Name: analyzing the permeability of the blood-brain barrier by microbial traversal through microvascular endothelial cells
Uploaded: 2020-02-14T12:30:00
Duration: 6 min 26 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analyzing the Permeability of the Blood-Brain Barrier by Microbial Traversal through Microvascular Endothelial Cells at JoVE.com

Yazarlar bu yöntem üzerinde önceki çalışmaları için Dr Maryam Hussain kabul, PD Dr Kerstin Danker grubu (Charité-Universitätsmedizin, Berlin) kritik el yazması okumak için THBMECs ve Juliane Weber sağlamak için. Bu çalışma RTK 2155 (ProMoAge) tarafından desteklenmiştir.

1. Tampon ve Reaktiflerin Hazırlanması
<ol><li>80 g sodyum klorür (NaCl), 2 g potasyum klorür (KCl), 14,4 g disodyum-hidrojen-fosfat dihidrat (Na2HPO4 · 2H2O) ve 2 ekleyerek 10x fosfat tampon salin (10x PBS) hazırlayın potasyum-dihidrojen fosfat g (KH2PO4) 1 L cam şişe 1 L çift distile H2O. Autoclave 10x PBS çözeltisi ve seyreltmek 100 mL bu çözeltinin 900 mL çift distile su 1x PBS almak için.<ol>
<li>Çözümleri sterilize etmek için otoklav kullanın. Cam şişeyi sepete koyun, kapağıkapatın ve 121 °C ve 98,9 kPa'da 15 dakika sterilize edin. NOT: Bu protokol her zaman sonraki adımlarda çözümleri otoklavlama için kullanılır.</li>
	</ol>
</li>
	<li>0.5 mg/mL fibronektin çözeltisi ve 0.3 mg/mL kollajen IV çözeltisi 1.5 mL mikro tüplerde 100 mg/μL aliquots ile 10 g/mL fibronektin çözeltisi 10 g/mL kollajen IV ve 10 μg/mL fibronektin çözeltisi hazırlayın. Daha sonra, her iki aliquot'un 100 μL'sini 2 mL mikro tüpte 1.800 μL 1x PBS ile karıştırın ve -20 °C'de saklayın.</li>
	<li>DMEM/F-12 ortamını %4 fetal büyükbaş ve 2 mM L-glutamin ve 100 mg/L penisilin/streptomisin ekleyerek hazırlayın ve 4 °C'de saklayın.</li>
	<li>10x konsantre trypsin-EDTA çözeltisinin 5 mL'ini 50 mL'lik bir tüpte 45 mL 1x PBS ile seyrelterek 1x tripsin-EDTA çözeltisini hazırlayın ve 4 °C'de saklayın.</li>
	<li>500 mL cam şişede 10 g LB suyu tabanı tartarak 500 mL LB orta hazırlayın. Sterilize su 500 mL ekleyin ve otoklav.</li>
	<li>LB agar'ı 10 g LB suyu tabanı ve 500 mL cam şişede 7,5 g agar-agar ağırlığında hazırlayın. Otoklavlamadan önce 500 mL steril ize edilmiş su ekleyin ve şişenin kapağını kapatmayın. Otoklav ve dokunmak için sıcak olana kadar soğumaya sol.</li>
	<li>%4 fetal sığır serumu ve 2 mM L-glutamin ekleyerek antibiyotiksiz ortam hazırlayın, ancak DMEM/F-12 ortamına penisilin/streptomisin eklemeyin ve adım 1.3'te olduğu gibi 4 °C'de saklayın.</li>
</ol>2. Kan-beyin bariyerinin büyüme Hücreleri Taklit
<ol><li>12 kuyu plakasını monte etmek için hücre kültürünü kuyulara yerleştirin (Şekil 2A).<ol>
<li>Plakayı boşaltın ve her bir sinibiyolojik güvenlik kabinine yerleştirin ve orada daha fazla adım atın. Taşımak için geniş tabanında eklemek kapmak için sterilize forceps kullanın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Her kesici nilanın gözenekli membranını 90 μL 10 g/mL kollajen IV ve 10 μg/mL fibronectin karışımı ile kaplayın. Hücre kültürü kuluçka makinesinde 37 °C'de 24 saat boyunca 12 kuyu plakasını kuluçkaya yatırın (Şekil 2B).</li>
	<li>Kesici uçları her kesici uça 1 mL 1x PBS boru tutarak iki kez yıkayın ve çözeltiyi hücre kültürleri için bir vakum pompası ile aspire edin.</li>
	<li>Üst haznede önceden ısıtılmış DMEM/F-12 ortamının 0,5 mL'sini, alt haznesinde 1,5 mL pipetleme yaparak membranları dengeleyin. Plakayı 30 dakika 37 °C'de hücre kültürü kuvözlerinde %5 CO2 atmosfere sahip bir kuluçka makinesinde kuluçkaya yatırın(Şekil 2C).</li>
	<li>Tohum 2 x 105 insan mikrovasküler endotel hücreleri her üst odaya ve bir hücre kültürü kuluçka 37 °C'de 12 kuyu plaka kuluçka (Şekil 2D).<ol>
<li>Hücre kültürleri için bir vakum pompası kullanarak hücre kültürü şişesinden orta aspire ve 1x PBS 10 mL pipetleme ve daha sonra bir vakum pompası ile çözelti aspire ederek monolayer yıkayın.</li>
		<li>Çözeltinin 5 mL'ini hücre kültürü şişesine borulandırarak 1x konsantre trypsin-EDTA ile hücreleri tamamen kapatın. Şişeyi 37 °C'de 3-5 dakika boyunca hücre kültürü kuluçka makinesinde kuluçkaya yatırın. NOT: Hücreler ayrıştırılmazsa, hücreleri yerinden çıkarmak için şişeyi avuç içine sıkıca dokunun.</li>
		<li>15 mL'lik bir tüpteki hücre süspansiyonundan aliquot olarak pipetle 5 mL alın ve enzimatik reaksiyonu durdurmak için FCS içeren ortamın 5 mL'sini ekleyin.</li>
		<li>Santrifüj süspansiyon için 3 dk 210 x g, bir vakum pompası ile supernatant kaldırmak ve bir pipet ile orta 5 mL pelet resuspend.</li>
		<li>Hücre süspansiyonunun 10 μL'sini 1,5 mL mikro tüpte %0,4 trypan mavi samanı ile karıştırarak hücre sayacını kullanın. Karışımın 10 μL'sini sayma odası slaytına ekleyin, hücre sayacına koyun ve saymaya başlayın.<ol>
<li>Tezgahı hücrelere odaklar, böylece kenarları koyu mavi ve orta beyaz dır. Bundan sonra, hücre sayma için uygun programı başlatın.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Her kesici uç için hacmi hesaplamak için, elde edilen 2 x 105 hücreyi uç başına hücre süspansiyonunun hesaplanan konsantrasyonuyla bölün.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Kan-beyin Bariyer Modeli Nin Yetiştirilmesi
<ol><li>12 kuyu plakasını 37 °C'de 14 gün kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>Üst oda için 0,5 mL, alt oda için 1,5 mL orta 2-3 günde bir değiştirin. Hücre şişesine koymadan önce ortayı ısıtın. Vakum pompası ile aspire (Şekil 2E). NOT: Membrana dokunmamak için dikkatli çalışın.</li>
	<li>Bir mikroskop ile görüntüleme ve birleşimini belirleyerek hücrelerin durumunu kontrol edin. 14 gün sonra birleşimin %100 olduğundan emin olun.</li>
</ol>4. Bakterilerin Hazırlanması
<ol><li>Ölçümden bir gün önce, E. coli suşu GM2163'ün kolonine LB ortamına yerleştirin. Kültür tüpünü 37 °C'de 24 saat, kuluçka çalkalayıcıda 180 rpm ile kuluçkaya yatırın (Şekil 2F).<ol>
<li>4 °C'de LB agar plakaüzerinde E. coli türünü yetiştirin. Sterilize edilmiş bir kazma ile bir koloni alın ve 3 mL LB orta ile hazırlanan kültür tüpünde pick koyun.</li>
		<li>Sıcak LB agar çözeltisi ile her kesici uç için bir LB agar plakası hazırlayın ve Petri kaplarını toplam hacminin yarısına kadar doldurun. Katı hale gelsinler ve 4 °C'de saklayın.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Hücrelerin Tedavisi
<ol><li>Tohumlamadan sonra 14. NOT: Her zaman bir kontrol olarak bazı işlenmemiş hücreler var.<ol>
<li>Hücreleri faiz bileşiğiile tedavi etmek için, dmem/F-12 ortamındaki son konsantrasyona kadar bileşiği seyreltin. Bu karışımın 0,5 mL'sini üst hazneye, 1,5 mL'sini alt hazneye ekleyin. İstediğiniz zaman için bir hücre kültürü kuluçka plaka kuluçka.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Daha sonra, vakum pompası ve pipetleme(Şekil 2H)ile azarlayarak antibiyotiksiz orta ile tam orta değişimi.</li>
