Name: applying live cell imaging and cryo-electron tomography to resolve spatiotemporal features of the legionella pneumophila dot/icm secretion system
Uploaded: 2020-03-10T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Applying Live Cell Imaging and Cryo-Electron Tomography to Resolve Spatiotemporal Features of the Legionella pneumophila Dot/Icm Secretion System at JoVE.com

تم دعم العاصمة وC.R.R. من قبل المعاهد القومية للصحة (R37AI041699 وR21AI130671). تم دعم D.P. و B.H. و J.L. من قبل المعاهد الوطنية للصحة (R01AI087946 وR01GM107629).

ملاحظة: يجب إجراء جميع الإجراءات التي تنطوي على نمو وتلاعب وتصوير L. الرئوي ة في مختبر مستوى السلامة البيولوجية 2 وفقا للمبادئ التوجيهية المحلية.
1. إدراج sfGFP في L. كروموسوم الرئوي باستخدام تبادل أليليتش واستراتيجية الاختيار المزدوج(الشكل 2، الشكل <strong...

<ol>
	<li>Franco, I. S., Shuman, H. A., Charpentier, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+perplexing+functions+and+surprising+origins+of+Legionella+pneumophila+type+IV+secretion+effectors.">The perplexing functions and surprising origins of Legionella pneumophila type IV secretion effectors.</a> Cellular Microbiology. 11, 1435-1443 (2009).</li><li>Burstein, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-scale+identification+of+Legionella+pneumophila+effectors+using+a+machine+learning+approach.">Genome-scale identification of Legionella pneumophila effectors using a machine learning approach.</a> PLOS Pathogens. 5, 1000508 (2009).</li><li>Ninio, S., Roy, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effector+proteins+translocated+by+Legionella+pneumophila:+strength+in+numbers.">Effector proteins translocated by Legionella pneumophila: strength in numbers.</a> Trends in Microbiology. 15, 372-380 (2007).</li><li>Vogel, J. P., Andrews, H. L., Wong, S. K., Isberg, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conjugative+transfer+by+the+virulence+system+of+Legionella+pneumophila.">Conjugative transfer by the virulence system of Legionella pneumophila.</a> Science. 279, 873-876 (1998).</li><li>Isberg, R. R., O'Connor, T. J., Heidtman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Legionella+pneumophila+replication+vacuole:+making+a+cosy+niche+inside+host+cells.">The Legionella pneumophila replication vacuole: making a cosy niche inside host cells.</a> Nature Reviews Microbiology. 7, 13-24 (2009).</li><li>Roy, C. R., Berger, K. H., Isberg, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Legionella+pneumophila+DotA+protein+is+required+for+early+phagosome+trafficking+decisions+that+occur+within+min+of+bacterial+uptake.">Legionella pneumophila DotA protein is required for early phagosome trafficking decisions that occur within min of bacterial uptake.</a> Molecular Microbiology. 28, 663-674 (1998).</li><li>Archer, K. A., Roy, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MyD88-Dependent+Responses+Involving+Toll-Like+Receptor+2+Are+Important+for+Protection+and+Clearance+of+Legionella+pneumophila+in+a+Mouse+Model+of+Legionnaires'+Disease.">MyD88-Dependent Responses Involving Toll-Like Receptor 2 Are Important for Protection and Clearance of Legionella pneumophila in a Mouse Model of Legionnaires' Disease.</a> Infection and Immunity. 74, 3325-3333 (2006).</li><li>Nagai, H., Kubori, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+IVB+Secretion+Systems+of+Legionella+and+Other+Gram-Negative+Bacteria.">Type IVB Secretion Systems of Legionella and Other Gram-Negative Bacteria.</a> Frontiers in Microbiology. 2, 136 (2011).</li><li>Kubori, T., Nagai, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Type+IVB+secretion+system:+an+enigmatic+chimera.">The Type IVB secretion system: an enigmatic chimera.</a> Current Opinion in Microbiology. 29, 22-29 (2016).</li><li>Chetrit, D., Hu, B., Christie, P. J., Roy, C. R., Liu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+unique+cytoplasmic+ATPase+complex+defines+the+Legionella+pneumophila+type+IV+secretion+channel.">A unique cytoplasmic ATPase complex defines the Legionella pneumophila type IV secretion channel.</a> Nature Microbiology. 3, 678-686 (2018).</li><li>Merriam, J. J., Mathur, R., Maxfield-Boumil, R., Isberg, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+Legionella+pneumophila+fliI+gene:+intracellular+growth+of+a+defined+mutant+defective+for+flagellum+biosynthesis.">Analysis of the Legionella pneumophila fliI gene: intracellular growth of a defined mutant defective for flagellum biosynthesis.</a> Infection and Immunity. 65, 2497-2501 (1997).