Name: applying live cell imaging and cryo-electron tomography to resolve spatiotemporal features of the legionella pneumophila dot/icm secretion system
Uploaded: 2020-03-10T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Applying Live Cell Imaging and Cryo-Electron Tomography to Resolve Spatiotemporal Features of the Legionella pneumophila Dot/Icm Secretion System at JoVE.com

D.C. og C.R.R. blev støttet af NIH (R37AI041699 og R21AI130671). D.P., B.H., og J.L blev støttet af National Institutes of Health (R01AI087946 og R01GM107629).

BEMÆRK: Alle procedurer, der omfatter vækst, manipulation og billeddannelse af L. pneumophila, bør udføres i et biologisk sikkerhedsniveau 2-laboratorium i overensstemmelse med lokale retningslinjer.
1. Indsættelse af sfGFP i L. pneumophila kromosom ved hjælp af allelic Exchange og dobbelt udvælgelsestrategi (Figur 2, Figur 3)
<ol><li>Klon ind i genudskiftningsvektoren pSR47S11 følge...

<ol>
	<li>Franco, I. S., Shuman, H. A., Charpentier, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+perplexing+functions+and+surprising+origins+of+Legionella+pneumophila+type+IV+secretion+effectors.">The perplexing functions and surprising origins of Legionella pneumophila type IV secretion effectors.</a> Cellular Microbiology. 11, 1435-1443 (2009).</li><li>Burstein, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-scale+identification+of+Legionella+pneumophila+effectors+using+a+machine+learning+approach.">Genome-scale identification of Legionella pneumophila effectors using a machine learning approach.</a> PLOS Pathogens. 5, 1000508 (2009).</li><li>Ninio, S., Roy, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effector+proteins+translocated+by+Legionella+pneumophila:+strength+in+numbers.">Effector proteins translocated by Legionella pneumophila: strength in numbers.</a> Trends in Microbiology. 15, 372-380 (2007).</li><li>Vogel, J. P., Andrews, H. L., Wong, S. K., Isberg, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conjugative+transfer+by+the+virulence+system+of+Legionella+pneumophila.">Conjugative transfer by the virulence system of Legionella pneumophila.</a> Science. 279, 873-876 (1998).</li><li>Isberg, R. R., O'Connor, T. J., Heidtman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Legionella+pneumophila+replication+vacuole:+making+a+cosy+niche+inside+host+cells.">The Legionella pneumophila replication vacuole: making a cosy niche inside host cells.</a> Nature Reviews Microbiology. 7, 13-24 (2009).</li><li>Roy, C. R., Berger, K. H., Isberg, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Legionella+pneumophila+DotA+protein+is+required+for+early+phagosome+trafficking+decisions+that+occur+within+min+of+bacterial+uptake.">Legionella pneumophila DotA protein is required for early phagosome trafficking decisions that occur within min of bacterial uptake.</a> Molecular Microbiology. 28, 663-674 (1998).</li><li>Archer, K. A., Roy, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MyD88-Dependent+Responses+Involving+Toll-Like+Receptor+2+Are+Important+for+Protection+and+Clearance+of+Legionella+pneumophila+in+a+Mouse+Model+of+Legionnaires'+Disease.">MyD88-Dependent Responses Involving Toll-Like Receptor 2 Are Important for Protection and Clearance of Legionella pneumophila in a Mouse Model of Legionnaires' Disease.</a> Infection and Immunity. 74, 3325-3333 (2006).</li><li>Nagai, H., Kubori, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+IVB+Secretion+Systems+of+Legionella+and+Other+Gram-Negative+Bacteria.">Type IVB Secretion Systems of Legionella and Other Gram-Negative Bacteria.</a> Frontiers in Microbiology. 2, 136 (2011).</li><li>Kubori, T., Nagai, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Type+IVB+secretion+system:+an+enigmatic+chimera.">The Type IVB secretion system: an enigmatic chimera.</a> Current Opinion in Microbiology. 29, 22-29 (2016).</li><li>Chetrit, D., Hu, B., Christie, P. J., Roy, C. R., Liu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+unique+cytoplasmic+ATPase+complex+defines+the+Legionella+pneumophila+type+IV+secretion+channel.">A unique cytoplasmic ATPase complex defines the Legionella pneumophila type IV secretion channel.</a> Nature Microbiology. 3, 678-686 (2018).</li><li>Merriam, J. J., Mathur, R., Maxfield-Boumil, R., Isberg, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+Legionella+pneumophila+fliI+gene:+intracellular+growth+of+a+defined+mutant+defective+for+flagellum+biosynthesis.">Analysis of the Legionella pneumophila fliI gene: intracellular growth of a defined mutant defective for flagellum biosynthesis.</a> Infection and Immunity. 65, 2497-2501 (1997).