pico esterilizado y ponga la selección en el tubo de cultivo preparado con 3 ml de medio LB.</li>
		<li>Prepare una placa de agar LB para cada plaquita con una solución de agar LB caliente y llene los platos Petri a la mitad de su volumen total. Dejar que se vuelvan sólidos y guardarlos a 4oC.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Tratamiento de las células
<ol><li>El día 14 después de la sembración, tratar las células con compuestos o medir la resistencia eléctrica transendotelial (TEER), si está previsto(Figura 2G). NOTA: Siempre tenga algunas células no tratadas como control.<ol>
<li>Para tratar las células con el compuesto de interés, diluir el compuesto a la concentración final en el medio DMEM/F-12. Añadir 0,5 ml de esta mezcla en la cámara superior y 1,5 ml en la cámara inferior. Incubar la placa en una incubadora de cultivo celular durante el tiempo deseado.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Después, cambie el medio completo con un medio libre de antibióticos aspirando con la bomba de vacío y el pipeteo(Figura 2H).</li>
</ol>6. Medición de la permeabilidad
<ol><li>Para obtener concentraciones constantes de bacterias, mida la densidad óptica con un fotómetro a una longitud de onda de 600 nm. Diluir la solución durante la noche de bacterias con medio LB en un tubo de halcón de 50 ml a una OD600 de 0,5 x 0,05. Trabaja en hielo.<ol>
<li>Llene 1 ml de medio LB en una cubeta. Encienda el fotómetro y coloque la cubeta, marcada hacia adelante. Pulse la parte inferior "En blanco" para medir el valor en blanco después.</li>
		<li>Mida la densidad de la solución bacteriana llenándola en una cubeta, poniéndola y presionando la muestra inferior. Repita la medición durante la dilución hasta obtener la concentración final.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Trabaje en un gabinete de seguridad biológica donde las bacterias se puedan manejar con la placa de 12 pozos preparada y la solución bacteriana en OD600 a 0,5. Añadir 450 ml de solución bacteriana solo en cada cámara superior que contenga 0,5 ml de medio(Figura 2I).</li>
	<li>Incubar la placa de 12 pocillos durante 6 h a 37oC en una incubadora. NOTA: El protocolo dicta hacer una pausa aquí.</li>
	<li>Muestre 50 s del medio con una pipeta de cada cámara inferior retirando la plaquita con fórceps(Figura 2J). Tenga cuidado de no derramar el medio de las cámaras superiores a las inferiores.</li>
	<li>Placar cada muestra en una placa de agar separada(Figura 2K). Suelte la muestra sobre la placa y extienda la solución con un esparcidor de células.</li>
	<li>Incubar las placas de agar durante 24 h a 37oC en una incubadora.</li>
	<li>Contar las colonias en cada placa(Figura 2L).</li>
</ol>7. Análisis de datos
<ol><li>Escriba los datos en una tabla y calcule la desviación media y estándar de las colonias observadas de células tratadas y no tratadas.</li>
	<li>Mostrar el promedio como el número absoluto de colonias.<ol>
<li>Para normalizar los resultados, calcule el número relativo de colonias dividiendo todos los resultados con el valor de control.</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60692/60692fig2a.jpg"> Figura 2: Presentación detallada de los pasos individuales en el protocolo. (A) Coloque las plaquitas con fórceps esterilizados en la placa de 12 pocillos. (B) Cubra cada plaquita con 90 ml de mezcla de fibronectina y colágeno IV e incubar durante 24 h. (C) Equilibrar las membranas con medio precalentado durante 30 min. (D) Semilla 2 x 105 células endoteliales microvasculares del cerebro humano por inserción. (E) Cultivar la placa durante el tiempo adecuado. (F) Un día antes de la medición, coloque una colonia de E. coli en un tubo de cultivo medio LB e incubar durante 24 h. (G) Tratar las células o medir el TEER. (H) Intercambio completo medio con medio libre de antibióticos. (I) Añadir 450 l de solución bacteriana (OD600 a 0,5) en cada cámara superior e incubar durante 6 h. (J) Muestra 50 s de medio de cada inserto de extracción de cámara inferior con fórceps. (K) Placar la muestra en placas de agar e incubar durante 24 h. (L) Contar las colonias y analizar los datos. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60692/60692fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Los autores no tienen nada que revelar.