</ol>6. Geçirgenliğin Ölçülmesi
<ol><li>Sürekli bakteri konsantrasyonları elde etmek için optik yoğunluğu 600 nm dalga boyunda bir fotometre ile ölçün. 50 mL'lik bir şahin tüpündeki LB ortamı ile bakterilerin bir gecede çözeltisini 0,5 ± 0,05'lik bir OD600'e seyreltin. Buz üzerinde çalış.<ol>
<li>Bir cuvette içine LB orta 1 mL doldurun. Fotometreyi başlatın ve cuvette'yi öne doğru işaretli olarak koyun. Daha sonra boş değeri ölçmek için alt "Boş" tuşuna basın.</li>
		<li>Bir cuvette içine doldurarak, koyarak ve alt örnek basarak bakteriyel çözeltinin yoğunluğunu ölçün. Son konsantrasyonelde edene kadar seyreltme sırasında ölçümü tekrarlayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>OD600 = 0.5'te hazırlanan 12 kuyu plakası ve bakteriyel çözelti ile bakterilerin işlenebileceği biyolojik güvenlik kabininde çalışın. Sadece 0,5 mL orta içeren her üst hazneye 450 μL bakteriyel çözelti ekleyin(Şekil 2I).</li>
	<li>12 kuyu plakasını 37 °C'de 6 saat boyunca bir kuluçka makinesinde kuluçkaya yatırın. NOT: Protokol burada duraklatma yı emreder.</li>
	<li>Kesici uçları forceps ile çıkararak her alt hazneden bir pipet ile ortanın 50 μL'sini örnekle(Şekil 2J). Orta yı üst odalardan alt odalara dökülmemeye dikkat edin.</li>
	<li>Her numuneyi ayrı bir agar plakası üzerine levhalayın (Şekil 2K). Plaka üzerinde örnek bırakın ve bir hücre dağıtıcı ile çözelti dışarı çizgi.</li>
	<li>Bir kuluçka makinesinde 37 °C'de 24 saat boyunca agar plakalarını kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>Her plakadaki kolonileri sayın (Şekil 2L).</li>
</ol>7. Verilerin Analizi
<ol><li>Verileri bir tabloya yazın ve tedavi edilen ve işlenmemiş hücrelerin gözlenen kolonilerinin ortalama ve standart sapmasını hesaplayın.</li>
	<li>Ortalamayı mutlak koloni sayısı olarak görüntüleyin.<ol>
<li>Sonuçları normalleştirmek için, tüm sonuçları denetim değeriyle bölerek göreli koloni sayısını hesaplayın.</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60692/60692fig2a.jpg"> Şekil 2: Protokoldeki tek tek adımların ayrıntılı sunumu. (A) 12 kuyu plakaiçine steril leştirilmiş forceps ile ekler koyun. (B) Kat her eklemek 90 μL fibronektin ve kollajen IV karışımı ve inkübat için 24 saat. (C) 30 dk. (D) Tohum 2 x 105 insan beyni mikrovasküler endotel hücreleri eklemek başına önceden ısıtılmış orta ile membranlar dengeleyin. (E) Plakayı uygun süre için yetiştirin. (F) Ölçümden bir gün önce, bir LB orta kültür tüpüne Bir E. coli kolonisi yerleştirin ve 24 saat boyunca kuluçkaya yatırın. (H) Antibiyotiksiz ortam ile tam orta değişimi. (I) Her üst hazneye 450 μL bakteriyel solüsyon (OD600 = 0,5) ekleyin ve 6 saat boyunca kuluçkaya yatırın. (J) Numune 50 μL orta her alt odadan forseps ile kesici uç ları çıkararak. (K) Örneği agar plakaları üzerine plakalayın ve 24 saatboyuncakuluçkaya yatırın. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60692/60692fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Mikrobiyal traversel sınırların patogenezine sınırlı bakış pod veya menenjit için tedavilerin daha da geliştirilmesi. Bu hastalıkların mortalitesi ve morbiditesi daha iyi hasta tedavisi gerektirir, altta yatan mekanizmaların araştırılmasını gerektirir ve bileşik tarama için sağlam bir platforma ihtiyaç duyar. Çok faktörlü olaylar insan BMEC'leri ile incelenebilir. Çeşitli türlerden BMECs birkaç başarılı bildirilen izolasyon prosedürleri hücrelerin özellikleri moleküler imza52,53kaybı göstermiştir. Bu prosedürde tanımlanan THBMECs çok erken pasajlarda transfected edildi, onlar belirli beyin endotel hücre özellikleri sergiledi ve onları korudu43. Bu önemlidir, çünkü etkilenen yollardaki tüm adımlar şimdiye kadar keşfedilmemiştir ve bu model konvansiyonel BMEC'leri taklit ediyor gibi görüner. Sunduğumuz model, BMEC'ler ve BBB'deki mikrobiyal geçiş üzerindeki doğrudan etkileri göstermektedir.
THBMEC hücrelerinin kullanımı basittir ve gerekli teknik ekipmanlar çoğu yaşam bilimi laboratuvarında bulunmaktadır. Modelimiz THBMECs sıkı bir monolayer inşa ettikten sonra soruşturma prosedürleri hemen başlamasını sağlar. Yeni testler ve TEER ölçümü veya54izleyicisi ile etiketleme gibi geleneksel denemeler arasındaki olası kombinasyonlar nedeniyle uygulama alanı geniş olabilir. Ortak veya üçlü kültür modeli yapmak için astrosit veya perisit eklemek de mümkündür. Mikroplar la kapital üzerinde ilaçların etkisi de bakteriler ile üst oda aşılama dan önce bileşikler ile THBMECs tedavi ederek modelimizde test edilebilir. Aslında, 96 kuyu plakası için filtreli kesici uçlar satın almak mümkündür ve bu uçlar prosedürün otomasyonuna olanak sağlar. Bu, söz konusu hastalıklara karşı ilaçların keşfini hızlandırmak ve ilaç geliştirme sırasında BBB üzerindeki yan etkileri azaltmak için yüksek iş itimatlı ilaç tarama sistemlerinin uygulanmasını kolaylaştırabilir.
Sunulan yöntemde kritik bir adım üst hazneye bakteri ekledikten sonra kuluçka süresidir. E. coli'nin üretim süresi sadece 20 dk55olduğundan, protokolde saatleri zaman çizelgesi olarak kullanmak önemlidir. Aksi takdirde, farklı zaman noktalarının kullanımı yanıltıcı sonuçlara yol açabilir. Plakalar özenle ele alınmadığı takdirde bakteriyel maruziyet sırasında üst ve alt oda arasında kontaminasyon riski de vardır. Bu noktada 12 kuyu plakasında herhangi bir değişiklik alt haznedeki ortamı kirletebilir.
E. coli bakteriyel menenjit iyi bilinen, çok yaygın bir nedenidir. Daha fazla araştırma da menenjit ile ilişkili farklı bakterileri test etmelidir, Neisseria menenjitidisgibi56 veya Streptococcus pneumoniae57. Bu BBB çapraz farklı mekanizmalar kullanmak gibi görünüyor ve hastaların tedavisi için daha iyi anlaşılması gerekir. Yaşlı hastalarda POD görülme sıklığı26'ya ve ortaya çıkan komorbidite lerin sayısını arttırmaktadır. Farklı hastalıklar, özellikle diyabet gibi sistemik hastalıklar arasında etkileşimler olduğu bilinmektedir. Bizim modelinde, bu koşulları simüle etmek veya bakteri eklemeden önce hücreleri tedavi etmek mümkündür.
Model THBMECs ve bakterilerin doğrudan temas ile sınırlıdır, ve daha fazla araştırma ilgili yollar ve proteinlertespit etmek için temas potansiyel mekanizmaları araştırmak için gereklidir. Ancak, ekler kaldırmak ve daha fazla analiz için hücreleri hasat mümkündür. Modelin TEER kök hücre modelleri38,39,40göre daha düşüktür. Bunu, 6 saat sonra tedavi edilmeyen hücrelerde BBB'yi geçmeyen bir bakteri konsantrasyonu kullanarak doğruladık.
Özetle, bu yöntem yüksek işlemli ilaç taramaları için genişletmek için potansiyel ile BBB ile bakterilerin geçiş analiz etmek için sağlam bir platform temsil eder.