</li><li>Feeley, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Charcoal-yeast+extract+agar:+primary+isolation+medium+for+Legionella+pneumophila.">Charcoal-yeast extract agar: primary isolation medium for Legionella pneumophila.</a> Journal of Clinical Microbiology. 10, 437-441 (1979).</li><li>Andrews, H. L., Vogel, J. P., Isberg, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+linked+Legionella+pneumophila+genes+essential+for+intracellular+growth+and+evasion+of+the+endocytic+pathway.">Identification of linked Legionella pneumophila genes essential for intracellular growth and evasion of the endocytic pathway.</a> Infection and Immunity. 66, 950-958 (1998).</li><li>Morado, D. R., Hu, B., Liu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+Tomoauto:+A+Protocol+for+High-throughput+Automated+Cryo-electron+Tomography.">Using Tomoauto: A Protocol for High-throughput Automated Cryo-electron Tomography.</a> Journal of Visualized Experiments. (107), e53608 (2016).</li><li>Hu, B., Lara-Tejero, M., Kong, Q., Galan, J. E., Liu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Situ+Molecular+Architecture+of+the+Salmonella+Type+III+Secretion+Machine.">In Situ Molecular Architecture of the Salmonella Type III Secretion Machine.</a> Cell. 168, 1065-1074 (2017).</li><li>Mastronarde, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+electron+microscope+tomography+using+robust+prediction+of+specimen+movements.">Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements.</a> Journal of Structural Biology. 152, 36-51 (2005).</li><li>Zheng, S. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MotionCor2:+anisotropic+correction+of+beam-induced+motion+for+improved+cryo-electron+microscopy.">MotionCor2: anisotropic correction of beam-induced motion for improved cryo-electron microscopy.</a> Nature Methods. 14, 331-332 (2017).</li><li>Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computer+visualization+of+three-dimensional+image+data+using+IMOD.">Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD.</a> Journal of Structural Biology. 116, 71-76 (1996).</li><li>Gilbert, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Iterative+methods+for+the+three-dimensional+reconstruction+of+an+object+from+projections.">Iterative methods for the three-dimensional reconstruction of an object from projections.</a> Journal of Theoretical Biology. 36, 105-117 (1972).</li><li>Radermacher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Weighted+Back-projection+Methods.">Weighted Back-projection Methods.</a> Electron Tomography. , 245-273 (2007).</li><li>Winkler, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tomographic+subvolume+alignment+and+subvolume+classification+applied+to+myosin+V+and+SIV+envelope+spikes.">Tomographic subvolume alignment and subvolume classification applied to myosin V and SIV envelope spikes.</a> Journal of Structural Biology. 165, 64-77 (2009).</li><li>Winkler, H., Taylor, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+marker-free+alignment+with+simultaneous+geometry+determination+and+reconstruction+of+tilt+series+in+electron+tomography.">Accurate marker-free alignment with simultaneous geometry determination and reconstruction of tilt series in electron tomography.</a> Ultramicroscopy. 106, 240-254 (2006).</li><li>Prevost, M. S., Waksman, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-ray+crystal+structures+of+the+type+IVb+secretion+system+DotB+ATPases.">X-ray crystal structures of the type IVb secretion system DotB ATPases.</a> Protein Science. 27, 1464-1475 (2018).</li><li>Miklos, G. L., Rubin, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+the+genome+project+in+determining+gene+function:+insights+from+model+organisms.">The role of the genome project in determining gene function: insights from model organisms.</a> Cell. 86, 521-529 (1996).</li><li>Reyrat, J. M., Pelicic, V., Gicquel, B., Rappuoli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Counterselectable+markers:+untapped+tools+for+bacterial+genetics+and+pathogenesis.">Counterselectable markers: untapped tools for bacterial genetics and pathogenesis.</a> Infection and Immunity. 66, 4011-4017 (1998).</li><li>Yu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Molecule+Studies+in+Live+Cells.">Single-Molecule Studies in Live Cells.</a> Annual Review of Physical Chemistry. 67, 565-585 (2016).</li><li>Stewart, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-electron+microscopy+and+cryo-electron+tomography+of+nanoparticles.">Cryo-electron microscopy and cryo-electron tomography of nanoparticles.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: Nanomedicine and Nanobiotechnology. 9, (2017).</li></ol>