La visión limitada de la patogénesis del recorrido microbiano limita el desarrollo de terapias para pod o meningitis. La mortalidad y la morbilidad de estas enfermedades exigen un mejor tratamiento del paciente, requieren una investigación de los mecanismos subyacentes y necesitan una plataforma robusta para el cribado de compuestos. Los eventos multifactoriales se pueden estudiar con BMECs humanos. Varios procedimientos de aislamiento notificados con éxito de BMECs de una serie de especies han mostrado una pérdida de las características de las células firma molecular52,53. Los THBME descritos en este procedimiento fueron transinfectados en pasajes muy tempranos, donde mostraron características específicas de las células endoteliales cerebrales y los preservaron43. Esto es importante, porque no todos los pasos en las vías afectadas se han descubierto hasta ahora, y este modelo parece imitar los BMEC convencionales. Nuestro modelo presentado muestra influencias directas en los BMEC y el recorrido microbiano a través del BBB.
El manejo de las células THBMEC es sencillo, y el equipo técnico requerido existe en la mayoría de los laboratorios de ciencias de la vida. Nuestro modelo permite el inicio inmediato de los procedimientos de investigación después de que los THBMEC hayan construido una monocapa apretada. El campo de las aplicaciones puede ser extenso debido a las posibles combinaciones entre nuevas pruebas y ensayos convencionales como la medición TEER o el etiquetado con trazadores54. También es posible añadir astrocitos o pericitos para hacer un modelo de co-o triple cultura. La influencia de los fármacos en el travesía microbiana también podría probarse en nuestro modelo mediante el tratamiento de los THBMEC con compuestos antes de inocular la cámara superior con bacterias. De hecho, es posible comprar inserciones con filtros para 96 placas de pozo que permiten la automatización del procedimiento. Esto puede facilitar la implementación de sistemas de detección de drogas de alto rendimiento para acelerar el descubrimiento de medicamentos contra las enfermedades mencionadas y para reducir los efectos secundarios en el BBB durante el desarrollo de fármacos.
Un paso crítico en el método presentado es el tiempo de incubación después de agregar las bacterias a la cámara superior. Es importante utilizar horas como plazos en el protocolo, porque el tiempo de generación de E. coli es sólo 20 min55. De lo contrario, el uso de diferentes puntos de tiempo podría dar lugar a resultados engañosos. También existe un posible riesgo de contaminación entre la cámara superior e inferior durante la exposición bacteriana si las placas no se manipulan con cuidado. Cualquier alteración de la placa de 12 pocillos en este punto podría contaminar el medio en la cámara inferior.
La E. coli es una causa bien conocida y muy común de meningitis bacteriana. Otras investigaciones deben probar diferentes bacterias que también están asociadas con la meningitis, como Neisseria meningitidis56 o Streptococcus pneumoniae57. Estos parecen utilizar diferentes mecanismos para cruzar el BBB y necesitan ser mejor entendidos para el tratamiento de los pacientes. En pacientes de edad avanzada, la incidencia de POD aumenta26, así como el número de comorbilidades que se producen. Se sabe que hay interacciones entre diferentes enfermedades, especialmente las sistémicas como la diabetes. En nuestro modelo, es posible simular esas condiciones o tratar las células antes de añadir las bacterias.
El modelo está limitado por el contacto directo de LOS THBMECys y bacterias, y es necesario realizar más investigaciones para investigar posibles mecanismos de contacto para detectar las vías y proteínas involucradas. Sin embargo, es posible eliminar las inserciones y cosechar las células para su posterior análisis. El TEER del modelo es más bajo en comparación con los modelos de células madre38,39,40. Lo confirmamos mediante el uso de una concentración bacteriana que no cruzó el BBB en células no tratadas después de 6 h.