İnsan BBB beyin dokusunun benzersiz bir sınır, kan dan beyin ayıran. Kesinlikle büyük ve hidrofilik moleküllerin geçişini düzenler, bloklar parasellüler difüzyon, ve beyin homeostaz korur. Aynı zamanda plazma dalgalanmaları, toksinler, mikroplar, ve merkezi sinir sistemi (CNS) bağışıklık bir parçası olarak inflamatuar hücrelere rehberlik beyni korur. Bir yüzyıl önce keşfinden bu yana1,BBB'nin yapısını ve işlevini anlamak için birçok çalışma yapılmıştır. Hücrelerin karmaşık etkileşimleri, proteinler, ve beyin ve kan dan sinyalleri hala daha fazla araştırma ve modelleri talep.
İnsan BBB üç hücre tipioluşur: beyin mikrovasküler endotel hücreleri (BMECs), perisitler, ve astrositler2,3. BMECs onlar sıkı kavşaklar ve yapışık kavşaklar4,düşük pinositotik aktivite2,5,ve sürekli bir bazal membran6,7 parasellüler difüzyon engellemek için yüksek sayıda sahip olduğu vücuttaki endotel hücrelerinin çoğunluğu farklıdır. Küçük lipophilic molekülleri diffüz ve konsantrasyon gradyanı aşağıdaki BBB geçebilir; daha büyük ve hidrofilik moleküller girin veya sadece polarize ifade seçici taşıma sistemleri ile beyin bırakın8. Bu düzenleme, geçirgenlik9,10ile ters orantılı olan 1.500-2.000 Ω·cm2 transentelyal elektrik direnci (TEER) ile sonuçlanır. BMECs sıkı bir bariyer inşa rağmen, onlar yerel ve çevresel sinyalleri tepki verebilir11,12. BMEC'ler ve astrositler arasında yakın bir etkileşim vardır13; astrosit end-feet damarların etrafında bir tabaka oluşturmak ve sıkı kavşakoluşumunu neden13,14. BBB olgunlaşmasında büyüme faktörü-β (TGF-β)15,16gibi farklı faktörlerle katılırlar. Buna ek olarak, perisitler anjiyogenez17 düzenlenmesinde ve hücresel farklılaşma da endotel apoptozunun önlenmesinde önemli bir rol oynamaktadır18 (Şekil 1). Onlar bodrum membran gömülü ve damar duvarının yapısal istikrar sağlamak19.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60692/60692fig1.jpg"> Şekil 1: Kan-beyin bariyerinin şematik yapısı. İnsan BBB'nin eşsiz yapısı üç farklı hücre tipinden oluşur. Mikro damar lümeni, sıkı kavşaklarda zenginleştirilmiş endotel hücreleri ile çevrilidir ve fenestrated değildir. Perisitler gibi bodrum zarına gömülüler. Bu hücreler damar duvarının yapısal stabilitesi için önemlidir ve astrositlerin yanında BBB'nin gelişiminde rol oynarlar. Onların end-feet geminin etrafında yakın bir tabaka inşa ve sıkı kavşaklar bina destek. BBB'nin tüm bileşenleri fizyolojik işlevsellik açısından önemlidir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60692/60692fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Birçok farklı patoloji BBB'nin çöküşüile ilişkilidir (örn. septik ensefalopati). Etkilenen hastalar beyin omurilik sıvısı protein düzeyleri artmıştır20, ve etkilenen kemirgenlerde beyin parankim işaretli kolloidal demir oksit ve aminoasitlerinartan bir alımı gösterir 21,22. Bu sonuçlar BBB'ninBMEC21'de artmış pinositoz ve endotel aktivasyonu23ile birlikte oluşan geçirgenliğinin arttığına işaret eder. Bir başka ilişkili patoloji değişmiş BBB ile ilgili menenjit, tıbbi bir acil durum ve nöronal hücre ölümüne yol açabilir serebral ödem ile birlikte karmaşık bir inflamasyon. Dolaşan bakterilerin birincil giriş sitesi mikrogemiler olması gerekiyordu24; ancak, BBB bakteri girişini engeller. BBB geçirgenliği her zaman deneysel hematojen menenjit25 artış ile bağlantılı değildir ve mekanizmalar multifaktöriyel olabilir. Postoperatif deliryum (POD)26 ile sepsis inklüsi ve ameliyat öncesi enfeksiyonlarla ilişki27,28 bakteri patogenezi içine daha iyi bir anlayış elde etmek için bakterilere doğrudan maruz kalma sağlayan bir BBB modeli ihtiyacını gösterir.
BBB'de mikrobiyal geçişi anlama ve ölçmede birçok boşluk vardır. Bu nedenle, bakteriyel traversal ve BBB geçirgenliği üzerindeki etkileri arasında doğrudan bir korelasyon ile farklı faktörler ve koşulların uygun bir test sağlayan bir model geliştirdik. Daha önceki çalışmalarda parasellüler geçirgenlik üzerinde duruldu ve TEER ölçümü ve tracer fluc dahil. Buna ek olarak, makromolekül taşıma konjuge moleküller veya antikorlar tarafından analiz edildi, bu şekilde sadece endotel hücreleri veya astrosit ve perisitler ile kombinasyonları kullanılarak farklı modeller geliştirilmiştir. Düzenli olarak insan dokusu elde etmede güçlük nedeniyle birçok hayvan bazlı model kullanılmaktadır. Sığır ve domuz kökenli beyin endotel hücreleri iyi şekilli apikal-bazal polarite oluşturan ve BBB ile küçük molekül taşıma araştırmalar için uygundur yüksek TEER ile sıkı monolayers oluştururlar. Proteinler insan homologlarından sırayla farklılıkgösterir29,30, terapötik antikorların araştırılmasını zorlaştırır. Bu nedenle, murine veya insan kültürü modelleri tercih edilebilir. Örnek kaynaklar olarak fare veya sıçanlar iyi karakterize edilen türlerden elde edilme avantajına sahiptirler ancak çalışma amacıyla az sayıda hücre verim ilerlerler. Bu ölümsüzleştirilmiş fare beyin endotelyoma (END) hücre hatları bEND.3, bEND.5 veya cEND31,32,33kullanımı ile atlatılabilir.
İnsan dokusundan birincil kültürlü hücrelerin elde edilmesi ve düzenli olarak ele alınması zordur. Bu nedenle, insan BBB araştırmalarında kullanılan çoğu insan hücresel modelleri ölümsüzleştirilmiş endotel hücre hatları vardır. Yayınlanan bir hücre hattı insan serebral mikrovasküler endotel hücre hattı hCMEC / D3, iyi ilaç alımı eğitimi için uygundur ve kullanımı kolaydır. Hücreler bir monolayer oluşturmak ve BBB34karakteristik sıkı kavşak proteinleri ifade , claudin-5 ifade düzeyi bozulmamış mikrokaplar daha düşük olduğu bildirilmiştir35 ve birçok özel taşıyıcılar transkript düzeyinde tespit edilmiştir36 yanı sıra proteomik çalışmalarda34. 30-50 Ω·cm2 aralığında nispeten düşük BIR TEER hala bir meydan okuma37. Beyin endotel hücreleri için başka bir kaynak insan pluripotent kök hücreleri (hPSCs)38 ve insan kordon kanı kaynaklı kök hücreleri dolaşan endotel döl ve hematopoetik soy39,40. Diferansiyasyonun her iki protokolü de sıkı hücre monokatmanları ve yüksek TEER değerleri (örneğin, ortak kültürlerde 1.450 Ω·cm2) ile sonuçlanır38. Bu kök hücre modelleri ekimi için aşırı bakım gerektirir, henüz hormonlar düzenleyen etkisini incelemek için fırsat sunuyoruz41 veya genetik geçmişe sahip hastalıklarınhastalıkları 42 BBB gelişimi.
