Name: analyzing the permeability of the blood-brain barrier by microbial traversal through microvascular endothelial cells
Uploaded: 2020-02-14T12:30:00
Duration: 6 min 26 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analyzing the Permeability of the Blood-Brain Barrier by Microbial Traversal through Microvascular Endothelial Cells at JoVE.com

Författarna erkänner Dr Maryam Hussain för tidigare arbete på denna metod, gruppen pd Dr Kerstin Danker (Charité-Universitätsmedizin, Berlin) för att tillhandahålla THBMCs och Juliane Weber för kritiskt läsa manuskriptet. Denna studie stöddes av RTK 2155 (ProMoAge).

1. Beredning av buffert och reagenser
<ol><li>Förbered 10x fosfatbuffertsaltlösning (10x PBS) genom att lägga till 80 g natriumklorid (NaCl), 2 g kaliumklorid (KCl), 14,4 g disnatriumvätefosfatdihydrat (Na2HPO4 · 2H2O) och 2 g kaliumdivätefosfat (KH2PO4)i en 1 L glaskolv i 1 L dubbeldestillrat H2O. Autoklav 10x PBS-lösningen och späd 100 ml av denna lösning i 900 ml dubbeldestillerat vatten för att få 1x PBS.<ol>
<li>Använd autoklaven för att sterilisera lösningar. Lägg glaskolven i korgen, stäng locket och sterilisera den i 15 min vid 121 °C och 98,9 kPa. DET här protokollet används alltid för automatiska lösningar i ytterligare steg.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Förbered en 10 μg/mL kollagen IV och 10 μg/mL fibronectin lösning genom spädning 0,5 mg/mL fibronectin lösning och 0,3 mg/ml kollagen IV lösning vardera med 1x PBS till 100 mg/μL alikvoter i 1,5 mL mikrorör. Därefter blanda 100 μL av båda alikvoterna med 1 800 μl 1x PBS i 2 ml mikrorör och förvara dem vid -20 °C.</li>
	<li>Förbered DMEM/F-12 medium genom att lägga till 4% fetalt bovinserum och 2 mM L-glutamin och 100 mg/L penicillin/streptomycin till mediet och förvara det vid 4 °C.</li>
	<li>Förbered 1x trypsin-EDTA lösning genom att späda 5 ml av 10x koncentrerad trypsin-EDTA lösning med 45 ml 1x PBS i ett 50 ml rör och förvara den vid 4 °C.</li>
	<li>Förbered 500 ml LB medium genom att väga 10 g LB buljongbas i en 500 ml glaskolv. Tillsätt 500 ml steriliserat vatten och autoklav det.</li>
	<li>Förbered LB agar genom att väga 10 g LB buljongbas och 7,5 g agar-agar i en 500 ml glaskolv. Tillsätt 500 ml steriliserat vatten före automatisk lutning och stäng inte kolvens lock. Autoklav och låt lösningen svalna tills den är varm vid beröring.</li>
	<li>Förbered antibiotikafritt medium genom att lägga till 4% fetalt bovinserum och 2 mM L-glutamin, men ingen penicillin/streptomycin till DMEM/F-12 medium och förvara det vid 4 °C som i steg 1.3.</li>
</ol>2. Tillväxten av blod- hjärnbarriären Härma celler
<ol><li>För att montera 12 brunnsplattan, sätt cellodlingsskären i brunnarna(figur 2A).<ol>
<li>Packa upp plattan och varje insats i ett biologiskt säkerhetsskåp och utför ytterligare steg där. Använd steriliserade pincett för att ta tag i insatsen vid dess breda bas för att flytta den.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Täck det porösa membranet för varje insats med 90 μl 10 μg/ml kollagen IV och 10 μg/mL fibronectin blandning. Inkubera 12 brunnsplattan för 24 h vid 37 °C i en cellkulturinkubator (figur 2B).</li>
	<li>Tvätta skären två gånger genom att pipetting 1 ml 1x PBS i varje skär och aspirera lösningen med en vakuumpump för cellkulturer.</li>
	<li>Jämviktmembranen genom att pipetting 0,5 ml förvärmt DMEM/F-12 medium i övre och 1,5 ml i den nedre kammaren. Inkubera plattan i 30 min vid 37 °C i en cellkulturinkubator med 5% CO2 atmosfär(figur 2C).</li>
	<li>Frö 2 x 105 humana mikrovaskulära endotelceller i varje övre kammare och inkubera 12 brunnsplattan vid 37 °C i en cellkulturinkubator (figur 2D).<ol>
<li>Sug upp mediet från cellodlingskolven med hjälp av en vakuumpump för cellkulturer och tvätta monolayer genom att pipetta 10 ml PBS och aspirera lösningen efteråt med en vakuumpump.</li>
		<li>Täck cellerna helt med 1x koncentrerad trypsin-EDTA genom att pipettering 5 ml av lösningen i cellodlingskolven. Inkubera kolven i 3-5 min vid 37 °C i en cellkulturinkubator. OBS: Om cellerna inte separeras, knacka kolven ordentligt mot handflatan för att lossa cellerna.</li>
		<li>Ta 5 ml med en pipett som en alikvot från cellsuspensionen i ett 15 ml-rör och tillsätt 5 ml av FCS-innehållande medium för att stoppa den enzymatiska reaktionen.</li>
		<li>Centrifugera fjädringen i 3 min vid 210 x g, ta bort supernatanten med en vakuumpump och återsuspenda pelleten i 5 ml medium med en pipett.</li>
		<li>Använd cellräknaren genom att blanda 10 μl cellsuspension med 10 μL 0,4 % trypanblå fläck i ett mikrorör på 1,5 ml. Tillsätt 10 μl av blandningen i en räkningkammare stänk, lägg den i cellräknaren och börja räkna.<ol>