En resumen, este método representa una plataforma robusta para analizar el recorrido de bacterias a través de la BBB con el potencial de expandirlo para pruebas de detección de drogas de alto rendimiento.

El BBB humano es un límite único del tejido cerebral, separando el cerebro de la sangre. Regula estrictamente el paso de moléculas más grandes e hidrófilas, bloquea la difusión paracelular y mantiene la homeostasis cerebral. También protege el cerebro de fluctuaciones plasmáticas, toxinas, microbios y guía de células inflamatorias como parte de la inmunidad del sistema nervioso central (SNC). Desde su descubrimiento hace un siglo1,se han realizado muchos estudios para entender la estructura y función del BBB. Las complejas interacciones de las células, proteínas y señales del cerebro y la sangre exigen aún más investigación y modelos.
El BBB humano se compone de tres tipos de células: células endoteliales microvasculares cerebrales (BMEC), pericitos y astrocitos2,3. Los BMEC difieren de la mayoría de las células endoteliales en el cuerpo en que poseen un alto número de uniones estrechas y adheridos uniones4, actividad pinocitotica baja2,5, y una membrana sótano continua6,7 para bloquear la difusión paracelular. Pequeñas moléculas lipofílicas pueden difundir y pasar el BBB después de su gradiente de concentración; moléculas más grandes e hidrófilas entran o salen del cerebro sólo a través de sistemas de transporte selectivo sorteados y polarizados8. Esta regulación da como resultado una alta resistencia eléctrica transendotelial (TEER) de 1.500-2.000 cm2 que está inversamente correlacionada con la permeabilidad9,10. Aunque los BMEC construyen una barrera estrecha, pueden reaccionar a las señales locales y periféricas11,12. Hay una estrecha interacción entre los BMEC y los astrocitos13; los pies de extremo astrocitos construyen una capa alrededor de los vasos e inducen la formación de uniones estrechas13,14. Están involucrados en la maduración de BBB con diferentes factores, incluyendo la transformación del factor de crecimiento (TGF-o)15,16. Además, los pericitas desempeñan un papel clave en la regulación de la angiogénesis17 y la prevención de la apoptosis del endotelio en la diferenciación celular18 (Figura 1). Están incrustados en la membrana del sótano y proporcionan estabilidad estructural de la pared del recipiente19.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60692/60692fig1.jpg"> Figura 1: Estructura esquemática de la barrera hematoencefálica. La estructura única del BBB humano se compone de tres tipos de células diferentes. El lumen microvascular está rodeado de células endoteliales, que se enriquecen en uniones estrechas, y no están fenderadas. Están incrustados en la membrana del sótano, como los pericytes. Estas células son importantes para la estabilidad estructural de la pared del recipiente y juegan un papel en el desarrollo del BBB junto a los astrocitos. Sus pies de punta construyen una capa cercana alrededor de la embarcación y apoyan la construcción de uniones estrechas. Todos los componentes del BBB son importantes para la funcionalidad fisiológica. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60692/60692fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Muchas patologías diferentes están relacionadas con el colapso de la BBB (por ejemplo, encefalopatía séptica). Los pacientes afectados han aumentado los niveles de proteína en el líquido cefalorraquídeo20, y el parénquima cerebral en los roedores afectados muestra una mayor aceptación de marcado óxido de hierro coloidal y aminoácidos21,22. Estos resultados apuntan hacia una mayor permeabilidad del BBB que se produce junto con un aumento de la pinoocitosis en BMECs21 y activación endotelial23. Otra patología asociada relacionada con un BBB alterado es la meningitis, una emergencia médica y una inflamación compleja acompañada de edema cerebral que puede conducir a la muerte celular neuronal. Se supone que el principal lugar de entrada de las bacterias circulantes son los microvasculares24; sin embargo, el BBB impide la entrada de bacterias. La permeabilidad del BBB no siempre está relacionada con un aumento de la meningitis hematogenaexperimental 25 y los mecanismos pueden ser multifactoriales. La coincidencia de la sepsis con el delirio postoperatorio (POD)26 y la asociación con infecciones preoperatorias27,28 indica la necesidad de un modelo BBB que permita la exposición directa a las bacterias para obtener una mejor comprensión de la patogénesis bacteriana.