Bu çalışmada, bbb'yi taklit etmek ve bakteriyel traversal'i incelemek için ölümsüzleştirilmiş transfecize edilmiş insan beyni mikrovasküler endotel hücre hattı THBMEC43'ükurduk. Hücreler bir filtreüzerinde tohumlanır ve bu hücre kültürü modelinde %100 biraraya kadar büyür. Bakteriler hücre kültür odasının üst kısmına aşılanır. Escherichia coli (E. coli)çalışmamızda E. coli menenjitinin yüksek insidansı nedeniyle44. Hücre tek katmanlı en düşük geçirgenlik gün 13 ve gün 15arasında 45tohumlama sonra oluşur gösterilmiştir. Bu nedenle, THBMEC monolayer tedavisi bu süre sonra yapılır ve bakteriler daha sonra monolayer apikal yüzeyinde orta aşılanır. Kuluçka süresinden sonra, bariyeri geçebilen bakteriler, agar plakaları üzerindeki bakterilerle kaplama ve koloniler sayma yoluyla ölçülür. Kolonilerin artan sayıda BBB ile yüksek bakteriyel geçiş ile ilişkilidir. TEER yaklaşık 70 Ω·cm246'dır. Ancak, belirtilen yöntemde TEER'in ölçülmesi gerekli değildir. BBB geçirgenliği için iyi kurulmuş bir değer olmasına rağmen, BBB ile bakterilerin geçiş üzerinde hiçbir etkisi var gibi görünüyor. Tedavi edilmeyen hücreler modelimizde sıkılığın kontrolü nde dir. Önceki çalışmalarda hücrelerin proinflamatuar sitokinlere tepki ve tipik sıkı kavşak proteinleri ifade edebiliyoruz gösterilmiştir47. Bu bileşik tarama ve taşıyıcı yüzeyler ve reseptörleri daha büyük bir dizi doğrulama sağlar.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agar - Agar</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>6494.3</td>
			<td>BioScience-Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclave</td>
			<td>Systec</td>
			<td>VX-150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacteria E.coli strain GM2163</td>
			<td>Fermentas Life Sciences, Lithuania</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photometer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>6131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cells THBMEC</td>
			<td>Group of M. F. Stins</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture flasks</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>658175</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Universal 320</td>
			<td>Hettrichlab</td>
			<td>1401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen IV</td>
			<td>SIGMA Aldrich</td>
			<td>C6745</td>
			<td>from human cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess Automated Cell Counter with cell counting chamber slides and Trypan Blue stain 0.4%</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C10311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture tubes</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>191180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cuvettes</td>
			<td>BRAND</td>
			<td>759015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Di sodium hydrogen phosphate di hydrate</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>1065800500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12</td>
			<td>GIBCO/ Thermo Sc.</td>
			<td>11330032</td>
			<td>HEPES</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tubes 15 ml</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>188271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tubes 50 ml</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>227261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>GIBCO/ Thermo Sc.</td>
			<td>10270</td>
			<td>value FBS -Brazil</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>SIGMA Aldrich</td>
			<td>F0556</td>
			<td>solution human fibroblasts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heracell 150 CO2 Incubator</td>
			<td>Heraeus</td>
			<td>50116047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator shaker I 26 New Brunswick</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>M1324-0000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inoculation loop</td>
			<td>Dr. Ilona Schubert - Laborfachhandel</td>
			<td>641000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth Base</td>
			<td>GIBCO/ Thermo Sc.</td>
			<td>12780029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>GIBCO/ Thermo Sc.</td>
			<td>25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microbial incubator B 6200</td>
			<td>Heraeus</td>
			<td>51015192</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microbiological Safety Cabinet AURA 2000 M.A.C. Class II</td>
			<td>BIOAIR</td>
			<td>12469</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope inverse</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>TELAVAL 31</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro tubes 2 ml</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>72,695,400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro tubes 1,5 ml</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>72,706,400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin / Streptomycin</td>
			<td>GIBCO/ Thermo Sc.</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Dr. Ilona Schubert - Laborfachhandel</td>
			<td>464-800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Roth</td>
			<td>HN02.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium-di-hydrogen phosphate</td>
			<td>Roth</td>
			<td>P018.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Roth</td>
			<td>9265.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThinCerts + Multiwell Plates</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>665631</td>
			<td>12 well, pore size 3.0 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin - EDTA</td>
			<td>GIBCO/ Thermo Sc.</td>
			<td>15400054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuumpump Laboport</td>
			<td>KNF</td>
			<td>N 86 KT.18</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analyzing the permeability of the blood-brain barrier by microbial traversal through microvascular endothelial cells