</li><li>Feeley, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Charcoal-yeast+extract+agar:+primary+isolation+medium+for+Legionella+pneumophila.">Charcoal-yeast extract agar: primary isolation medium for Legionella pneumophila.</a> Journal of Clinical Microbiology. 10, 437-441 (1979).</li><li>Andrews, H. L., Vogel, J. P., Isberg, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+linked+Legionella+pneumophila+genes+essential+for+intracellular+growth+and+evasion+of+the+endocytic+pathway.">Identification of linked Legionella pneumophila genes essential for intracellular growth and evasion of the endocytic pathway.</a> Infection and Immunity. 66, 950-958 (1998).</li><li>Morado, D. R., Hu, B., Liu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+Tomoauto:+A+Protocol+for+High-throughput+Automated+Cryo-electron+Tomography.">Using Tomoauto: A Protocol for High-throughput Automated Cryo-electron Tomography.</a> Journal of Visualized Experiments. (107), e53608 (2016).</li><li>Hu, B., Lara-Tejero, M., Kong, Q., Galan, J. E., Liu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Situ+Molecular+Architecture+of+the+Salmonella+Type+III+Secretion+Machine.">In Situ Molecular Architecture of the Salmonella Type III Secretion Machine.</a> Cell. 168, 1065-1074 (2017).</li><li>Mastronarde, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+electron+microscope+tomography+using+robust+prediction+of+specimen+movements.">Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements.</a> Journal of Structural Biology. 152, 36-51 (2005).</li><li>Zheng, S. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MotionCor2:+anisotropic+correction+of+beam-induced+motion+for+improved+cryo-electron+microscopy.">MotionCor2: anisotropic correction of beam-induced motion for improved cryo-electron microscopy.</a> Nature Methods. 14, 331-332 (2017).</li><li>Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computer+visualization+of+three-dimensional+image+data+using+IMOD.">Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD.</a> Journal of Structural Biology. 116, 71-76 (1996).</li><li>Gilbert, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Iterative+methods+for+the+three-dimensional+reconstruction+of+an+object+from+projections.">Iterative methods for the three-dimensional reconstruction of an object from projections.</a> Journal of Theoretical Biology. 36, 105-117 (1972).</li><li>Radermacher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Weighted+Back-projection+Methods.">Weighted Back-projection Methods.</a> Electron Tomography. , 245-273 (2007).</li><li>Winkler, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tomographic+subvolume+alignment+and+subvolume+classification+applied+to+myosin+V+and+SIV+envelope+spikes.">Tomographic subvolume alignment and subvolume classification applied to myosin V and SIV envelope spikes.</a> Journal of Structural Biology. 165, 64-77 (2009).</li><li>Winkler, H., Taylor, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+marker-free+alignment+with+simultaneous+geometry+determination+and+reconstruction+of+tilt+series+in+electron+tomography.">Accurate marker-free alignment with simultaneous geometry determination and reconstruction of tilt series in electron tomography.</a> Ultramicroscopy. 106, 240-254 (2006).</li><li>Prevost, M. S., Waksman, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-ray+crystal+structures+of+the+type+IVb+secretion+system+DotB+ATPases.">X-ray crystal structures of the type IVb secretion system DotB ATPases.</a> Protein Science. 27, 1464-1475 (2018).</li><li>Miklos, G. L., Rubin, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+the+genome+project+in+determining+gene+function:+insights+from+model+organisms.">The role of the genome project in determining gene function: insights from model organisms.</a> Cell. 86, 521-529 (1996).</li><li>Reyrat, J. M., Pelicic, V., Gicquel, B., Rappuoli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Counterselectable+markers:+untapped+tools+for+bacterial+genetics+and+pathogenesis.">Counterselectable markers: untapped tools for bacterial genetics and pathogenesis.</a> Infection and Immunity. 66, 4011-4017 (1998).</li><li>Yu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Molecule+Studies+in+Live+Cells.">Single-Molecule Studies in Live Cells.</a> Annual Review of Physical Chemistry. 67, 565-585 (2016).</li><li>Stewart, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-electron+microscopy+and+cryo-electron+tomography+of+nanoparticles.">Cryo-electron microscopy and cryo-electron tomography of nanoparticles.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: Nanomedicine and Nanobiotechnology. 9, (2017).</li></ol>