Hay muchas lagunas en la comprensión y cuantificación del recorrido microbiano a través del BBB. Por lo tanto, desarrollamos un modelo que permite una prueba conveniente de diferentes factores y condiciones con una correlación directa entre el traversal bacteriano y las influencias en la permeabilidad del BBB. El trabajo anterior se centró en la permeabilidad paracelular e incluyó la medición TEER y el flujo del trazador. Además, el transporte de macromoléculas fue analizado por moléculas conjugadas o anticuerpos, por lo que se desarrollaron diferentes modelos utilizando sólo células endoteliales o combinaciones con astrocitos y pericitos. Debido a la dificultad para obtener tejido humano de forma regular, se utilizan muchos modelos de origen animal. Las células endoteliales cerebrales de origen bovino y porcino forman monocapas apretadas con un TEER alto que forman una polaridad apical-basal bien formada y son adecuadas para investigaciones de transporte de moléculas pequeñas a través de la BBB. Las proteínas difieren en secuencia de sus homólogos humanos29,30, lo que dificulta la investigación de anticuerpos terapéuticos. Por esta razón, los modelos de cultura humana o murina pueden ser preferibles. Ratón o ratas como fuentes de muestra tienen la ventaja de ser obtenidos de especies bien caracterizadas, pero producen pocas células con fines de estudio. Esto puede ser eludido por el uso de líneas celulares de endotelioma cerebral de ratón inmortalizado (END) bEND.3, bEND.5 o cEND31,32,33.
Las células cultivadas primarias del tejido humano son difíciles de obtener y manejar de forma regular. Por lo tanto, la mayoría de los modelos celulares humanos utilizados en la investigación que investiga el BBB humano son líneas celulares endoteliales inmortalizadas. Una línea celular publicada es la línea celular endotelial microvascular humano hCMEC/D3, que es muy adecuada para estudiar la utilización de fármacos y es fácil de manejar. Las células construyen una monocapa y expresan las proteínas de unión estrecha características de la BBB34,mientras que el nivel de expresión de la claudina-5 se informa que es inferior al de los microrecipientes intactos35 y se han detectado muchos transportadores específicos en el nivel de transcripción36, así como en los estudios proteómicos34. Un TEER relativamente bajo en el rango de 30-50 cm2 sigue siendo un desafíode 37. Otra fuente de células endoteliales cerebrales son las células madre pluripotentes humanas (hPSC)38 y las células madre derivadas de la sangre del cordón humano del progenitor endotelial circulante y los linajes hematopoyéticos39,40. Ambos protocolos de diferenciación dan como resultado monocapas celulares estrechas y valores TEER altos (por ejemplo, 1.450 cm2 en cocultivos)38. Estos modelos de células madre requieren un cuidado extremo para el cultivo, sin embargo, ofrecen la oportunidad de estudiar la influencia de la regulación de las hormonas41 o enfermedades con antecedentes genéticos42 en el desarrollo de BBB.