İnsan kan-beyin bariyeri (BBB) korumak ve beyin metabolizmasını düzenleyen biyomoleküller için çok düşük geçirgenlik ile karakterizedir. BBB esas olarak kollajen IV ve fibronektin açısından zengin bazal membranlara gömülü endotel hücrelerinden oluşur. BBB'nin disfonksiyonu ndan kaynaklanan çeşitli patolojiler ve ardından mikrobiyal travers, menenjit gibi hastalıklara neden olur. Farklı ilaçlar ve anestezikler de dahil olmak üzere birden fazla parametrenin BBB'nin geçirgenliği üzerindeki etkisini test etmek için BBB'yi insan beyni mikrovasküler endotel hücreleriyle taklit eden yeni bir insan hücresi kültürü modeli oluşturduk. Endotel hücreleri kollajen IV ve fibronektin kaplı filtre üniteleri üzerinde biraraya gelene kadar yetiştirilir ve daha sonra ilgi farklı bileşikler ile tedavi edilebilir. Mikrobiyal bir geçiş göstermek için, endotel hücrelerinin apikal yüzeyi ile üst oda bakteri ile aşılanır. Kuluçka döneminden sonra alt hazneörnekleri agar plakaları üzerine kaplanır ve elde edilen koloniler sayılır ve koloni sayısı BBB'nin geçirgenliği ile ilişkilidir. Enddogenöz hücresel faktörler bbb katkıda bulunan endotel hücrelerinin temel hücresel mekanizmaları açıklamak için bu deneysel kurulum analiz edilebilir. Buna ek olarak, bu platform endotel hücrelerinin geçirgenliğini etkileyebilecek bileşikler için bir ekran gerçekleştirmeye olanak sağlar. Son olarak, bakteriyel traversal incelenebilir ve farklı patolojiler ile bağlantılı, menenjit gibi. Bu modeli genişletmek ve BBB ile bakteri yollarını analiz etmek mümkün olabilir. Bu makalede, BBB geçirgenliğini araştırmak için açıklanan yöntemin ayrıntılı bir protokolünü salıyoruz.