<li>Fokusera räknaren på cellerna så att deras kant är mörkblå och den mellersta vita. Därefter starta lämpligt program för cellräkning.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Om du vill beräkna volymen för varje skär delar du de erhållna 2 x 105 cellerna per skär med den beräknade koncentrationen av cellsuspensionen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Odling av blod- hjärnbarriärmodellen
<ol><li>Inkubera 12 brunnsplattan i 14 dagar vid 37 °C.</li>
	<li>Ändra 0,5 ml medium för den övre kammaren och 1,5 ml medium för den nedre var 2-3 dagar. Värm mediet innan du sätter det i cellkolven. Aspirera med vakuumpumpen(figur 2E). OBS: Arbeta noggrant för att undvika att röra vid membranet.</li>
	<li>Kontrollera cellernas status genom att avbilda dem med ett mikroskop och bestämma confluency. Se till att sammanflödet är 100% efter 14 dagar.</li>
</ol>4. Beredning av bakterier
<ol><li>En dag före mätning, sätta en koloni av E. coli stam GM2163 i LB medium. Inkubera kulturröret för 24 h vid 37 °C med 180 rpm i en inkubationsshaker (figur 2F).<ol>
<li>Odla E. coli-stammen på en LB-agarplatta vid 4 °C. Ta en koloni med ett steriliserat val och lägg plockningen i det förberedda kulturröret med 3 ml LB medium.</li>
		<li>Förbered en LB agar platta för varje insats med varm LB agar lösning och fyll Petri rätter till hälften av deras totala volym. Låt dem bli fasta och förvara dem vid 4 °C.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Behandling av celler
<ol><li>Dag 14 efter sådd, behandla celler med föreningar eller mäta transendotelelektriska motstånd (TEER), om det planeras(figur 2G). OBS: Ha alltid några obehandlade celler som en kontroll.<ol>
<li>För att behandla celler med intressesammansättning, späd ut föreningen till den slutliga koncentrationen i DMEM/F-12 medium. Tillsätt 0,5 ml av denna blandning i den övre kammaren och 1,5 ml i den nedre kammaren. Inkubera plattan i en cellkulturinkubator för önskad tid.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Därefter byt ut hela mediet med antibiotikafritt medium genom att aspirera med vakuumpumpen och pipettering (Figur 2H).</li>
</ol>6. Mätning av permeabilitet
<ol><li>För att få konstanta koncentrationer av bakterier, mäta den optiska densiteten med en fotomätare vid en våglängd på 600 nm. Späd över natten lösning av bakterier med LB medium i en 50 ml falk rör till en OD600 på 0,5 ± 0,05. Arbetet med is.<ol>
<li>Fyll 1 ml LB medium i en cuvette. Starta fotomätaren och sätt cuvette i, markerad sida framåt. Tryck på botten "Blank" för att mäta det tomma värdet efteråt.</li>
		<li>Mät tätheten av bakterielösningen genom att fylla den i en cuvette, sätta den i, och trycka på det nedre provet. Upprepa mätningen under spädningen tills den slutliga koncentrationen erhålls.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Arbeta i ett biologiskt säkerhetsskåp där bakterier kan hanteras med den förberedda 12 brunnsplattan och bakterielösningen vid OD600 = 0,5. Tillsätt 450 μl bakterielösning endast i varje övre kammare som innehåller 0,5 ml medium(figur 2I).</li>
	<li>Inkubera 12 brunnsplattan för 6 h vid 37 °C i en inkubator. Obs: Protokollet dikterar för att pausa här.</li>
	<li>Prov 50 μl medium med en pipett från varje nedre kammare genom att ta bort insatsen med pincett(figur 2J). Var noga med att inte spilla mediet från de övre kamrarna till de nedre.</li>
	<li>Platta varje prov på en separat agarplatta(figur 2K). Släpp provet på plattan och strimmor lösningen med en cellspridare.</li>
	<li>Inkubera agarplattorna för 24 h vid 37 °C i en inkubator.</li>
	<li>Räkna kolonierna i varje platta (figur 2L).</li>
</ol>7. Analysera data
<ol><li>Skriv data i en tabell och beräkna den genomsnittliga och standardavvikelsen för de observerade kolonierna av behandlade och obehandlade celler.</li>
	<li>Visa genomsnittet som det absoluta antalet kolonier.<ol>
<li>För att normalisera resultaten, beräkna det relativa antalet kolonier genom att dela alla resultat med kontrollvärdet.</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60692/60692fig2a.jpg"> Bild 2: Detaljerad presentation av de enskilda stegen i protokollet. (A)Sätt skären med steriliserade pincett i 12 brunnsplattan. (B)Täck varje insats med 90 μl fibronectin- och kollagen IV-blandning och inkubera i 24 h. (C)Jämkna membranen med förvärmt medium i 30 min. (D)Frö 2 x 105 human adovaskulära endotelceller per insats. (E)Odla plattan under lämplig tid. (F)En dag före mätning, sätta en E. coli koloni i en LB medium kultur rör och inkubera för 24 h. (G) Behandla celler eller mäta TEER. (H)Byt komplett medium med antibiotikafritt medium. (I)Tillsätt 450 μl bakterielösning (OD600 = 0,5) i varje övre kammare och inkubera i 6 h. (J)Prov 50 μL medium från varje nedre kammare som tar bort insatsen med pincett. (K)Platta provet på agarplattor och inkubera i 24 timmar (L) Räkna kolonierna och analysera data. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60692/60692fig2large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>