En este estudio, establecimos una línea celular endotelial del cerebro humano transfectóina inmortalizada, THBMEC43,para imitar el BBB y estudiar el traversal bacteriano. Las celdas se sembran en un filtro y crecen hasta el 100% de confluencia en este modelo de cultivo celular. Las bacterias se inoculan en la parte superior de la cámara de cultivo celular. Utilizamos Escherichia coli (E. coli) en nuestro estudio de muestra debido a la alta incidencia de E. coli meningitis44. Se ha demostrado que la permeabilidad más baja de la monocapa celular ocurre entre el día 13 y el día 15 después de la sembración45. Por lo tanto, el tratamiento de la monocapa THBMEC se realiza después de este tiempo y las bacterias se inoculan después en el medio en la superficie apical de la monocapa. Después de un tiempo de incubación, las bacterias que fueron capaces de cruzar la barrera se cuantifican a través de medio de chapado con las bacterias en las placas de agar y contando las colonias. Un mayor número de colonias se correlaciona con un mayor travesario bacteriano a través de la BBB. El TEER es de unos 70 cm246. Sin embargo, no es necesario medir el TEER en el método descrito. Aunque es un valor bien establecido para la permeabilidad de la BBB, parece no tener ningún impacto en el travesía de bacterias a través de la BBB. Las células no tratadas sirven como un control de la tensión en nuestro modelo. Se ha demostrado en trabajos anteriores que las células son capaces de reaccionar a las citoquinas proinflamatorias y expresar proteínas típicas de unión estrecha47. Esto permite el cribado compuesto y la validación de un conjunto más grande de sustratos y receptores transportadores.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agar - Agar</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>6494.3</td>
			<td>BioScience-Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclave</td>
			<td>Systec</td>
			<td>VX-150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacteria E.coli strain GM2163</td>
			<td>Fermentas Life Sciences, Lithuania</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photometer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>6131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cells THBMEC</td>
			<td>Group of M. F. Stins</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture flasks</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>658175</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Universal 320</td>
			<td>Hettrichlab</td>
			<td>1401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen IV</td>
			<td>SIGMA Aldrich</td>
			<td>C6745</td>
			<td>from human cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess Automated Cell Counter with cell counting chamber slides and Trypan Blue stain 0.4%</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C10311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture tubes</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>191180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cuvettes</td>
			<td>BRAND</td>
			<td>759015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Di sodium hydrogen phosphate di hydrate</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>1065800500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12</td>
			<td>GIBCO/ Thermo Sc.</td>
			<td>11330032</td>
			<td>HEPES</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tubes 15 ml</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>188271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tubes 50 ml</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>227261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>GIBCO/ Thermo Sc.</td>
			<td>10270</td>
			<td>value FBS -Brazil</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>SIGMA Aldrich</td>
			<td>F0556</td>
			<td>solution human fibroblasts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heracell 150 CO2 Incubator</td>
			<td>Heraeus</td>
			<td>50116047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator shaker I 26 New Brunswick</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>M1324-0000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inoculation loop</td>
			<td>Dr. Ilona Schubert - Laborfachhandel</td>
			<td>641000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth Base</td>
			<td>GIBCO/ Thermo Sc.</td>
			<td>12780029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>GIBCO/ Thermo Sc.</td>
			<td>25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microbial incubator B 6200</td>
			<td>Heraeus</td>
			<td>51015192</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microbiological Safety Cabinet AURA 2000 M.A.C. Class II</td>