Belysning af funktioner bakterielsekredionssystemer er nøglen til en fuldstændig forståelse af værts-patogen interaktioner. Sekretionssystemer er komplekse maskiner, der kan indsprøjte effektorer proteiner i værtsceller, og i nogle tilfælde fremme etableringen af en subcellulær niche, der understøtter bakteriel replikation. Ovenstående metode giver vigtige nye værktøjer til at studere Dot / Icm sekresion system af respiratoriske bakterielpatogenLegionella pneumophila, giver fingerpeg om mekanismerne ...

Legionella pneumophila (L. pneumophila), det ætiologiske agens af legionærsyge' sygdom, lever ferskvandsreservoirer, hvor bakterierne formerer sig ved at inficere og replikere i akvatisk frisvømning protozoer. L. pneumophila forårsager sygdomsudbrud hos mennesker, når indånding af aerosoliserede bakterier fra drikkevandskilder forekommer. I inficerede celler, subversion af vært veje tillader L. pneumophila at forsinke endocytisk modning af vacuole, hvor det er bosat, og at fremme biogenese af en cellulær rum, der understøtter bakteriel replikation. Denne proces er drevet af en specialiseret bakteriel type IVB sekretion system (T4BSS) kendt som Dot / Icm og dens repertoire af over 300 "effektor" proteiner, der er omlagt til værten cytosol under infektion for at lette manipulation af cellulære funktioner1,2,3,4,5. Mutanter, der mangler et funktionelt Dot/Icm-apparat, leverer ikke effektorer ind i værtscytosolen, er defekte for intracellulær replikering og er avirulente i dyremodeller af sygdom6,7.
Mange bakteriearter har udviklet ekstremt komplekse og dynamiske multikomponentmaskiner, der er nødvendige for infektionsprocesser. Andre T4BSS som Dot / Icm systemet er også afgørende for intracellulære replikering af bakterielle patogener såsom Coxiella burnetii og Rickettsiella grylli. Selvom T4BSS er evolutionært relateret til prototypiske type IVA-systemer, som mægle DNA-overførsel og kan levere et begrænset repertoire af effektorproteiner, har Dot/Icm-systemet næsten dobbelt så mange maskinkomponenter og leverer en bred vifte af effektorer. Formentlig, denne udvidelse i antallet af komponenter har gjort det muligt for Dot / Icm apparat til at rumme og integrere nye effektorer let8,9.
Vi har for nylig brugt kryoelektron tomografi (kryo-ET) til at løse strukturen af Dot / Icm apparat in situ og viste, at det danner en celle kuvert-spænder kanal, der forbinder til en cytoplasmatisk kompleks. Yderligere analyse viste, at den cytosolic ATPase DotB forbinder med Dot / Icm systemet på L. pneumophila cellepol gennem interaktioner med den cytosolic ATPase DotO. Vi har opdaget, at DotB viser en cytosolic bevægelse i de fleste bakterieceller, hvilket indikerer, at denne ATPase er til stede i en dynamisk cytosolic befolkning, men også forbinder med polar Dot / Icm komplekser. Desuden danner DotO en hexameric samling af DotO dimers forbundet med den indre membran kompleks, og en DotB hexamer slutter sig til bunden af denne cytoplasmatiske kompleks. Samlingen af DotB-DotO-energikomplekset skaber en cytoplasmatisk kanal , der leder omplantningen af substrater gennem T4SS (Figur 1)10.
På trods af disse nylige fremskridt vides der ikke meget om, hvordan Dot/Icm-systemet fungerer, og hvordan hvert protein samles for at danne et aktivt apparat8. Afdækning af de lovgivningsmæssige kredsløb i Dot/Icm T4SS er afgørende for at forstå de molekylære mekanismer i værtspatogeninteraktioner. Derfor diskuterer vi, hvordan man bruger levende celle mikroskopi og kryo-ET til at opdage og karakterisere væsentlige L. pneumophila Dot / Icm systemkomponenter, der er mærket med super-mappe GFP (sfGFP). Ved hjælp af kvantitativ fluorescensmikroskopi defineres den polære lokalisering af DotB i en vild typebaggrund, eller når type IV-systemet slettes. Time-lapse mikroskopi vil blive brugt til at kvantificere forskelle i lokalisering og dynamik mellem Dot / Icm cytosolic ATPases.