Författarna har inget att avslöja.

Begränsad insikt i patogenesen vid mikrobiell traversal begränsar vidareutveckling av terapier för POD eller hjärnhinneinflammation. Dödligheten och sjukligheten hos dessa sjukdomar kräver bättre patientbehandling, kräver forskning av de underliggande mekanismerna och behöver en robust plattform för sammansatt screening. Multifaktorial händelserna kan studeras med mänskliga BMECs. Flera framgångsrika rapporterade isoleringsförfaranden för BMECs från ett antal arter har visat en förlust av cellernas egenskaper molekylär signatur52,53. De beskrivna THBMECs i detta förfarande transfected i mycket tidiga passager, där de uppvisade specifika hjärnan endotel cell egenskaper och bevarade dem43. Detta är viktigt, eftersom inte alla steg i de drabbade vägarna har upptäckts hittills, och denna modell verkar efterlikna konventionella BMECs. Vår presenterade modell visar direkta influenser på BMECs och den mikrobiella traversal genom BBB.
Hanteringen av THBMEC-celler är enkel, och den nödvändiga tekniska utrustningen finns i de flesta life science laboratorier. Vår modell möjliggör en omedelbar start av utredningsförfaranden efter att THBMECs har byggt en stram monolayer. Användningsområdena kan vara omfattande på grund av möjliga kombinationer mellan nya tester och konventionella analyser som TEER-mätning eller märkning med spårämnen54. Det är också möjligt att lägga astrocyter eller pericyter för att göra en co- eller triple-culture modell. Påverkan av läkemedel på den mikrobiella traversal kan också testas i vår modell genom att behandla THBMECs med föreningar innan man inokulera den övre kammaren med bakterier. I själva verket är det möjligt att köpa skär med filter för 96 brunnsplattor som möjliggör automatisering av förfarandet. Detta kan underlätta genomförandet av höggenomströmning av läkemedel screening system för att påskynda upptäckten av läkemedel mot de nämnda sjukdomarna och att minska biverkningar na på BBB under läkemedelsutveckling.
Ett kritiskt steg i den presenterade metoden är inkubationstiden efter att ha lagt till bakterierna i den övre kammaren. Det är viktigt att använda timmar som tidslinjer i protokollet, eftersom genereringstiden för E. coli bara är 20 min55. Annars kan användningen av olika tidpunkter leda till vilseledande resultat. Det finns också en möjlig risk för kontaminering mellan övre och nedre kammaren under bakterieexponeringen om plattorna inte hanteras med försiktighet. Alla ändringar av 12 brunnplattan vid denna punkt kan förorena mediet i den nedre kammaren.
E. coli är en välkänd, mycket vanlig orsak till bakteriell hjärnhinneinflammation. Ytterligare undersökningar bör testa olika bakterier som också är associerade med hjärnhinneinflammation, såsom Neisseria meningitidis56 eller Streptococcus pneumoniae57. Dessa verkar använda olika mekanismer för att korsa BBB och måste förstås bättre för behandling av patienter. Hos äldre patienter ökar incidensen för POD26 samt antalet inträffar. Det är känt att det finns interaktioner mellan olika sjukdomar, särskilt systemiska som diabetes. I vår modell är det möjligt att simulera dessa villkor eller behandla cellerna innan du lägger till bakterierna.
Modellen begränsas av direkt kontakt mellan THBMECs och bakterier, och ytterligare forskning är nödvändig för att undersöka potentiella kontaktmekanismer för att upptäcka de inblandade vägar och proteiner. Det är dock möjligt att ta bort skär och skörda cellerna för ytterligare analys. Teer av modellen är lägre jämfört med stamcellsmodeller38,39,40. Vi bekräftade detta med hjälp av en bakteriell koncentration som inte korsade BBB i obehandlade celler efter 6 h.
Sammanfattningsvis representerar denna metod en robust plattform för att analysera spridning av bakterier genom BBB med potential att expandera den för hög genomströmning drog screenings.