			<td>BIOAIR</td>
			<td>12469</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope inverse</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>TELAVAL 31</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro tubes 2 ml</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>72,695,400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro tubes 1,5 ml</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>72,706,400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin / Streptomycin</td>
			<td>GIBCO/ Thermo Sc.</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Dr. Ilona Schubert - Laborfachhandel</td>
			<td>464-800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Roth</td>
			<td>HN02.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium-di-hydrogen phosphate</td>
			<td>Roth</td>
			<td>P018.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Roth</td>
			<td>9265.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThinCerts + Multiwell Plates</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>665631</td>
			<td>12 well, pore size 3.0 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin - EDTA</td>
			<td>GIBCO/ Thermo Sc.</td>
			<td>15400054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuumpump Laboport</td>
			<td>KNF</td>
			<td>N 86 KT.18</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analyzing the permeability of the blood-brain barrier by microbial traversal through microvascular endothelial cells

La barrera hematoencefálica humana (BBB) se caracteriza por una permeabilidad muy baja para las biomoléculas con el fin de proteger y regular el metabolismo del cerebro. El BBB se forma principalmente a partir de células endoteliales incrustadas en membranas de sótano ricas en colágeno IV y fibronectina. Varias patologías son el resultado de la disfunción del BBB seguidas de un traversal microbiano, causando enfermedades como la meningitis. Con el fin de probar el efecto de múltiples parámetros, incluyendo diferentes fármacos y anestésicos, en la permeabilidad del BBB establecimos un novedoso modelo de cultivo celular humano imitando el BBB con células endoteliales microvasculares del cerebro humano. Las células endoteliales se cultivan en unidades de filtro recubiertas de colágeno IV y fibronectina hasta la confluencia y luego pueden ser tratadas con diferentes compuestos de interés. Con el fin de demostrar un travesía microbiana, la cámara superior con la superficie apical de las células endoteliales se inocula con bacterias. Después de un período de incubación, las muestras de la cámara inferior se chapan en placas de agar y se cuentan las colonias obtenidas, por lo que el número de colonias se correlaciona con la permeabilidad del BBB. Los factores celulares endógenos se pueden analizar en esta configuración experimental con el fin de dilucidar los mecanismos celulares básicos de las células endoteliales que contribuyen a la BBB. Además, esta plataforma permite realizar una pantalla para compuestos que podrían afectar a la permeabilidad de las células endoteliales. Por último, el traversal bacteriano puede ser estudiado y vinculado a diferentes patologías, como la meningitis. Es posible extender el modelo y analizar las vías de las bacterias a través de la BBB. En este artículo, proporcionamos un protocolo detallado del método descrito para investigar la permeabilidad del BBB.

Siguiendo el protocolo, las células fueron sembradas, y el modelo BBB fue construido. En el día 14 después de la sembración, las células fueron tratadas con gluoxal como un aldehído reactivo. El objetivo del experimento fue investigar la correlación entre la edad y la diabetes en el POD27 y la alta incidencia de meningitis en pacientes de edad avanzada48. El aumento de los niveles de productos finales de glicación avanzada (AGE) tanto en la edad como en la diabetes49 exige un examen más profundo del efecto de la glicación en la patogénesis del traversal microbiano a través de la BBB. La glicación es una reacción no enzimática de grupos amino libres en proteínas con grupos de carbonilo de reducción de carbohidratos u otros compuestos de carbonilo. La glucosa es bien conocida como donante de grupos de carbonilo; sin embargo, hay más reactivos conocidos. Después de construir la base de un Schiff inestable, se reorganizan a compuestos dicarbonilo más estables y reactivos como el gluoxal. Las EDADES, los productos finales, pueden provocar vínculos cruzados entre las proteínas50. Pueden dañar las estructuras celulares y alterar la función celular por interacción con el receptor de AGEs (RAGE)51.