إن توضيح وظائف أنظمة الإفراز البكتيري هو المفتاح لفهم كامل للتفاعلات بين المضيف والعامل الممرض. أنظمة الإفراز هي آلات معقدة يمكنها حقن البروتينات المؤثرات في الخلايا المضيفة ، وفي بعض الحالات تعزز إنشاء مكانة دون خلوية تدعم النسخ البكتيري. الأسلوب أعلاه يوفر أدوات جديدة هامة لدراسة نظام...

الفيلقية الرئوية (L. الرئوية),العامل المسببات لمرض الفيلق, يسكن خزانات المياه العذبة, حيث تنتشر البكتيريا عن طريق إصابة وتكرار داخل البروتوزوا المائية الحرة السباحة. L. الرئوي يسبب تفشي الأمراض في البشر عندما استنشاق البكتيريا الهباء الجوي من مصادر مياه الشرب يحدث. في الخلايا المصابة، تخريب مسارات المضيف يسمح L. الرئوي لتأخير النضج الانديسيمن اللافوال الذي يقيم فيه وتعزيز التكوين الحيوي للحجرة الخلوية التي تدعم النسخ البكتيري. والدافع وراء هذه العملية من قبل نوع البكتيريا المتخصصة IVB إفراز النظام (T4BSS) المعروفة باسم نقطة / Icm ذخيرتها من أكثر من 300 "المؤثرات" البروتينات التي يتم نقلها إلى السيتوسول المضيف أثناء العدوى لتسهيل التلاعب وظائف الخلوية1،2،3،4،5. المسوخ التي تفتقر إلى جهاز نقطة وظيفية / Icm تفشل في تقديم المؤثرات في السيتوسول المضيف ، معيبة للتكرار داخل الخلايا ، وهي في نماذج الحيوانات من المرض6،7.
وقد وضعت العديد من الأنواع البكتيرية آلات متعددة المكونات معقدة للغاية وديناميكية المطلوبة لعمليات العدوى. T4BSS أخرى مثل نظام نقطة / Icm ضرورية أيضا لتكرار داخل الخلايا من مسببات الأمراض البكتيرية مثل Coxiella burnetii وريكيتسيلا غريللي. على الرغم من أن T4BSS ترتبط تطورًا بأنظمة IVA من النوع النموذجي ، والتي تتوسط في نقل الحمض النووي ويمكن أن توفر ذخيرة محدودة من البروتينات المؤثرات ، فإن نظام Dot / Icm يحتوي على ضعف العديد من مكونات الجهاز ويسلم مجموعة واسعة من المؤثرات. ويفترض أن هذا التوسع في عدد من المكونات قد مكنت جهاز نقطة / Icm لاستيعاب ودمج المؤثرات الجديدة بسهولة8،9.
لقد استخدمنا مؤخرًا التصوير المقطعي بالإلكترونات (cryo-ET) لحل بنية جهاز Dot/Icm في الموقع وأظهرنا أنه يشكل قناة ممتدة للغلاف الخلوي تتصل بمجمع سيتوبلازمي. وكشف مزيد من التحليل أن CYTOsolic ATPase DotB المنتسبين مع نظام نقطة / Icm في القطب L. خلية الرئوية من خلال التفاعلات مع ATPase DotO الخلوي. لقد اكتشفنا أن DotB يعرض حركة دورية في معظم الخلايا البكتيرية ، مما يشير إلى أن هذا ATPase موجود في مجموعة دورية ديناميكية ولكنه يرتبط أيضًا بمجمعات Dot / Icm القطبية. بالإضافة إلى ذلك ، تشكل DotO تجميعًا حشسيًا من أجهزة الديمون DotO المرتبطة بمجمع الغشاء الداخلي ، وينضم سداسي DotB إلى قاعدة هذا المجمع السيتوبلازمي. تجميع مجمع الطاقة DotB-DotO يخلق قناة السيتوبلازمية التي توجه نقل الركائز من خلال T4SS(الشكل 1)10.
على الرغم من هذه التطورات الأخيرة ، لا يعرف سوى القليل عن كيفية وظائف نظام Dot / Icm وكيف يتجمع كل بروتين لتشكيل جهاز نشط8. الكشف عن الدوائر التنظيمية للنقطة / Icm T4SS أمر أساسي لفهم الآليات الجزيئية للتفاعلات المضيفة الممرض. لذلك ، نناقش كيفية استخدام المجهر الخلية الحية والتبريد ET للكشف عن وتوصيف الأساسية L. الرئوية دوت / Icm مكونات النظام التي يتم وضع علامة مع سوبر المجلد GFP (sfGFP). باستخدام المجهر الفلوري الكمي ، سيتم تعريف التعريب القطبي لـ DotB في خلفية من النوع البري أو عند حذف نظام النوع الرابع. سيتم استخدام المجهر الفاصل الزمني لقياس الاختلافات في التعريب والديناميكيات بين ATPases Cytosolic Dot/Icm.