Den mänskliga BBB är en unik gräns för hjärnvävnad, separera hjärnan från blodet. Det reglerar strikt passagen av större och hydrofila molekyler, blockerar paracellulär diffusion och upprätthåller hjärnanhomeostas. Det skyddar också hjärnan från plasmafluktuationer, toxiner, mikrober och styr inflammatoriska celler som en del av immunsystemets (CNS) immunitet. Sedan upptäckten för ett sekel sedan1, många studier har genomförts för att förstå strukturen och funktionen av BBB. Den komplexa interaktioner av celler, proteiner, och signaler från hjärnan och blodet kräver ytterligare undersökning och modeller.
Den mänskliga BBB består av tre celltyper: hjärnan mikrovaskulära endotelceller (BMECs), pericyter och astrocyter2,3. BMECs skiljer sig från majoriteten av endotelcellerna i kroppen genom att de har ett stort antal snäva korsningar och vidhäftningar korsningar4,låg pinocytotisk aktivitet2,5, och en kontinuerlig källare membran6,7 för att blockera paracellulär diffusion. Små lipofila molekyler kan sprida sig och passera BBB efter deras koncentrationsgradient; större och hydrofila molekyler kommer in eller lämnar hjärnan endast genom polariserade uttryckta selektiva transportsystem8. Denna förordning resulterar i en hög transendotel elektrisk tång (TEER) på 1.500-2.000 Ω·cm2 som är omvänt korrelerade till permeabilitet9,10. Även om BMECs bygga en tät barriär, kan de reagera på lokala och perifera signaler11,12. Det finns en nära interaktion mellan BMECs och astrocyter13; astrocyt slutfötterna bygga ett lager runt kärlen och inducera bildandet av snäva korsningar13,14. De är involverade i BBB-mognad med olika faktorer, inklusive omvandling av tillväxtfaktor-β (TGF-β)15,16. Dessutom spelar pericyter en nyckelroll i regleringen av angiogenes17 och förhindra apoptos av endothelium i cellulär differentiering18 (figur 1). De är inbäddade i källaren membranet och ger strukturell stabilitet i kärlväggen19.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60692/60692fig1.jpg"> Figur 1: Den schematiska strukturen i blod - hjärnbarriären. Den unika strukturen hos den mänskliga BBB består av tre olika celltyper. Mikrokärlslumen omges av endotelceller, som är berikade i snäva korsningar, och är inte fenestrated. De är inbäddade i källaren membranet, som pericyter. Dessa celler är viktiga för kärlväggens strukturella stabilitet och spelar en roll i BBB:s utveckling bredvid astrocyterna. Deras ändfötter bygger ett nära lager runt fartyget och stöder byggandet av snäva korsningar. Alla komponenter i BBB är viktiga för fysiologisk funktionalitet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60692/60692fig1large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
Många olika patologier är relaterade till kollapsen av BBB (t.ex. septisk encefalopati). De drabbade patienterna har ökat proteinnivåerna i ryggmärgsvätskan20, och hjärnparenkymen hos drabbade gnagare visar ett ökat upptag av märkt kolloidal järnoxid och aminosyror21,22. Dessa resultat pekar mot en ökad permeabilitet av BBB som sker tillsammans med en ökad pinocytos is i BMECs21 och endotel aktivering23. En annan tillhörande patologi relaterad till en förändrad BBB är hjärnhinneinflammation, en medicinsk nödsituation och en komplex inflammation tillsammans med cerebral ödem som kan leda till neuronal cell död. Den primära ingångsplatsen för cirkulerande bakterier är tänkt att vara mikrokärlen24; BBB förhindrar dock att bakterier kommer in. BBB:s permeabbarhet är inte alltid kopplad till en ökning av experimentell hematogenous hjärnhinneinflammation25 och mekanismerna kan vara multifaktoriella. Tillfällighet av sepsis med postoperativa delirium (POD)26 och associering med preoperative infektioner27,28 indikerar behovet av en BBB modell som möjliggör direkt exponering för bakterier för att få en bättre förståelse för bakteriell patogenes.
Det finns många luckor i förståelsen och kvantifiera den mikrobiella traversal genom BBB. Därför utvecklade vi en modell som möjliggör en bekväm testning av olika faktorer och tillstånd med ett direkt samband mellan bakteriell traversal och influenser på bbbens genomsläppbarhet. Tidigare arbete fokuserade på paracellulära permeabilitet och inkluderade TEER-mätning och spårämnesflöde. Dessutom analyserades makromolekyltransport en av konjugerade molekyler eller antikroppar, där olika modeller som endast använder endotelceller eller kombinationer med astrocyter och pericyter utvecklades. På grund av svårigheten att regelbundet få mänsklig vävnad används många djurbaserade modeller. Hjärnan endotelceller av nötkreatur och svin ursprung bildar snäva monolayers med en hög TEER som bildar välformad apical-basala polaritet och är lämpade för undersökningar av små molekyler transport genom BBB. Proteinerna skiljer sig i följd från deras mänskliga homologer29,30, vilket gör undersökningen av terapeutiska antikroppar svårt. Av denna anledning kan murine eller mänskliga modeller kultur vara att föredra. Mus eller råttor som provkällor har fördelen av att erhållas från välkarakteriserade arter men ger få celler för studieändamål. Detta kan kringgås genom användning av förevigade mus hjärnan endoteliom (END) cellinjer bEND.3, bEND.5 eller cEND31,32,33.
Primära odlade celler från mänsklig vävnad är svåra att få och att hantera regelbundet. Därför är de flesta mänskliga cellulära modeller som används i forskning som undersöker den mänskliga BBB förevigade endotelcellinjer. En publicerad cellinje är mänskliga cerebrala mikrovaskulära endotelcellinjen hCMEC/D3, som är väl lämpad för studier av läkemedelsupptag och är lätt att hantera. Cellerna bygger ett monolayer och uttrycker de karakteristiska snäva kopplingsproteiner i BBB34, medan uttrycksnivån för claudin-5 rapporteras vara lägre än i intakta mikrofartyg35 och många specifika transportörer har upptäckts på avskriftsnivå36 samt i proteomiska studier34. En relativt låg TEER i intervallet 30-50 Ω·cm2 är fortfarande en utmaning37. En annan källa för hjärnan endotelceller är mänskliga pluripotenta stamceller (hPSCs)38 och mänskliga navelsträngsblod-härledda stamceller av cirkulerande endotel stamceller och hematopoietiska härstamningar39,40. Båda protokollen av differentiering resulterar i snäva cellmonolayers och kick TEER värderar (e.g., 1.450 Ω·cm2 i co-cultures)38. Dessa stamcellsmodeller kräver extrem vård för odling, men erbjuder ändå möjlighet att studera påverkan av reglerande hormoner41 eller sjukdomar med genetisk bakgrund42 på BBB utveckling.
I denna studie etablerade vi en förevigad transfected mänskliga hjärnan mikrovaskulären celllinje, THBMEC43, att efterlikna BBB och att studera bakteriell traversal. Celler är seedade på ett filter och odlas till 100% sammanflödet i denna cell kultur modell. Bakterier är inokuleras i den övre delen av cellodlingskammaren. Vi använder Escherichia coli (E. coli)i vår provstudie på grund av den höga incidensen av E. coli hjärnhinneinflammation44. Det har visat sig att den lägsta permeabiliteten hos cellmonolayer sker mellan dag 13 och dag 15 efter att45. Därför utförs behandling av THBMEC monolayer efter denna tid och bakterier inokuleras efteråt i mediet på monolayers apical yta. Efter en inkubationstid kvantifieras bakterier som kunde korsa barriären via pläteringsmedium med bakterierna på agarplattor och räknar kolonierna. Ett ökat antal kolonier korrelerar med högre bakteriell traversal genom BBB. TEER är ca 70 Ω·cm246. Det är dock inte nödvändigt att mäta Teer i den beskrivna metoden. Även om det är ett väletablerat värde för bbbens permeabilitet, verkar det inte ha någon inverkan på bakteriens genomfärd genom BBB. Obehandlade celler fungerar som en kontroll av täthet i vår modell. Det har visats i tidigare arbete att cellerna kan reagera på proinflammatoriska cytokiner och uttrycka typiska snäva korsningproteiner47. Detta möjliggör sammansatt screening och validering av en större uppsättning transportörsubstrat och receptorer.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agar - Agar</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>6494.3</td>
			<td>BioScience-Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclave</td>
			<td>Systec</td>
			<td>VX-150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacteria E.coli strain GM2163</td>
			<td>Fermentas Life Sciences, Lithuania</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photometer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>6131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cells THBMEC</td>
			<td>Group of M. F. Stins</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture flasks</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>658175</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Universal 320</td>
			<td>Hettrichlab</td>
			<td>1401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen IV</td>
			<td>SIGMA Aldrich</td>
			<td>C6745</td>
			<td>from human cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess Automated Cell Counter with cell counting chamber slides and Trypan Blue stain 0.4%</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C10311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture tubes</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>191180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cuvettes</td>
			<td>BRAND</td>
			<td>759015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Di sodium hydrogen phosphate di hydrate</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>1065800500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12</td>
			<td>GIBCO/ Thermo Sc.</td>
			<td>11330032</td>
			<td>HEPES</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tubes 15 ml</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>188271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tubes 50 ml</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>227261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>GIBCO/ Thermo Sc.</td>
			<td>10270</td>
			<td>value FBS -Brazil</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>SIGMA Aldrich</td>
			<td>F0556</td>
			<td>solution human fibroblasts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heracell 150 CO2 Incubator</td>
			<td>Heraeus</td>
			<td>50116047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator shaker I 26 New Brunswick</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>M1324-0000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inoculation loop</td>
			<td>Dr. Ilona Schubert - Laborfachhandel</td>
			<td>641000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth Base</td>
			<td>GIBCO/ Thermo Sc.</td>
			<td>12780029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>GIBCO/ Thermo Sc.</td>
			<td>25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microbial incubator B 6200</td>
			<td>Heraeus</td>
			<td>51015192</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microbiological Safety Cabinet AURA 2000 M.A.C. Class II</td>
			<td>BIOAIR</td>
			<td>12469</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope inverse</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>TELAVAL 31</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro tubes 2 ml</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>72,695,400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro tubes 1,5 ml</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>72,706,400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin / Streptomycin</td>
			<td>GIBCO/ Thermo Sc.</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Dr. Ilona Schubert - Laborfachhandel</td>
			<td>464-800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Roth</td>
			<td>HN02.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium-di-hydrogen phosphate</td>
			<td>Roth</td>
			<td>P018.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Roth</td>
			<td>9265.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThinCerts + Multiwell Plates</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>665631</td>
			<td>12 well, pore size 3.0 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin - EDTA</td>
			<td>GIBCO/ Thermo Sc.</td>
			<td>15400054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuumpump Laboport</td>
			<td>KNF</td>
			<td>N 86 KT.18</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analyzing the permeability of the blood-brain barrier by microbial traversal through microvascular endothelial cells