Las células se trataron con una solución gluoxal (GO) de 0,05 y 0,15 mM durante 1 h, y las células no tratadas sirvieron como control. La glicación se detectó mediante inmunoblotting y detección con un anticuerpo anti-AGE(Figura 3). Las colonias bacterianas obtenidas se contaron y representaron como el número absoluto de colonias(Figura 4A)o el número relativo de colonias normalizadas al control(Figura 4B). El medio tomado de pozos con las células no tratadas formaba muy pocas colonias. Este resultado demostró que las células no tratadas eran capaces de construir una barrera y podían servir de control. Las muestras tratadas con gluoxal mostraron un mayor número de colonias, lo que llevó a la conclusión de que hay un efecto de gluoxal en los THBMC y la densidad de la barrera celular, porque el número de colonias demostró una diferencia significativa entre las células no tratadas y las tratadas. El aumento del cruce bacteriano de la barrera después del tratamiento con gluoxal podría explicar por qué la diabetes está correlacionada con enfermedades con una descomposición de BBB.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60692/60692fig3a.jpg"> Figura 3: Detección de glicación de proteínas a través de inmunoblotting. Los THBC fueron tratados con GO a diferentes concentraciones durante 1 h. La proteína total se aisló y se separó utilizando SDS-PAGE. La glicación de las proteínas se detectó mediante inmunoblotting utilizando anticuerpos anti-AGE (LMC-26). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60692/60692fig3alarge.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
En un entorno diferente, la glicación proteica de los THBME cinceladores fue inducida por glucosa. La glucosa esterilizada se añadió al medio DMEM/F-12 para aumentar la concentración de glucosa desde el medio normal de glucosa (NG) con 17,5 mM a medio de glucosa alta (HG) con 42,5 mM. Los THBCC se cultivaron en dos matraces de cultivo celular diferentes: uno en medio normal de glucosa (NG) y el otro en medio de glucosa alta (HG). Estos dos medios diferentes también se utilizaron para el crecimiento de la BBB en filtros en 12 placas de pozo. Las células cultivadas en medio NG sirvieron de control. Las colonias obtenidas se representan como el número absoluto de colonias(Figura 4C)o el número relativo de colonias normalizadas al control(Figura 4D). Los resultados no indican ningún efecto significativo en el travesía de bacterias a través de la BBB humana, lo que lleva a la conclusión de que el efecto de NG vs HG no fue lo suficientemente grave como para afectar la integridad de la BBB. Los diferentes escenarios fueron diseñados para probar el modelo y la integridad de las células que imitan el BBB.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60692/60692fig4d.jpg"> Figura 4: Números absolutos y relativos de colonias bacterianas contadas en el modelo BBB con THBMECs. Los THBME se trataron con 0,15 mM GO durante 1 h, células no tratadas servidas como control. Se añadieron un total de 450 s l de suspensión de E. coli (600 o 0,5 d.C. a 0,5) a cada cámara superior. Medium from the lower chambers was plated on agar plates after 6 h. (A) The graph shows the average mean +/- SEM of counted colonies. (B) El gráfico muestra las colonias contadas normalizadas a las células no tratadas como control +/- SEM (n x 4). En (C) y (D), los THBMEC se cultivaron en NG y medio HG. Se añadieron un total de 450 s l de suspensión de E. coli (600 o 0,5 d.C. a 0,5) a cada cámara superior. Medium from the lower chamber was plated on agar plates after 6 h. (C) The graph shows the average mean +/- SEM of counted colonies. (D) El gráfico muestra las colonias contadas normalizadas a las células no tratadas como control +/- SEM (n.o 3). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60692/60692fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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Analyzing the Permeability of the Blood-Brain Barrier by Microbial Traversal through Microvascular Endothelial Cells

La barrera hematoencefálica humana previene selectivamente la penetración de moléculas hidrófilas y patógenos en el cerebro. Varias patologías, incluyendo meningitis y delirio postoperatorio, se asocian con una mayor permeabilidad de la barrera hematoencefálica. Aquí, describimos un modelo de cultivo celular endotelial para probar la permeabilidad de barrera por travesía microbiana.

Análisis de la permeabilidad de la barrera hematoencefálica mediante travesía microbiana a través de células endoteliales microvasculares

The human blood-brain barrier (BBB) is characterized by a very low permeability for biomolecules in order to protect and regulate the metabolism of the ...