التطبيق المشترك لنهجين متكاملين مثل التصوير الحي والتبريد ET يوفر ميزة بالمقارنة مع غيرها من الأنظمة المختبرية. يتم تنفيذ كلتا الطريقتين في خلايا سليمة والحفاظ على البيئة الطبيعية للT4BSS، وبالتالي تقليل اضطراب الهيكل الأصلي أثناء إعداد العينة. لأن الإفراط في التعبير عن البروتينات قد يضعف قياس التروية من جهاز إفراز، يتم إرجاع الاندماجsfGFP عن طريق تبادل أليليإلى كروموسوم الفيلقية بحيث يتم ترميز كل الانصهار في نسخة واحدة ويحرك التعبير من قبل المروج الذاتية. تصور الانصهار الكروموسومات المشفرة تمكن من القياس الكمي للمستوى الدقيق للبروتين الذي يتم التعبير عنه في نقطة زمنية محددة. Cryo-ET أيضا العديد من المزايا لتحديد هيكل أنظمة إفراز. الميزة الأبرز هي أن عينات Cryo-ET تتكون من خلايا مجمدة سليمة تحافظ على المجمعات الأصلية في سياق بنية الخلايا البكتيرية. وبالتالي، قد يكون من الأفضل للكبوو-ET نهج تنقية البيوكيميائية، التي تستخرج المجمعات الأغشية وقد تجرد البروتينات الطرفية من الجهاز الأساسي أو تعديل الهيكل العام. بالإضافة إلى ذلك ، وضع علامات على بروتين مهم مع بروتين ضخم مثل sfGFP يضيف كتلة يمكن اكتشافها بواسطة Cryo-ET ويمكن أن تساعد في رسم خرائط المجمعات الفرعية المختلفة لجهاز Dot / Icm على الهيكل الذي تم الحصول عليه بواسطة cryo-ET.
هذا النهج هو أداة قوية للكشف عن المعلومات الهيكلية حول المجمعات المتعددة الجزيئية التي تتجمع في غشاء الخلية البكتيرية. سيساعد تفسير الهياكل التي تم توضيحها باستخدام هذه التقنيات الحقل على فهم كيفية عمل مكونات T4BSS ، ولماذا هناك حاجة إلى العديد من المكونات للوظيفة ، وكيف تتفاعل المكونات داخل المجمع الأكبر ، وما هي وظائف هذه التجميعات الفرعية تنفيذ.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 nm colloidal gold particles</td>
			<td>Aurion</td>
			<td>25486</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100x Plan Apo objective (1.4 NA)</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Activated charcoal</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C5510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agaroze GPG/LMP, low melt</td>
			<td>American bioanalytical</td>
			<td>AB00981</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto dehydrated agar</td>
			<td>BD</td>
			<td>214010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoolSNAP EZ 20 MHz digital monochrome camera</td>
			<td>Photometrics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gene Frame, 1.7x2.8 cm, 125 &#181;L</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AB-0578</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Holey Carbon grid R 2/1 Cu 200 mesh</td>
			<td>Quantifoil</td>
			<td>Q225-CR1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iron(III) nitrate nonahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>216828</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2 Summit camera for cryo-EM</td>
			<td>GATAN</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Cysteine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C7352</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope cover slides 22x22 mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-542B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope cover slides 24x50 mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-545K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides 25x75x1 mm</td>
			<td>Globe Scientific</td>
			<td>1380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SlideBook 6.0</td>
			<td>Intelligent Imaging Innovations</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectra X light engine</td>
			<td>Lumencor</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq 2X Master Mix</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>M0270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Titan Krios</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract</td>
			<td>BD</td>
			<td>212750</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

applying live cell imaging and cryo-electron tomography to resolve spatiotemporal features of the legionella pneumophila dot/icm secretion system