Protokolün ardından hücreler tohumlandı ve BBB modeli üretildi. 14. gün tohumlamadan sonra hücreler reaktif aldehit olarak glyoxal ile tedavi edildi. Deneyin amacı POD27'de yaş ve diyabet arasındaki korelasyon ile yaşlı hastalarda menenjit insidansının yüksek olduğunu araştırmaktır48. Hem yaş hem de diyabet49'da gelişmiş glisasyon sonu ürünlerinin (AGE) artmış düzeyleri, BBB'de mikrobiyal traversin patogenezinde glisasyonun etkisinin daha fazla incelenmesini talep eder. Glisasyon karbonhidrat veya diğer karbonil bileşikleri azaltarak karbonil grupları ile proteinlerde serbest amino gruplarının non-enzimatik reaksiyonudur. Glikoz iyi karbonil gruplarının donör olarak bilinir; ancak, bilinen daha reaktif olanlar vardır. Kararsız bir Schiff üssü inşa ettikten sonra, onlar glyoxal gibi daha kararlı ve reaktif dikarbonil bileşikleri yeniden düzenlemek. AGEs, nihai ürünler, proteinler arasında çapraz bağlantılara neden olabilir50. Hücresel yapılara zarar verebilir ve AGEs (RAGE)51reseptörü ile etkileşim yoluyla hücresel işlevi değiştirebilir.
Hücreler 0.05 ve 0.15 mM glyoxal (GO) çözeltisi ile 1 saat boyunca tedavi edildi ve tedavi edilmeyen hücreler kontrol olarak görev yaptı. Glisasyon immünoblotlama ve anti-AGE antikor ile saptandı (Şekil 3). Elde edilen bakteri kolonileri sayıldı ve mutlak koloni sayısı olarak temsil edildi(Şekil 4A) veya kontrole normalleştirilen kolonilerin göreceli sayısı(Şekil 4B). İşlenmemiş hücrelerle kuyulardan alınan ortam çok az koloni oluşturmuştur. Bu sonuç, tedavi edilmeyen hücrelerin bir bariyer oluşturabildiğini ve bir kontrol görevi görebileceklerini göstermiştir. Glyoxal ile tedavi edilen örnekler kolonilerin artan sayıda görüntülenen, THBMECs ve hücresel bariyer yoğunluğu üzerinde glyoxal bir etkisi olduğu sonucuna yol açan, kolonilerin sayısı tedavi edilmemiş ve tedavi hücreleri arasında önemli bir fark gösterdi çünkü. Glyoxal ile tedavi den sonra bariyerin artan bakteriyel geçiş diyabet bbb arıza ile hastalıklarla ilişkili neden açıklayabilir.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60692/60692fig3a.jpg"> Şekil 3: İmmünoblotlama yoluyla protein glisasyonunun saptanması. THBMECs 1 saat için farklı konsantrasyonlarda GO ile tedavi edildi. Toplam protein izole edildi ve SDS-PAGE kullanılarak ayrıldı. Proteinlerin glisasyonu anti-AGE-antikor (CML-26) kullanılarak immünolotlama ile saptandı. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60692/60692fig3alarge.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Farklı bir ortamda, THBMECs protein glisasyonu glikoz tarafından indüklenen oldu. Sterilize glukoz DMEM/F-12 ortamına 17,5 mM ile normal glukoz lu ortamdan (NG) 42,5 mM ile yüksek glikoz ortamına (HG) glikoz konsantrasyonu arttırıldı. THBMECs iki farklı hücre kültürü şişeleri ekili edildi: normal glikoz (NG) orta ve yüksek glikoz (HG) orta diğer. Bu iki farklı ortam aynı zamanda 12 kuyu plakalı filtrelerde BBB'nin büyümesi için de kullanılmıştır. NG ortamda yetiştirilen hücreler kontrol olarak görev yaptı. Elde edilen koloniler mutlak koloni sayısı(Şekil 4C)veya kontrole normalleştirilen kolonilerin göreli sayısı olarak temsil edilir (Şekil 4D). Sonuçlar, insan BBB yoluyla bakterilerin geçiş üzerinde önemli bir etkisi olduğunu göstermektedir, NG vs HG etkisi BBB bütünlüğünü etkileyecek kadar şiddetli olmadığı sonucuna yol açan. Farklı senaryolar modeli ve BBB taklit hücrelerin bütünlüğünü kanıtlamak için tasarlanmıştır.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60692/60692fig4d.jpg"> Şekil 4: THBMECs ile BBB modelinde sayılan bakteri kolonilerinin mutlak ve göreceli sayıları. THBMECs 1 saat için 0.15 mM GO ile tedavi edildi, tedavi edilmemiş hücreler bir kontrol olarak görev yaptı. Her üst hazne toplam 450 μL E. coli süspansiyon (OD600 = 0,5) eklendi. Alt bölmelerden orta 6 saat sonra agar plakaları üzerine kaplanmıştır. (A) Grafik, sayılan kolonilerin ortalama +/- SEM ortalamasını gösterir. (B) Grafik, tedavi edilmeyen hücrelere normalleştirilen sayılan kolonileri kontrol +/- SEM (n = 4) olarak gösterir. (C) ve (D), THBMECs NG ve HG ortamda yetiştirildi. Her üst hazne toplam 450 μL E. coli süspansiyon (OD600 = 0,5) eklendi. Alt hazneden orta 6 saat sonra agar plakaları üzerine kaplanmıştır. (C) Grafik, sayılan kolonilerin ortalama +/- SEM ortalamasını gösterir. (D) Grafik, tedavi edilmeyen hücrelere normalleştirilen sayılan kolonileri kontrol +/- SEM (n = 3) olarak gösterir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60692/60692fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Analyzing the Permeability of the Blood-Brain Barrier by Microbial Traversal through Microvascular Endothelial Cells at JoVE.com