Den kombinerede anvendelse af to komplementære tilgange såsom levende billeddannelse og kryo-ET giver en fordel i forhold til andre in vitro-systemer. Begge metoder udføres i intakte celler og bevarer det naturlige miljø i T4BSS, hvilket minimerer afbrydelse af den oprindelige struktur under prøveforberedelse. Da overekspression af proteiner kan forringe sekretreapparatets stoichiometri, returneres sfGFP-fusionerne via allelicudveksling til Legionella-kromosomet, så hver fusion kokodes i enkelt eksemplar, og udtrykket drives af den endogene promotor. Visualisering af kromosom-kodede fusioner gør det muligt at kvantificere det nøjagtige proteinniveau, der udtrykkes på et bestemt tidspunkt. Cryo-ET har også mange fordele ved at bestemme strukturen af sekresionsystemer. Den mest bemærkelsesværdige fordel er, at kryo-ET prøver består af frosne intakte celler, der bevarer indfødte komplekser i forbindelse med bakteriel celle arkitektur. Kryo-ET kan derfor være at foretrække frem for biokemiske rensningsmetoder, som udtrækker membrankomplekser og kan fjerne perifere proteiner fra kerneapparatet eller ændre den overordnede struktur. Hertil kommer, mærkning et protein af interesse med en voluminøs protein såsom sfGFP tilføjer en masse, der kan påvises ved cryo-ET og kan hjælpe med kortlægning af de forskellige subkomplekser af Dot / Icm apparat på strukturen opnået ved cryo-ET.
Denne tilgang er et kraftfuldt værktøj til at afdække strukturelle oplysninger om multimolekylære komplekser, der samles i bakteriecellemembranen. Fortolkningen af strukturer belyst ved hjælp af disse teknikker vil hjælpe området med at forstå, hvordan T4BSS-komponenter fungerer, hvorfor der kræves så mange komponenter til funktion, hvordan komponenterne interagerer inden for de større komplekse, og hvilke funktioner disse underenheder udføre.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 nm colloidal gold particles</td>
			<td>Aurion</td>
			<td>25486</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100x Plan Apo objective (1.4 NA)</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Activated charcoal</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C5510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agaroze GPG/LMP, low melt</td>
			<td>American bioanalytical</td>
			<td>AB00981</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto dehydrated agar</td>
			<td>BD</td>
			<td>214010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoolSNAP EZ 20 MHz digital monochrome camera</td>
			<td>Photometrics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gene Frame, 1.7x2.8 cm, 125 &#181;L</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AB-0578</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Holey Carbon grid R 2/1 Cu 200 mesh</td>
			<td>Quantifoil</td>
			<td>Q225-CR1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iron(III) nitrate nonahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>216828</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2 Summit camera for cryo-EM</td>
			<td>GATAN</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Cysteine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C7352</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope cover slides 22x22 mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-542B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope cover slides 24x50 mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-545K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides 25x75x1 mm</td>
			<td>Globe Scientific</td>
			<td>1380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SlideBook 6.0</td>
			<td>Intelligent Imaging Innovations</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectra X light engine</td>
			<td>Lumencor</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq 2X Master Mix</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>M0270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Titan Krios</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract</td>
			<td>BD</td>
			<td>212750</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