نظام إفراز Dot/Icm من الفيلق الرئوي Legionella هو نظام إفراز من النوع الرابع (T4SS) جهاز نانوي معقد يُجتار في القطب البكتيري ويتوسط في تسليم ركائز البروتين والحمض النووي إلى الخلايا المستهدفة ، وهي عملية تتطلب بشكل عام الاتصال المباشر من خلية إلى خلية. لقد حللنا مؤخرًا بنية جهاز Dot /Icm بواسطة التصوير المقطعي بالإلكترونات (cryo-ET) وأظهرنا أنه يشكل قناة ممتدة للغلاف الخلوي تتصل بمجمع سيتوبلازمي. تطبيق نهجين متكاملين التي تحافظ على الهيكل الأصلي للعينة، المجهر الفلوري في الخلايا الحية والتبريد-ET، يسمح في الموقع تصور البروتينات واستيعاب قياس الخلايا وتوقيت إنتاج كل مكون آلة بالنسبة إلى غيرها من الوحدات الفرعية نقطة / Icm. للتحقيق في متطلبات تحديد المواقع القطبية وتوصيف الميزات الديناميكية المرتبطة بالتكوين الحيوي لآلة T4SS ، قمنا بدمج جين ترميز بروتين الفلورسنت الأخضر فوق المجلد إلى جينات Dot / Icm ATPase في مواقعها الأصلية على الكروموسوم. تدمج الطريقة التالية المجهر المجهري للفلورية الكمية للخلايا الحية والتبريد-ET لتحديد التوطين القطبي وديناميكيات وبنية هذه البروتينات في الخلايا البكتيرية السليمة. تطبيق هذه النهج لدراسة الفيلق ية الهوائية T4SS مفيد لتوصيف وظيفة نظام نقطة / Icm ويمكن تكييفها لدراسة مجموعة واسعة من مسببات الأمراض البكتيرية التي تستخدم T4SS أو أنواع أخرى من مجمعات إفراز البكتيريا.

تم استخدام إعادة التركيب المتجانس مع التحديد المزدوج في خطوتين لبناء الإدراج المحدد لـ sfGFP. في الخطوة الأولى، تم تنفيذ التزاوج ثلاثي الوالدين، حيث تم تعبئة bRK600 بلازميد الزوجية (بلازميد IncP) من سلالة مساعد الإشريكية القولونية E. MT616 إلى سلالة الإشريكية القولونية المانحة مع ناقل الا...

Watch this Scientific Journal Video about Applying Live Cell Imaging and Cryo-Electron Tomography to Resolve Spatiotemporal Features of the Legionella pneumophila Dot/Icm Secretion System at JoVE.com

Applying Live Cell Imaging and Cryo-Electron Tomography to Resolve Spatiotemporal Features of the Legionella pneumophila Dot/Icm Secretion System

تصوير الخلايا البكتيرية هو نهج بيولوجيا الأنظمة الناشئة الذي يركز على تحديد العمليات الثابتة والديناميكية التي تملي وظيفة الآلات الجزيئية الكبيرة. هنا ، يتم استخدام التكامل بين التصوير الكمي للخلايا الحية والتصوير المقطعي بالإلكترونات الباردة لدراسة Legionella الرئوية من نوع IV بنية نظام الإفراز ووظائفه.

تطبيق التصوير الخلوي المباشر والتصوير المقطعي بالتبريد الإلكترون لحل الميزات الزمنية للالفيلقية الهوائية Dot/Icm نظام إفراز

The Dot/Icm secretion system of Legionella pneumophila is a complex type IV secretion system (T4SS) nanomachine that localizes at the bacterial pole and ...