Analyzing the Permeability of the Blood-Brain Barrier by Microbial Traversal through Microvascular Endothelial Cells

İnsan kan-beyin bariyeri seçici hidrofilik moleküllerin ve patojenlerin beyne penetrasyon engeller. Menenjit ve postoperatif deliryum da dahil olmak üzere çeşitli patolojiler, kan-beyin bariyerinin artan geçirgenliği ile ilişkilidir. Burada, bariyer geçirgenliğini mikrobiyal geçiş le test etmek için bir endotel hücre kültür modelini tanımlıyoruz.

Mikrovasküler Endotel Hücreleri Ile Mikrobiyal Traversal ile Kan-Beyin Bariyerinin Geçirgenliğinin Analizi

The human blood-brain barrier (BBB) is characterized by a very low permeability for biomolecules in order to protect and regulate the metabolism of the ...

Bu yöntem, farklı tedaviler üzerine bakteriyel geçiş ölçerek insan kan-beyin bariyerini analiz etmek mümkün kılar. Bakteriyel menenjit ve postoperatif deliryum patogenezini keşfetmeye yardımcı olabilir. Bu basit bir yöntemdir ve tedavinin etkileri doğrudan bakteri sayısı ile temsil edilmektedir.Endotel hücrelerindeki bileşiklerin yüksek iş analizini sağlamak için değiştirilebilir. 12 kuyulu plakayı biyolojik bir güvenlik kabinine monte ederek başlayın. Plakayı ve her kesici ucu boşaltın, daha sonra tabanındaki kesici uçları kapmak ve kuyulara koymak için sterilize edilmiş forceps kullanın.Her kesici niçin 90 mikrolitre mikrolitre mikrolitre kollajen IV ve fibronektin karışımı ile gözenekli membran katlayın ve 24 saat boyunca 37 santigrat derecede bir hücre kültürü kuluçka plaka kuluçka. Kuluçkadan sonra, kesici uçları her kesici uça bir mililitre PBS boru sulayarak ve vakum pompası ile azarlayarak iki kez yıkayın. Daha sonra üst ve alt bölmelerde önceden ısınmış DMEM F12 ortamını borulandırarak membranları dengeleyin ve plakayı 37 santigrat derece ve %5 karbondioksitle kuluçkaya yatırın.Insan mikrovasküler endotel hücrelerini tohumlamak için, hücre kültürü şişeden orta aspire ve PBS 10 mililitre ile hücreleri yıkayın. Hücreleri beş mililitre tripsin EDTA ile kaplayın ve şişeyi 37 santigrat derecede 3-5 dakika kuluçkaya yatırın. Hücrelerin beş mililitresini 15 mililitrelik bir tüpe aktarın ve enzimatik reaksiyonu durdurmak için orta içeren beş mililitre FCS ekleyin.210 kez g üç dakika süspansiyon santrifüj, supernatant çıkarın ve orta beş mililitre hücre pelet askıya. Hücre süspansiyon10 mikrolitre ekleyin 10 mikrolitre 0.4% trypan mavi leke, sonra bir sayma odasına karışımın 10 mikrolitre ekleyin. Sayma odasını hücre sayacına koyun ve sayacın odaklandığınızdan emin olmak için uygun programı başlatın.Saydıktan sonra, tohum 200, 000 hücreleri 12-iyi plaka üzerinde her üst odaya ve 37 derece santigrat 14 gün boyunca üst ve alt odasında her iki ila üç gün medya değiştirerek plaka kuluçka. 14 gün sonra, mikroskopla görüntüleyerek hücre birleşiminin %100 olduğundan emin olun. Geçirgenlik ölçümünden bir gün önce, bir kolonie G.COL Orta Üç mililitre içine E.coli süzme GM2163 koyun.37 derecedeki hücreleri kuluçka da 24 saat boyunca kültür. Hücreleri ilgi çekici bir şekilde tedavi etmek için, DMEM F12 ortamındaki son konsantrasyonuna seyreltin ve bu karışımı 12 kuyulu plakanın üst ve alt odalarına ekleyin, sonra da bir hücre kültürü kuluçka makinesinde plakayı kuluçkaya yatırın. Kuluçkadan sonra, antibiyotiksiz orta ile tam orta değişimi.Optik yoğunluğunu 600 nanometre de ölçerek bir gecede bakteri kültürünün konsantrasyonunu belirleyin, sonra 50 mililitrelik Falcon tüpünde 0,5 od600'e seyreltin. Biyolojik bir güvenlik kabininde, 12 kuyulu plakanın her bir üst haznesine 450 mikrolitre bakteri çözeltisi ekleyin, sonra tabağı 37 santigrat derecede altı saat kuluçkaya yatırın. Kuluçkadan sonra, kesici uçlarla kesici uçları çıkarın ve ortanın 50 mikrolitresini her alt odadan alın ve ortayı üst odalardan alt odalara dökmemeye özen inin.Üst ve alt odanın ortamını, üst odanın bakterilerinden dökülmesi yanlış pozitif sonuçlara yol açacağı ndan, kesinlikle ayırmak önemlidir. Her numuneyi ayrı bir agar plakasına bırakın ve çözeltiyi bir hücre dağıtıcısıyla çizgiye yerleştirin. Plakaları 24 saat boyunca 37 derecede kuluçkaya yatırın, sonra da kolonileri sayın.Kan-beyin bariyerinden geçerek mikrobiyal geçiş üzerindeki glisasyon etkisini araştırmak için, hücreler bir saat boyunca 0.5 ve 0.15 milibüler glyoxal solüsyon ile tedavi edildi tedavi edilmemiş hücreler bir kontrol görevi gördü. Glisasyon daha sonra anti-AGE antikorları ile immünoblotting yoluyla tespit edildi. Elde edilen bakteri kolonileri sayıldı ve mutlak koloni sayısı veya kontrole normalleştirilen kolonilerin göreceli sayısı olarak temsil edildi.Glyoxal ile tedavi edilen örnekler, tedavinin hücresel bariyer yoğunluğu üzerinde bir etkisi olduğunu gösteren kolonisayısının arttığını gösterdi. Glikoza bağlı protein glisasyonu araştırmak için THBMEC'ler normal glikoz ve yüksek glikoz lu ortamda yetiştirildi. Mutlak koloni sayısı ve kontrole normalleştirilen kolonilerin göreceli sayısı glikozun kan-beyin bariyerinin bütünlüğü üzerinde önemli bir etkisi olmadığını göstermiştir.Tedavi edilen endotel hücreleri proteomdaki değişiklikleri analiz etmek için proteomik yaklaşımlarla, örneğin kütle spektrometresi ile daha fazla analiz edilebilir. Bu teknik insan kan-beyin bariyeri ve bakteriyel geçiş anlamada yardımcı olur. Bu Alzheimer hastalığı gibi yaşlanma ve nörodejeneratif hastalıkların yönlerini keşfetmek için kullanılabilir.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Separation of Single-stranded DNA, Double-stranded DNA and RNA from an Environmental Viral Community Using Hydroxyapatite Chromatography