applying live cell imaging and cryo-electron tomography to resolve spatiotemporal features of the legionella pneumophila dot/icm secretion system

Dot/Icm sekresionssystemet af Legionella pneumophila er et komplekst type IV sekredionssystem (T4SS) nanomaskine, der lokaliserer på bakteriestangen og formidler leveringen af protein og DNA-substrater til at målrette celler, en proces, der generelt kræver direkte celle-til-celle kontakt. Vi har for nylig løst strukturen af Dot / Icm apparat ved kryo-elektron tomografi (cryo-ET) og viste, at det danner en celle kuvert-spænder kanal, der forbinder til en cytoplasmatisk kompleks. Anvendelse af to komplementære tilgange, der bevarer den oprindelige struktur af prøven, fluorescerende mikroskopi i levende celler og cryo-ET, giver mulighed for in situ visualisering af proteiner og assimilering af stoichiometri og timing en produktion af hver maskine komponent i forhold til andre Dot / Icm underenheder. For at undersøge kravene til polar positionering og til at karakterisere dynamiske funktioner forbundet med T4SS maskine biogenese, har vi smeltet et gen kodning superfolder grøn fluorescerende protein til Dot / Icm ATPase gener på deres indfødte positioner på kromosomet. Følgende metode integrerer kvantitativ fluorescensmikroskopi af levende celler og kryo-ET for at kvantificere polarlokalisering, dynamik og struktur af disse proteiner i intakte bakterieceller. Anvendelse af disse tilgange til at studere Legionella pneumophila T4SS er nyttigt for at karakterisere funktionen af Dot / Icm systemet og kan tilpasses til at studere en bred vifte af bakterielle patogener, der udnytter T4SS eller andre typer af bakteriel sekresion komplekser.

Homolog rekombination med dobbelt valg i to trin blev brugt til at konstruere den definerede indsættelse af sfGFP. I det første skridt, triparental parring blev udført, hvor pRK600 konjugativ plasmid (en IncP plasmid) fra E. coli hjælper stamme MT616 blev mobiliseret til donor E. coli stamme med selvmord vektor pSR47S indeholder sfGFP genflankeret af de to homologe regioner, oprindelsen af overførsel oriT og Bacillus subtilevalg modudvælgelse gensacB. Dernæst blev konjugeringssy...

Watch this Scientific Journal Video about Applying Live Cell Imaging and Cryo-Electron Tomography to Resolve Spatiotemporal Features of the Legionella pneumophila Dot/Icm Secretion System at JoVE.com

Applying Live Cell Imaging and Cryo-Electron Tomography to Resolve Spatiotemporal Features of the Legionella pneumophila Dot/Icm Secretion System

Billeddannelse af bakterieceller er en ny systembiologitilgang, der fokuserer på at definere statiske og dynamiske processer, der dikterer funktionen af store makromolekylære maskiner. Her er integration af kvantitative levende celle imaging og kryo-elektron tomografi bruges til at studere Legionella pneumophila type IV sekresion system arkitektur og funktioner.