هذا البروتوكول مفيد لتميز وظائف تجميع مجمعات إفراز البكتيريا ويمكن أن يؤدي إلى فهم أساسي للآليات الجزيئية المطلوبة للتفاعلات المسببة للأمراض المضيفة. هذه التقنية يدمج النهج التكميلية التي تحافظ على الهيكل الأصلي للعينة ويسمح وانظر إلى تصور مجمعات البروتينات في الخلايا البكتيرية سليمة. يزيد من فهمنا للعلاقات وظيفة الهيكلية من نظم إفراز البكتيريا.يمكن تكييف هذه الطريقة لدراسة أنواع أخرى من أنظمة إفراز أو غيرها من المجمعات الخلوية في مجموعة واسعة من الأنواع البكتيرية. ابدأ بصنع منصات agarose لتصوير الخلايا الحية. إعداد حوالي 30 مل من 1٪ منخفضة تذوب حل agarose في الماء والميكروويف في قارورة زجاجية لمدة 90 ثانية تدور في بعض الأحيان حتى يتم حل agarose تماما.ضع اثنين من 22 في 22 من قبل 0.15mm الشرائح الزجاجية على حافة 25 من قبل 75 من قبل 1.1mm الزجاج الشريحة واحد على رأس الآخر. ثم قم بتكديس اثنين من الشرائح الأصغر على الحافة الأخرى. الماصات حوالي 1 مل من agarose المنصهر في الشريحة وسط بين الشرائح الزجاج العلوي اثنين ووضع شريحة كبيرة أخرى على رأس agarose المنصهر التأكد من تجنب تشكيل فقاعات الهواء.تبرد الشرائح عند أربع درجات مئوية لمدة 15 دقيقة ثم استخدم مشرط أو شفرة حلاقة لقطع الوسادة بلطف إلى مربعات صغيرة. إصلاح إطار لاصق على الوجهين على شريحة زجاجية 25 في 75 في 1.1 مم ووضع عدة منصات على الشريحة. حل رقعة ثقيلة من الفيلق Pneumophila في 1 مل من الماء المقطر المزدوج.ثم دوامة وماصات اثنين إلى ثلاثة ميكرولترات من التخفيف على منصات. ضع غطاءً برفق 58 في 24 في 0.15 مم على الإطار اللاصق. حدد الخلايا للتصوير باستخدام إضاءة المجال الساطعة.ثم، في نافذة التقاط برنامج المجهر، ضبط ND إلى 180 وbinning إلى اثنين من قبل اثنين. استخدم قناة نانومتر 488 لفضح العينة لمدة 500 إلى 1000 مللي ثانية والتحقق من خصوصية الفلورسينس عن طريق تصوير الفيلقية غير الموسومة Pneumophila بنفس المعلمات. لتحديد القطبية، ضبط النقيض من الصورة حتى تكون البكتيريا مرئية بوضوح.ثم التكبير في المنطقة من الفائدة واستخدام أداة المنطقة لوضع مستطيل 0.25 من 1.3 ميكرومتر بدءا من القطب وتمتد إلى السيتوبلازم مع التأكد من أن المستطيل يبقى داخل الحدود البكتيرية. ضع علامة على 200 بكتيريا على الأقل وإنشاء أقنعة باستخدام المنطقة لإخفاء الزر في قائمة التحليل. انقر على الإحصاءات قناع واختيار الكائن تحت نطاق قناع.ثم قم بوضع علامة على شدة الوسط والتباين ضمن الميزات والكثافة. تصدير البيانات كملف نصي واستخدام تطبيق جدول البيانات لحساب درجات قطبية كل بكتيريا كنسبة بين التباين وكثافة المتوسط. بالنسبة للتطبيقات عالية الإنتاجية استخدام المجهر التباين الوجه للحصول على صور قناة مزدوجة.تأكد من اختيار مجالات الرؤية حيث يتم فصل البكتيريا بشكل كامل. بعد ذلك، ضبط تباين قناة الوجه للصورة إلى مستوى حيث تكون البكتيريا واضحة للعيان. افتح صورة القناة المزدوجة وافتح نافذة قناع القطعة.اضبط العتبة المناسبة، ثم قم بإزالة الكائنات الصغيرة بالنقر فوق الزر تعريف الكائنات وضبط الحد الأدنى للحجم إلى 100 بكسل. تحت قناع تنقية، حدد إزالة الكائنات حواف وأقنعة منفصلة من البكتيريا التي هي المتاخمة لبعضها البعض. لتحديد ديناميات البروتينات الانصهار، وفتح نافذة التقاط الصورة ووضع علامة على الفاصل الزمني.أدخل اثنين في عدد من نقاط الوقت مربع. الحصول على صورتين ناجحتين من الفيلق Pneumophila التعبير عن البروتين الفلورسنت من الفائدة. ضبط تباين الصورة حتى تظهر الخلايا بوضوح.