Den mänskliga blod - hjärnbarriären (BBB) kännetecknas av en mycket låg permeabilitet för biomolekyler för att skydda och reglera hjärnans metabolism. BBB bildas huvudsakligen av endotelceller inbäddade i kollagen IV och fibronectin-rika källarmembran. Flera patologier beror på dysfunktion av BBB följt av mikrobiell traversal, orsakar sjukdomar som hjärnhinneinflammation. För att testa effekten av flera parametrar, inklusive olika läkemedel och bedövningsmedel, på permeabilitet en BBB vi etablerade en ny mänskliga cell kultur modell härma BBB med mänskliga hjärnan mikrovaskulära endotelceller. Endotelcellerna odlas på kollagen IV och fibronectin-belagda filterenheter tills sammanflödet och kan sedan behandlas med olika föreningar av intresse. För att visa en mikrobiell traversal, den övre kammaren med den apical ytan av endotelcellerna inokuleras med bakterier. Efter en inkubationstid pläteras prover av den nedre kammaren på agarplattor och de erhållna kolonierna räknas, varigenom antalet kolonier korrelerar med BBB:s genomsläpplighet. Endogena cellulära faktorer kan analyseras i denna experimentella uppsättning för att belysa grundläggande cellulära mekanismer i endotelceller som bidrar till BBB. Dessutom gör denna plattform det möjligt att utföra en skärm för föreningar som kan påverka permeabiliteten hos endotelcellerna. Slutligen, bakteriell traversal kan studeras och kopplas till olika patologier, såsom hjärnhinneinflammation. Det kan vara möjligt att utöka modellen och analysera vägarna hos bakterierna genom BBB. I den här artikeln tillhandahåller vi ett detaljerat protokoll över den beskrivna metoden för att undersöka BBB:s genomsläpplighet.