Anvendelse af Live Cell Imaging og Cryo-Electron Tomography at løse Spatiotemporal Funktioner i Legionella pneumophila Dot / Icm Sekresion System

The Dot/Icm secretion system of Legionella pneumophila is a complex type IV secretion system (T4SS) nanomachine that localizes at the bacterial pole and ...

Denne protokol er nyttig til at karakterisere de samlende funktioner bakteriel sekretion komplekser og kan føre til en grundlæggende forståelse af de molekylære mekanismer, der er nødvendige for vært patogen interaktioner. Denne teknik integrerer komplementære tilgange, der bevarer prøvens oprindelige struktur og tillader og ser til visualisering af proteiner komplekser i intakte bakterieceller. Det øger vores forståelse af de strukturelle funktion relationer bakteriel sekretion systemer.Denne metode kan tilpasses til at studere andre typer af sekretion systemer eller andre cellulære komplekser i en bred vifte af bakteriearter. Start med at lave agarose puder til levende celle billeddannelse. Forbered omkring 30 ml 1% lav smelte agarose opløsning i vand og mikrobølgeovn det i en glaskolbe i ca 90 sekunder hvirvlende det lejlighedsvis, indtil agarose er helt opløst.Placer to 22 gange 22 af 0,15 mm glasdias på kanten af en 25 gange 75 gange 1,1 mm glas slide den ene oven på den anden. Stable to mere af de mindre dias på den anden kant. Pipette omkring 1 ml af den smeltede agarose ind i midten dias mellem de to øverste glas dias og placere en anden stor rutsjebane på toppen af smeltet agarose og sørg for at undgå dannelse af luftbobler.Cool dias ved fire grader celsius i 15 minutter derefter bruge en skalpel eller barberblad til forsigtigt at skære puden i små firkanter. Fastgør en dobbeltklæbende ramme på en 25 gange 75 gange 1,1 mm glasrutsjebane, og ansrette flere puder på sliden. Opløs en tung plet legionella Pneumophila i 1 ml dobbeltdestilleret vand.Så vortex og pipette to til tre mikroliter af fortynding på puder. Anstæn skal forsigtigt placere en 58 gange 24 gange 0,15 mm dækselsslip over selvklæbende ramme. Vælg celler til billedbehandling ved hjælp af lys feltbelysning.Derefter, i capture vinduet af mikroskopets software, Juster ND til 180 og binning til to af to. Brug 488 nanometerkanalen til at eksponere prøven i 500 til 1000 millisekunder og valider fluorescensens specificitet ved at aflyse ukodet Legionella Pneumophila med de samme parametre. For at kvantificere polariteten skal du justere billedkontrasten, så bakterierne er tydeligt synlige.Zoom derefter ind på området af interesse og bruge regionen værktøj til at placere en 0,25 af 1,3 mikrometer rektangel starter ved stangen og strækker sig ind i cytoplasmaet og sørg for, at rektanglet forbliver inden for de bakterielle grænser. Marker mindst 200 bakterier, og opret masker ved at bruge knappen område til at maskere i analysemenuen. Klik på maskestatistik, og vælg objekt under maskeområdet.Marker derefter middelintensitet og varians under funktioner og intensitet. Eksportér dataene som en tekstfil, og brug regnearksprogrammet til at beregne polaritetsscoren for hver bakterie som forholdet mellem variansen og gennemsnitsintensiteten. Til programmer med højt overførselshastighed skal du bruge ansigtskontrastmikroskopi til at anskaffe dual channel-billeder.Sørg for at vælge synsfelter, hvor bakterierne er fuldt adskilt. Juster derefter billedets kontrast til ansigtskanalen til et niveau, hvor bakterierne er tydeligt synlige. Åbn billedet med to kanaler, og start vinduet opret segmentmaske.Juster den relevante tærskel, og fjern derefter de små objekter ved at klikke på knappen Definer objekter og justere minimumstørrelsen til 100 pixel. Under forfine maske skal du markere fjerne kanter objekter og separate masker af bakterier, der støder op til hinanden. For at kvantificere dynamikken i fusionsproteinerne skal du åbne billedoptagelsesvinduet og markere tidsforfald.Skriv to i feltet Antal tidspunkter. Erhverve