ثم استخدم أداة المنطقة لوضع مربع 0.25 في 0.25 ميكرومتر في منتصف 400 خلية على الأقل. بعد ذلك، استخدم المنطقة لزر قناع في القائمة تحليل لإنشاء قناع من مربعات الفائدة. إنشاء قناع فارغ جديد واستخدام أداة بكسل لوضع علامة على منطقة الخلية بأكملها من 25 خلايا عشوائية على الأقل.إنشاء قناع آخر واستخدام أداة فرشاة كبيرة لوضع علامة على المناطق بين الخلايا. وأخيراً، حدد إحصائيات قناع وتأكد من تحديد الكائن تحت نطاق قناع واحد. تحت الميزات وكثافة، واختيار كثافة متوسط.تصدير البيانات وتكرار عملية قناع 2. بالنسبة إلى القناع 3، حدد القناع بالكامل ثم قم بتصدير شدة الوسط. لإعداد عينة التصوير المبرد الإلكترون، تنمو رقعة ثقيلة من الفيلق Pneumophila على لوحات CYE Agrastreptomisum لمدة 48 ساعة في 37 درجة مئوية.إعادة تعليق الخلايا في الماء إلى OD 600 من حوالي 0.7. ثم إضافة خمسة ميكرولترات من جزيئات الذهب الغروية إلى 20 ميكرولترات من تعليق الخلية. توهج تصريف شبكة الكربون حفرة وماصة خمسة ميكروليترس من خليط الخلية على ذلك.دعه يقف لدقيقة واحدة لطخة الشبكة مع ورقة مرشح وتجميده في الإيثان السائل باستخدام جهاز المكبس الجاذبية التي تحركها. بعد إدخال superfolder GFP في كروموسوميوم الفيوريلا الفيلقية، تم إجراء المجهر الخلية الحية لمقارنة إشارة الفلورسنت مع تلك التي من سلالة الوالدين فائقة GFP السلبية.وبالإضافة إلى ذلك، استخدم المجهر الميداني الساطع لفحص نسبة الخلايا التي تحتوي على إشارة فلورية محددة. فقط جزء صغير من الخلايا التي أنتجت DotB superfolder GFP عرض التعريب القطبي للبروتين الانصهار. عند توصيف توزيع إشارة الفلورسنت DotB ، وجد أن شدة المجلد الفائق من DotB في القطبين كانت أعلى مرتين من الدوسول.للتحقيق في ما إذا كان DotB superfolder GFP القطبي المحلي يعتمد على نظام إفراز من النوع الرابع مجمع بالكامل ، تم تحديد درجات القطبية من DotB superfolder GFP للخلايا الفردية في نوع البرية ، وفي نظام إفراز من النوع أربعة متحولة. في الواقع ، اختفت المواقع القطبية من DotB superfolder GFP عندما تم حذف نظام Dot / ICM. أشارت الأنماط الديناميكية إلى أن DotB ATPase كان موجودًا في مجموعة cytosolic ديناميكية وتم توظيفه في نظام إفرازات من النوع الأربعة في مرحلة متأخرة من التفاعل.تم استخدام عالية الإنتاجية cryo-ET لتصور نظام إفراز نوع أربعة سليمة في سلالة الفيلق Pneumophila التعبير عن DotB superfolder GFP. إعادة بناء الخلية كشفت العديد من آلات دوت / ICM جزءا لا يتجزأ من المغلف الخلية. كما تم تحديد الموقع العام لـ DotB وGFP فائقة المجلد فيما يتعلق بـ الجهاز نظام إفرازات من النوع الرابع.وأشار الاداءات سطح ثلاثي الأبعاد أن يتم وضع GFP فائقة المجلدات تحت الهيكسمر DotB، الذي يتجمع كقرص في قاعدة مجمع ATPase cytoplasmic. عند محاولة هذه التقنية، تأكد من تقييم استقرار البروتينات الانصهار وظيفة نظام إفراز العلامة قبل الشروع في الحصول على صورة. يمكن أن يكون وضع النماذج والملاءمة من الطرق الفعالة لتحليل الأنماط الديناميكية والكثافة الهيكلية وكذلك لتقييم التغيرات التكونية أو تحديد موضع الوحدات الفرعية في الهيكل.يمكن أن يساعد هذا النهج في فهم كيفية مختلف أنواع أربعة مكونات النظام السري وظيفة، وكيف تتفاعل داخل أكثر تعقيدا، وما هي وظائف subassemblies مختلفة تنفيذ.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Applying Live Cell Imaging and Cryo-Electron Tomography to Resolve Spatiotemporal Features of the Legionella pneumophila Dot/Icm Secretion System