Efter protokollet var cellerna seedade, och BBB-modellen byggdes. Dag 14 efter sådd behandlades cellerna med glyoxal som en reaktiv aldehyd. Syftet med experimentet var att undersöka sambandet mellan ålder och diabetes i POD27 och den höga förekomsten av hjärnhinneinflammation hos äldre patienter48. De ökade nivåerna av avancerade slutprodukter för glycation(AGEs) i både ålder och diabetes49 kräver ytterligare undersökning av effekten av glyktion i patogenesen vid mikrobiell genomkorsande genom BBB. Glycation är en icke-enzymatisk reaktion av fria aminogrupper i proteiner med kolylgrupper för att minska kolhydrater eller andra kolylföreningar. Glukos är känd som givare av kolylgrupper; Det finns dock mer reaktiva kända. Efter att ha byggt en instabil Schiff bas, de ordna till mer stabila och reaktiva dicarbonyl föreningar som glyoxal. De slutliga produkterna kan orsaka tvärband mellan proteiner50. De kan skada cellulära strukturer och ändra cellulär funktion genom interaktion med receptorn för AGEs (RAGE)51.
Cellerna behandlades med en 0,05 och 0,15 mM glyoxal (GO) lösning för 1 h, och obehandlade celler fungerade som en kontroll. Glycation upptäcktes via immunblotting och detektion med anti-AGE antikropp(figur 3). De erhållna bakteriekolonierna räknades och representerades som det absoluta antalet kolonier (figur 4A)eller det relativa antalet kolonier normaliserade till kontrollen(figur 4B). Mediet tas från brunnar med obehandlade celler bildade mycket få kolonier. Detta resultat visade att de obehandlade cellerna kunde bygga en barriär och kunde fungera som en kontroll. Prover som behandlats med glyoxal visade ett ökat antal kolonier, vilket ledde till slutsatsen att det finns en effekt av glyoxal på THBMECs och cellulär barriärdensitet, eftersom antalet kolonier visade en betydande skillnad mellan obehandlade och behandlade celler. Den ökade bakteriepassagen av barriären efter behandlingen med glyoxal kan förklara varför diabetes är korrelerad till sjukdomar med en BBB-nedbrytning.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60692/60692fig3a.jpg"> Figur 3: Detektion av proteinglycation via immunblotting. THBMECs behandlades med GO vid olika koncentrationer för 1 h. Totalt protein isolerades och separerades med SDS-PAGE. Glycation av proteinerna upptäcktes via immunblotting med anti-AGE-antikroppar (KML-26). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60692/60692fig3alarge.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
I en annan miljö, protein glycation av THBMECs induceras av glukos. Steriliserad glukos lades till DMEM/F-12 medium för att öka glukoskoncentrationen från normalt glukosmedium (NG) med 17,5 mM till högglukosmedium (HG) med 42,5 mM. THBMECs odlades i två olika cellodlingsflaskor: ett i det normala glukosmediet (NG) och det andra i högglukosmedium (HG). Dessa två olika medier användes också för tillväxten av BBB på filter i 12 brunnsplattor. Celler som odlas i NG medium fungerade som en kontroll. De erhållna kolonierna representeras som det absoluta antalet kolonier(figur 4C)eller det relativa antalet kolonier normaliserade till kontrollen(figur 4D). Resultaten tyder inte på någon signifikant effekt på bakteriens genomfärd genom den mänskliga BBB, vilket leder till slutsatsen att effekten av NG vs HG inte var tillräckligt allvarlig för att påverka BBB:s integritet. De olika scenarierna utformades för att bevisa modellen och integriteten hos cellerna som härmar BBB.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60692/60692fig4d.jpg"> Figur 4: Absolut och relativt antal räknade bakteriekolonier i BBB-modellen med THBMECs. THBMECs behandlades med 0,15 mM GO för 1 h, obehandlade celler fungerade som en kontroll. Totalt lades 450 μl E. coli suspension (OD600 = 0,5) till varje övre kammare. Medium från de nedre kamrarna var pläterade på agarplattor efter 6 h. (A) Diagrammet visar det genomsnittliga medelvärdet +/- SEM av räknade kolonier. (B)Diagrammet visar de räknade kolonierna normaliserade till de obehandlade cellerna som kontroll +/- SEM (n = 4). IcochDodlades THBMECs i NG- och hgmedium. Totalt lades 450 μl E. coli suspension (OD600 = 0,5) till varje övre kammare. Medium från den nedre kammaren var pläterad på agarplattor efter 6 h. (C) Diagrammet visar det genomsnittliga medelvärdet +/- SEM av räknade kolonier. (D)Diagrammet visar de räknade kolonierna normaliserade till de obehandlade cellerna som kontroll +/- SEM (n = 3). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60692/60692fig4large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Analyzing the Permeability of the Blood-Brain Barrier by Microbial Traversal through Microvascular Endothelial Cells at JoVE.com