to vellykkede billeder af Legionella Pneumophila udtrykke fluorescerende protein af interesse. Juster billedkontrasten, indtil cellerne er tydeligt synlige.Brug derefter områdeværktøjet til at placere en 0,25 gange 0,25 mikrometerplads midt i mindst 400 celler. Brug derefter knappen Område til at maskere i analysemenuen for at oprette en maske af de interessepunkter, der er. Opret en ny tom maske, og brug pixelværktøjet til at markere hele celleområdet på mindst 25 tilfældige celler.Opret en anden maske, og brug det store penselværktøj til at markere områder mellem cellerne. Endelig skal du vælge maskestatistik og sørge for, at objektet er markeret under maskeområde for maske et. Vælg middelintensitet under funktioner og intensitet.Eksportér dataene, og gentag processen for maske 2. For maske 3 skal du markere hele masken og eksportere middelintensiteten. For at forberede elektron kryotomografi prøve, vokse en tung patch af Legionella Pneumophila på CYE Agrastreptomisum plader i 48 timer ved 37 grader Celsius.Opspræn dine celler i vand til en OD 600 på ca. 0,7. Derefter tilsættes fem mikroliter af kolloide guldpartikler til 20 mikroliter af cellesuspensionen. Glow udledning en holey carbon grid og pipette fem mikroliter af cellen blandingen på det.Lad det stå et minut. Blot gitteret med filterpapir og fryse det i flydende ethan ved hjælp af en tyngdekraft-drevet stempel apparat. Efter indsættelse af superfolder GFP i Legionella Pneumophila kromosom, levende celle fluorescerende mikroskopi blev udført for at sammenligne fluorescerende signal med forældrenes superfolder GFP negativ stamme.Desuden blev der anvendt lys feltmikroskopi til at undersøge andelen af celler med et specifikt lysstofrør. Kun en brøkdel af de celler, der producerede DotB superfolder GFP viste polar lokalisering af fusion protein. Ved karakterisering af fordelingen af DotB fluorescerende signal, blev det konstateret, at intensiteten af DotB supermappe GFP på polerne var omkring to gange højere end i cytosol.For at undersøge, om DotB superfolder GFP polar lokalisering var afhængig af en fuldt samlet type fire sekretion system, polaritet score af DotB superfolder GFP blev bestemt for de enkelte celler i en vild type, og i en type fire sekretion system mutant. Polarpositionering af DotB superfolder GFP forsvandt, da Dot/ICM-systemet blev slettet. Dynamiske mønstre viste, at DotB ATPase var til stede i en dynamisk cyklisk befolkning og blev rekrutteret til den polariserede lokaliserede Dot / ICM type fire sekretion system på et sent tidspunkt samling reaktion.High throughput cryo-ET blev brugt til at visualisere den intakte type fire sekretion system apparat i en Legionella Pneumophila stamme udtrykke DotB supermappe GFP. Rekonstruktion af cellen afslørede flere Dot / ICM maskiner indlejret i cellen kuvert. Den overordnede placering af DotB og superfolder GFP i forhold til den intakte type fire sekretion system maskine blev også fastlagt.Tredimensionelle overfladegengivelser indikerede, at superfolder-GFP er placeret under DotB-hexameren, der samles som en skive i bunden af det cytoplasmatiske ATPase-kompleks. Når du forsøger denne teknik, sørg for at vurdere stabiliteten af fusion proteiner og funktionaliteten af tag sekretion system, før du fortsætter til billederhvervelse. Modellering og tilpasning kan være effektive måder at analysere de dynamiske mønstre og strukturelle tætheder samt til evaluering af konformationelle ændringer eller lokalisering af underenheder i strukturen.Denne fremgangsmåde kan hjælpe med at forstå, hvordan forskellige type fire hemmelige systemkomponenter fungerer, hvordan de interagerer inden for de større komplekse, og hvilke funktioner forskellige underenheder udfører.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Applying Live Cell Imaging and Cryo-Electron Tomography to Resolve Spatiotemporal Features of the Legionella pneumophila Dot/Icm Secretion System