Determination of Molecular Structures of HIV Envelope Glycoproteins using Cryo-Electron Tomography and Automated Sub-tomogram Averaging

تحديد الهياكل الجزيئية لفيروس نقص المناعة البشرية جليكوبروتينات مغلف باستخدام البرد الكترون والتصوير المقطعي الآلي متوسط ​​الفرعية صورة مقطعية

Since its discovery nearly 30 years ago, more than 60 million people have been infected with the human immunodeficiency virus (HIV) (www.usaid.gov). The ...

Use of an Optical Trap for Study of Host-Pathogen Interactions for Dynamic Live Cell Imaging

استخدام اعتراض البصرية لدراسة التفاعلات المرضي المضيف الحيوي للخلية الحية التصوير

Dynamic live cell imaging allows direct visualization of real-time interactions between cells of the immune system1, 2; however, the lack of spatial and ...

Real-time Live Imaging of T-cell Signaling Complex Formation

في الوقت الحقيقي تصوير لايف تي خلية اشارة تشكيل مجمع

Protection against infectious diseases is mediated by the immune system 1,2. T lymphocytes are the master coordinators of the immune system, regulating ...

Live Cell Imaging of Alphaherpes Virus Anterograde Transport and Spread

تصوير الخلايا الحية من الهربسي الألفائي الفيروسات النقل تقدمي وانتشارها

Advances in live cell fluorescence microscopy  techniques, as well as the construction of recombinant viral strains that  express fluorescent fusion ...

Use of Galleria mellonella as a Model Organism to Study Legionella pneumophila Infection

Use of Galleria mellonella as a Model Organism to Study Legionella pneumophila Infection

استخدام<em&gt; غاليريا mellonella</em&gt; كما كائن نموذج لدراسة<em&gt; البكتيريا المستروحة</em&gt; عدوى

Legionella pneumophila, the causative agent of a severe pneumonia named Legionnaires&#39; disease, is an important human pathogen that infects and ...

Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes

Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes

التصوير InlC إفراز المعنية بالتحقيق في العدوى البكتيرية الخلوية من قبل الممرض<em&gt; المستوحدة الليستيريا</em

Bacterial intracellular  pathogens can be conceived as molecular tools to dissect cellular signaling  cascades due to their capacity to exquisitely ...

Applying an Inducible Expression System to Study Interference of Bacterial Virulence Factors with Intracellular Signaling

تطبيق نظام التعبير محرض لدراسة التدخل من العوامل البكتيرية الفوعة مع اشارة بين الخلايا

The technique presented here allows one to analyze at which step a target protein, or alternatively a small molecule, interacts with the components of a ...

Legionella pneumophila Outer Membrane Vesicles: Isolation and Analysis of Their Pro-inflammatory Potential on Macrophages

Legionella pneumophila Outer Membrane Vesicles: Isolation and Analysis of Their Pro-inflammatory Potential on Macrophages

البكتيريا المستروحة الخارجي غشاء الحويصلات: عزل وتحليل إمكاناتهم الموالية للالتهابات في الضامة

Bacteria are able to secrete a variety of molecules via various secretory systems. Besides the secretion of molecules into the extracellular space or ...

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

نظام تغذية خالية رواية للإنتاج الضخم للخلايا القاتلة الطبيعية مورين في المختبر

Natural killer (NK) cells belong to the innate immune system and are a first-line anti-cancer immune defense; however, they are suppressed in the tumor ...

Isolation, Fixation, and Immunofluorescence Imaging of Mouse Adrenal Glands

العزلة، وتثبيت، وتصوير الفلورة الغدد الكظرية الماوس

Immunofluorescence is a well-established technique for detection of antigens in tissues with the employment of fluorochrome-conjugated antibodies and has ...