Analyzing the Permeability of the Blood-Brain Barrier by Microbial Traversal through Microvascular Endothelial Cells

Den mänskliga blod - hjärnbarriären förhindrar selektivt penetration av hydrofila molekyler och patogener i hjärnan. Flera patologier, inklusive hjärnhinneinflammation och postoperativa delirium, är associerade med en ökad permeabilitet av blod - hjärnbarriären. Här beskriver vi en endotelcellkulturmodell för att testa barriärpermeabiliteten genom mikrobiell traversal.

Analysera permeabiliteten hos blod - hjärnbarriären genom mikrobiell traversal genom mikrovaskulära endotelceller

The human blood-brain barrier (BBB) is characterized by a very low permeability for biomolecules in order to protect and regulate the metabolism of the ...

Denna metod gör det möjligt att analysera den mänskliga blod - hjärnbarriären genom att mäta bakteriell traversal på olika behandlingar. det kan hjälpa att upptäcka patogenesen vid bakteriell hjärnhinneinflammation och postoperativa delirium. Det är en okomplicerad metod och effekterna av behandlingen representeras direkt av antalet bakterier.Den kan modifieras för att möjliggöra hög genomströmningsanalys av föreningar på endotelcellerna. Börja med att montera 12-brunnsplattan i ett biologiskt säkerhetsskåp. Packa upp plattan och varje insats, sedan använda steriliserade trikåer för att ta tag i skären vid sin bas och lägg dem i brunnarna.Coat det porösa membranet i varje skär med 90 mikroliter av 10 mikrogram per mikroliter kollagen IV och fibronectin blandning och inkubera plattan i en cellkultur inkubator på 37 grader Celsius i 24 timmar. Efter inkubationen tvättar du inläggen två gånger genom att pipettera en milliliter PBS i varje insats och aspirera den med en vakuumpump. Sedan jämvikt membranen genom pipettering förvärmda DMEM F12 medium i övre och nedre kamrarna och inkubera plattan på 37 grader Celsius och 5%koldioxid.För att så de mänskliga mikrovaskulära endotelcellerna aspirera du mediet från cellodlingskolven och tvätta cellerna med 10 milliliter PBS. Täck cellerna helt med fem milliliter trypsin EDTA och inkubera kolven i tre till fem minuter vid 37 grader Celsius. Överför fem milliliter av cellerna i ett 15 milliliter rör och tillsätt fem milliliter FCS som innehåller medium för att stoppa den enzymatiska reaktionen.Centrifugera suspensionen i tre minuter vid 210 gånger g, ta bort supernatanten och återanvänd cellpelleten i fem milliliter medium. Tillsätt 10 mikroliter av cellen suspensionen till 10 mikroliter av 0,4%trypan blå fläck, tillsätt sedan 10 mikroliter av blandningen till en räkna kammare. Sätt räknarkammaren i cellräknaren och starta lämpligt program se till att räknaren är fokuserad.Efter räkning, utsäde 200, 000 celler i varje övre kammare på 12-brunnsplattan och inkubera plattan vid 37 grader Celsius i 14 dagar ändra media i övre och nedre kammaren varannan till tre dagar. Efter 14 dagar, se till att cellkonfluensen är 100%genom att avbilda dem med mikroskop. En dag före permeabilitet mätning, sätta en koloni av E.coli stam GM2163 i tre milliliter lb medium.Odla cellerna i 37 grader Celsius i 24 timmar i en inkubationsshaker. För att behandla celler med en förening av intresse, späd den till sin slutliga koncentration i DMEM F12 medium och tillsätt denna blandning i de övre och nedre kamrarna i 12-brunnsplattan, sedan inkubera plattan i en cellkultur inkubator. Efter inkubationen, byt det kompletta mediet med antibiotikafritt medium.Bestäm koncentrationen av natten bakteriekulturen genom att mäta dess optiska densitet vid 600 nanometer, späd sedan ut den till en OD600 av 0,5 i en 50 milliliter Falcon röret. I ett biologiskt säkerhetsskåp, tillsätt 450 mikroliter av bakterielösningen i varje övre kammare i 12-brunnsplattan, sedan inkubera plattan i sex timmar vid 37 grader Celsius. Efter inkubationen, avlägsna insatsen med täntappar och provet 50 mikroliter av mediet från varje nedre kammare var noga med att inte spilla mediet från de övre kamrarna i de nedre.Det är viktigt att strikt separera media i övre och nedre kammaren som en spillover från bakterier i den övre kammaren skulle leda till falska positiva resultat. Släpp varje prov på en separat agarplatta och strimma lösningen med en cellspridare. Inkubera plattorna vid 37 grader Celsius i 24 timmar, räkna sedan kolonierna.För att undersöka effekten av glycation på mikrobiell traversal genom blod - hjärnbarriären, celler behandlades med en 0,5 och en 0,15 millimolar glyoxal lösning för en timme med obehandlade celler som fungerar som en kontroll. Glycation upptäcktes sedan via immunoblotting med anti-AGE antikroppar. De erhållna bakteriekolonierna räknades och representerades som absolutantalet kolonier eller det relativa antalet kolonier som normaliserades till kontrollen.Prover som behandlades med glyoxal visade ett ökat antal kolonier som indikerar att behandlingen har en effekt på cellulär barriärtäthet. För att undersöka glukos-inducerad protein glycation, THBMECs odlades i normala glukos och höga glukos medium. Det absoluta antalet kolonier och det relativa antalet kolonier normaliserade till kontrollen indikerade att glukos inte hade någon signifikant effekt på blod- hjärnbarriärens integritet.Behandlade endotelceller kan analyseras ytterligare genom proteomikansatser, till exempel masspektrometri, för att analysera förändringar i proteomet. Denna teknik hjälper till att förstå den mänskliga blod - hjärnbarriären och bakteriell traversal. Det kan användas för att upptäcka aspekter av åldrande och neurodegenerativa sjukdomar såsom Alzheimers sjukdom.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Separation of Single-stranded DNA, Double-stranded DNA and RNA from an Environmental Viral Community Using Hydroxyapatite Chromatography