Determination of Molecular Structures of HIV Envelope Glycoproteins using Cryo-Electron Tomography and Automated Sub-tomogram Averaging

Bestemmelse af molekylære strukturer af HIV Konvolut glycoproteiner med Cryo-Electron Tomography og Automatiseret Sub-tomogram Gennemsnitsberegnings

Since its discovery nearly 30 years ago, more than 60 million people have been infected with the human immunodeficiency virus (HIV) (www.usaid.gov). The ...

Use of an Optical Trap for Study of Host-Pathogen Interactions for Dynamic Live Cell Imaging

Dynamic live cell imaging allows direct visualization of real-time interactions between cells of the immune system1, 2; however, the lack of spatial and ...

Real-time Live Imaging of T-cell Signaling Complex Formation

Real-time Live Imaging af T-celle signalering Complex Formation

Protection against infectious diseases is mediated by the immune system 1,2. T lymphocytes are the master coordinators of the immune system, regulating ...

Live Cell Imaging of Alphaherpes Virus Anterograde Transport and Spread

Levende Cell Imaging af Alphaherpes Virus Anterograd Transport og Spread

Advances in live cell fluorescence microscopy  techniques, as well as the construction of recombinant viral strains that  express fluorescent fusion ...

Use of Galleria mellonella as a Model Organism to Study Legionella pneumophila Infection

Use of Galleria mellonella as a Model Organism to Study Legionella pneumophila Infection

Anvendelse af<em&gt; Galleria mellonella</em&gt; Som en model organisme til at studere<em&gt; Legionella pneumophila</em&gt; Infektion

Legionella pneumophila, the causative agent of a severe pneumonia named Legionnaires&#39; disease, is an important human pathogen that infects and ...

Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes

Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes

Imaging inlc Sekretion at undersøge Cellular Infektion med bakteriepatogen<em&gt; Listeria monocytogenes</em

Bacterial intracellular  pathogens can be conceived as molecular tools to dissect cellular signaling  cascades due to their capacity to exquisitely ...

Applying an Inducible Expression System to Study Interference of Bacterial Virulence Factors with Intracellular Signaling

Anvende en Inducerbar Expression System til Studieinformationen Interferens med bakteriel virulensfaktorer med intracellulær signalering

The technique presented here allows one to analyze at which step a target protein, or alternatively a small molecule, interacts with the components of a ...

Legionella pneumophila Outer Membrane Vesicles: Isolation and Analysis of Their Pro-inflammatory Potential on Macrophages

Legionella pneumophila Outer Membrane Vesicles: Isolation and Analysis of Their Pro-inflammatory Potential on Macrophages

Legionella pneumophila ydermembranvesikler: Isolering og analyse af deres pro-inflammatorisk potentiale på makrofager

Bacteria are able to secrete a variety of molecules via various secretory systems. Besides the secretion of molecules into the extracellular space or ...

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

En roman Feeder-fri ordning for masseproduktion af Murine naturlige dræberceller In Vitro

Natural killer (NK) cells belong to the innate immune system and are a first-line anti-cancer immune defense; however, they are suppressed in the tumor ...

Isolation, Fixation, and Immunofluorescence Imaging of Mouse Adrenal Glands

Isolation, fiksering og immunfluorescens billeddannelse af musen binyrerne

Immunofluorescence is a well-established technique for detection of antigens in tissues with the employment of fluorochrome-conjugated antibodies and has ...