Este método permite analizar la barrera hematoencefálica humana midiendo el traversal bacteriano en diferentes tratamientos. Puede ayudar a descubrir la patogénesis de la meningitis bacteriana y delirio postoperatorio. Es un método sencillo y los efectos del tratamiento están representados directamente por el número de bacterias.Se puede modificar para permitir un análisis de alto rendimiento de compuestos en las células endoteliales. Comience por ensamblar la placa de 12 pozos en un armario de seguridad biológica. Desembale la placa y cada plaquita, luego use fórceps esterilizados para agarrar las plaquitas en su base y ponerlas en los pozos.Recubrir la membrana porosa de cada plaquita con 90 microlitros de 10 microgramos por microlitro colágeno IV y mezcla de fibronectina e incubar la placa en una incubadora de cultivo celular a 37 grados celsius durante 24 horas. Después de la incubación, lave las plaquitas dos veces pipeteando un mililitro de PBS en cada plaquita y aspirando con una bomba de vacío. A continuación, equilibre las membranas pipeteando el medio DMEM F12 precalentado en las cámaras superior e inferior e incubar la placa a 37 grados centígrados y 5% dióxido de carbono.Para sembrar las células endoteliales microvasculares humanas, aspirar el medio del matraz de cultivo celular y lavar las células con 10 mililitros de PBS. Cubra las células completamente con cinco mililitros de trippsina EDTA e incubar el matraz durante tres a cinco minutos a 37 grados centígrados. Transfiera cinco mililitros de las células a un tubo de 15 mililitros y agregue cinco mililitros de FCS que contengan un medio para detener la reacción enzimática.Centrifugar la suspensión durante tres minutos a 210 veces g, quitar el sobrenadante y resuspender el pellet celular en cinco mililitros de medio. Añadir 10 microlitros de la suspensión celular a 10 microlitros de 0.4%trypan mancha azul, luego añadir 10 microlitros de la mezcla a una cámara de conteo. Coloque la cámara de conteo en el contador de celdas e inicie el programa adecuado asegurándose de que el contador esté enfocado.Después de contar, sembrar 200.000 células en cada cámara superior en la placa de 12 pozos e incubar la placa a 37 grados Cent celsius durante 14 días cambiando los medios en la cámara superior e inferior cada dos a tres días. Después de 14 días, asegúrese de que la confluencia celular sea 100% mediante imágenes con un microscopio. Un día antes de la medición de la permeabilidad, poner una colonia de cepa de E.coli GM2163 en tres mililitros de medio LB.Cultivo de las células a 37 grados Celsius durante 24 horas en un agitador de incubación. Para tratar las células con un compuesto de interés, diluirla a su concentración final en el medio DMEM F12 y añadir esta mezcla en las cámaras superior e inferior en la placa de 12 pozos, luego incubar la placa en una incubadora de cultivo celular. Después de la incubación, cambie el medio completo por medio libre de antibióticos.Determinar la concentración del cultivo bacteriano durante la noche midiendo su densidad óptica a 600 nanómetros, luego diluirlo a un OD600 de 0.5 en un tubo Falcon de 50 mililitros. En un gabinete de seguridad biológica, agregue 450 microlitros de la solución bacteriana en cada cámara superior de la placa de 12 pozos, luego incubar la placa durante seis horas a 37 grados centígrados. Después de la incubación, retire el inserto con fórceps y muestree 50 microlitros del medio de cada cámara inferior teniendo cuidado de no derramar el medio de las cámaras superiores en las inferiores.Es importante separar estrictamente los medios de la cámara superior e inferior, ya que un derrame de bacterias de la cámara superior conduciría a resultados falsos positivos. Suelte cada muestra en una placa de agar separada y raye la solución con un esparcidor celular. Incubar las placas a 37 grados centígrados durante 24 horas, luego contar las colonias.Para investigar el efecto de la glicación en el traversal microbiano a través de la barrera hematoencefálica, las células se trataron con una solución de glioxal de 0,5 y 0,15 mililitrolares durante una hora con células no tratadas que sirven como control. La glicación se detectó entonces a través de inmunoblotting con anticuerpos anti-AGE. Las colonias bacterianas obtenidas fueron contadas y representadas como el número absoluto de colonias o el número relativo de colonias normalizadas al control.Las muestras tratadas con glioxal mostraron un mayor número de colonias que indicaron que el tratamiento tiene un efecto sobre la densidad de la barrera celular. Para investigar la glicación proteica inducida por glucosa, se cultivaron THBMECs en glucosa normal y medio de glucosa alto. El número absoluto de colonias y el número relativo de colonias normalizadas al control indicaron que la glucosa no tuvo ningún efecto significativo en la integridad de la barrera hematoencefálica.Las células endoteliales tratadas se pueden analizar más a fondo mediante enfoques proteómicos, por ejemplo espectrometría de masas, para analizar los cambios en el proteomo. Esta técnica ayuda a entender la barrera hematoencefálica humana y el travesancia bacteriana. Se puede utilizar para descubrir aspectos del envejecimiento y enfermedades neurodegenerativas como la enfermedad de Alzheimer.

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