Tek iplikli DNA, çift iplikli DNA ve RNA Hidroksiapatit Kromatografisi kullanarak bir Çevre Viral Topluluk ayrılması

Viruses, particularly bacteriophages (phages), are the most numerous biological entities on Earth1,2.  Viruses modulate host cell abundance and diversity, ...

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

Hücre-kaderi ardından<em&gt; E. coli</em&gt; Faj Lambda tarafından Enfeksiyon Sonrası

The system comprising bacteriophage (phage) lambda and the bacterium E. coli has long served as a paradigm for cell-fate determination1,2. Following the ...

Generation of Recombinant Arenavirus for Vaccine Development in FDA-Approved Vero Cells

FDA onaylı Vero hücrelerinde Aşı Geliştirme için bir araya getiren Arenavirus üretimi

The development and implementation of arenavirus reverse genetics represents a significant breakthrough in the arenavirus field  4. The use of cell-based ...

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Nicel<em&gt; In vitro</emStatik Koşullarında Account İlköğretim İnsan mikrovasküler endotel hücreleri için Nötrofil yapışma Tedbir&gt; Testi

The vascular  endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the  acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are ...

Analyzing the Effects of Stromal Cells on the Recruitment of Leukocytes from Flow

Akış adlı lökositlerin üzerine Stromal hücreler Etkilerinin İncelenmesi

Stromal cells regulate the recruitment of circulating leukocytes during inflammation through cross-talk with neighboring endothelial cells. Here we ...

An In Vitro Model of the Blood-brain Barrier Using Impedance Spectroscopy: A Focus on T Cell-endothelial Cell Interaction

An In Vitro Model of the Blood-brain Barrier Using Impedance Spectroscopy: A Focus on T Cell-endothelial Cell Interaction

bir<em&gt; İn Vitro</em&gt; Empedans Spektroskopisi kullanarak kan-beyin bariyerinin Model: T Hücre-endotelyal hücre Etkileşim Üzerine Bir Odak

Breakdown of the blood-brain barrier (BBB) is a critical step in the development of autoimmune diseases such as multiple sclerosis (MS) and its animal ...

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Bir kullanma Lenfosit Ekstravazasyonunun analizi<em&gt; İn Vitro</em&gt; İnsan Kan-beyin bariyeri Model

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte ...

High-throughput Measurement of Plasma Membrane Resealing Efficiency in Mammalian Cells

Plazma zarı verimliliği memeli hücrelerinde yeniden mühürlemeden yüksek üretilen iş ölçümü

In their physiological environment, mammalian cells are often subjected to mechanical and biochemical stresses that result in plasma membrane damage. In ...

Digestion of the Murine Liver for a Flow Cytometric Analysis of Lymphatic Endothelial Cells

Lenfatik endotel hücreleri akış sitometrik çözümlenmesi için fare karaciğer sindirim

Within the liver, lymphatic vessels are found within the portal triad, and their described function is to remove interstitial fluid from the liver to the ...