Separation av enda DNA, dubbel-strängat DNA och RNA ur miljösynpunkt Viral gemenskapen med hjälp av hydroxyapatit Kromatografi

Viruses, particularly bacteriophages (phages), are the most numerous biological entities on Earth1,2.  Viruses modulate host cell abundance and diversity, ...

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

Efter Cell-öde i<em&gt; E. E. coli</em&gt; Efter infektion av fag lambda

The system comprising bacteriophage (phage) lambda and the bacterium E. coli has long served as a paradigm for cell-fate determination1,2. Following the ...

Generation of Recombinant Arenavirus for Vaccine Development in FDA-Approved Vero Cells

Generering av Rekombinant arenavirus för Vaccine utveckling i FDA-godkända Vero celler

The development and implementation of arenavirus reverse genetics represents a significant breakthrough in the arenavirus field  4. The use of cell-based ...

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Kvantitativ<em&gt; In vitro</em&gt; Analys för att mäta neutrofilvidhäftning till Aktiverade primära humana mikrovaskulära endotelceller under statiska förhållanden

The vascular  endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the  acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are ...

Analyzing the Effects of Stromal Cells on the Recruitment of Leukocytes from Flow

Analysera effekterna av stromaceller celler på rekrytering av leukocyter från Flow

Stromal cells regulate the recruitment of circulating leukocytes during inflammation through cross-talk with neighboring endothelial cells. Here we ...

An In Vitro Model of the Blood-brain Barrier Using Impedance Spectroscopy: A Focus on T Cell-endothelial Cell Interaction

An In Vitro Model of the Blood-brain Barrier Using Impedance Spectroscopy: A Focus on T Cell-endothelial Cell Interaction

En<em&gt; In Vitro</em&gt; Modell av blod-hjärnbarriären Använda impedans spektroskopi: Fokus på T-cell-endotelceller interaktion

Breakdown of the blood-brain barrier (BBB) is a critical step in the development of autoimmune diseases such as multiple sclerosis (MS) and its animal ...

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Analys av Lymphocyte Extravasation Med användning av ett<em&gt; In Vitro</em&gt; Modell av det mänskliga blod-hjärnbarriären

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte ...

High-throughput Measurement of Plasma Membrane Resealing Efficiency in Mammalian Cells

Hög genomströmning mätning av plasmamembranet återförslutning effektivitet i däggdjursceller

In their physiological environment, mammalian cells are often subjected to mechanical and biochemical stresses that result in plasma membrane damage. In ...

Digestion of the Murine Liver for a Flow Cytometric Analysis of Lymphatic Endothelial Cells

Rötning av murina levern för ett flöde flödescytometrisk analys av lymfatiska endotelceller

Within the liver, lymphatic vessels are found within the portal triad, and their described function is to remove interstitial fluid from the liver to the ...