Name: applying live cell imaging and cryo-electron tomography to resolve spatiotemporal features of the legionella pneumophila dot/icm secretion system
Uploaded: 2020-03-10T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Applying Live Cell Imaging and Cryo-Electron Tomography to Resolve Spatiotemporal Features of the Legionella pneumophila Dot/Icm Secretion System at JoVE.com

D.C. en C.R.R. werden ondersteund door de NIH (R37AI041699 en R21AI130671). D.P., B.H., en J.L. werden ondersteund door de National Institutes of Health (R01AI087946 en R01GM107629).

OPMERKING: Alle procedures met betrekking tot de groei, manipulatie en beeldvorming van L. pneumophila moeten worden uitgevoerd in een laboratorium op biologisch veiligheidsniveau 2, conform de lokale richtlijnen.
1. Inbrengen van sfGFP in L. pneumophila-chromosoom met allelic exchange en double selection strategie(figuur 2, figuur 3)
<ol><li>Kloon in de genvervangende vector pSR47S11 de vol...

<ol>
	<li>Franco, I. S., Shuman, H. A., Charpentier, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+perplexing+functions+and+surprising+origins+of+Legionella+pneumophila+type+IV+secretion+effectors.">The perplexing functions and surprising origins of Legionella pneumophila type IV secretion effectors.</a> Cellular Microbiology. 11, 1435-1443 (2009).</li><li>Burstein, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-scale+identification+of+Legionella+pneumophila+effectors+using+a+machine+learning+approach.">Genome-scale identification of Legionella pneumophila effectors using a machine learning approach.</a> PLOS Pathogens. 5, 1000508 (2009).</li><li>Ninio, S., Roy, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effector+proteins+translocated+by+Legionella+pneumophila:+strength+in+numbers.">Effector proteins translocated by Legionella pneumophila: strength in numbers.</a> Trends in Microbiology. 15, 372-380 (2007).</li><li>Vogel, J. P., Andrews, H. L., Wong, S. K., Isberg, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conjugative+transfer+by+the+virulence+system+of+Legionella+pneumophila.">Conjugative transfer by the virulence system of Legionella pneumophila.</a> Science. 279, 873-876 (1998).</li><li>Isberg, R. R., O'Connor, T. J., Heidtman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Legionella+pneumophila+replication+vacuole:+making+a+cosy+niche+inside+host+cells.">The Legionella pneumophila replication vacuole: making a cosy niche inside host cells.</a> Nature Reviews Microbiology. 7, 13-24 (2009).</li><li>Roy, C. R., Berger, K. H., Isberg, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Legionella+pneumophila+DotA+protein+is+required+for+early+phagosome+trafficking+decisions+that+occur+within+min+of+bacterial+uptake.">Legionella pneumophila DotA protein is required for early phagosome trafficking decisions that occur within min of bacterial uptake.</a> Molecular Microbiology. 28, 663-674 (1998).</li><li>Archer, K. A., Roy, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MyD88-Dependent+Responses+Involving+Toll-Like+Receptor+2+Are+Important+for+Protection+and+Clearance+of+Legionella+pneumophila+in+a+Mouse+Model+of+Legionnaires'+Disease.">MyD88-Dependent Responses Involving Toll-Like Receptor 2 Are Important for Protection and Clearance of Legionella pneumophila in a Mouse Model of Legionnaires' Disease.</a> Infection and Immunity. 74, 3325-3333 (2006).</li><li>Nagai, H., Kubori, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+IVB+Secretion+Systems+of+Legionella+and+Other+Gram-Negative+Bacteria.">Type IVB Secretion Systems of Legionella and Other Gram-Negative Bacteria.</a> Frontiers in Microbiology. 2, 136 (2011).</li><li>Kubori, T., Nagai, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Type+IVB+secretion+system:+an+enigmatic+chimera.">The Type IVB secretion system: an enigmatic chimera.</a> Current Opinion in Microbiology. 29, 22-29 (2016).</li><li>Chetrit, D., Hu, B., Christie, P. J., Roy, C. R., Liu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+unique+cytoplasmic+ATPase+complex+defines+the+Legionella+pneumophila+type+IV+secretion+channel.">A unique cytoplasmic ATPase complex defines the Legionella pneumophila type IV secretion channel.</a> Nature Microbiology. 3, 678-686 (2018).</li><li>Merriam, J. J., Mathur, R., Maxfield-Boumil, R., Isberg, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+Legionella+pneumophila+fliI+gene:+intracellular+growth+of+a+defined+mutant+defective+for+flagellum+biosynthesis.">Analysis of the Legionella pneumophila fliI gene: intracellular growth of a defined mutant defective for flagellum biosynthesis.</a> Infection and Immunity. 65, 2497-2501 (1997).</li><li>Feeley, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Charcoal-yeast+extract+agar:+primary+isolation+medium+for+Legionella+pneumophila.">Charcoal-yeast extract agar: primary isolation medium for Legionella pneumophila.</a> Journal of Clinical Microbiology. 10, 437-441 (1979).</li><li>Andrews, H. L., Vogel, J. P., Isberg, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+linked+Legionella+pneumophila+genes+essential+for+intracellular+growth+and+evasion+of+the+endocytic+pathway.">Identification of linked Legionella pneumophila genes essential for intracellular growth and evasion of the endocytic pathway.</a> Infection and Immunity. 66, 950-958 (1998).</li><li>Morado, D. R., Hu, B., Liu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+Tomoauto:+A+Protocol+for+High-throughput+Automated+Cryo-electron+Tomography.">Using Tomoauto: A Protocol for High-throughput Automated Cryo-electron Tomography.</a> Journal of Visualized Experiments. (107), e53608 (2016).</li><li>Hu, B., Lara-Tejero, M., Kong, Q., Galan, J. E., Liu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Situ+Molecular+Architecture+of+the+Salmonella+Type+III+Secretion+Machine.">In Situ Molecular Architecture of the Salmonella Type III Secretion Machine.</a> Cell. 168, 1065-1074 (2017).</li><li>Mastronarde, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+electron+microscope+tomography+using+robust+prediction+of+specimen+movements.">Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements.</a> Journal of Structural Biology. 152, 36-51 (2005).</li><li>Zheng, S. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MotionCor2:+anisotropic+correction+of+beam-induced+motion+for+improved+cryo-electron+microscopy.">MotionCor2: anisotropic correction of beam-induced motion for improved cryo-electron microscopy.</a> Nature Methods. 14, 331-332 (2017).</li><li>Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computer+visualization+of+three-dimensional+image+data+using+IMOD.">Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD.</a> Journal of Structural Biology. 116, 71-76 (1996).</li><li>Gilbert, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Iterative+methods+for+the+three-dimensional+reconstruction+of+an+object+from+projections.">Iterative methods for the three-dimensional reconstruction of an object from projections.</a> Journal of Theoretical Biology. 36, 105-117 (1972).</li><li>Radermacher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Weighted+Back-projection+Methods.">Weighted Back-projection Methods.</a> Electron Tomography. , 245-273 (2007).</li><li>Winkler, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tomographic+subvolume+alignment+and+subvolume+classification+applied+to+myosin+V+and+SIV+envelope+spikes.">Tomographic subvolume alignment and subvolume classification applied to myosin V and SIV envelope spikes.</a> Journal of Structural Biology. 165, 64-77 (2009).</li><li>Winkler, H., Taylor, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+marker-free+alignment+with+simultaneous+geometry+determination+and+reconstruction+of+tilt+series+in+electron+tomography.">Accurate marker-free alignment with simultaneous geometry determination and reconstruction of tilt series in electron tomography.</a> Ultramicroscopy. 106, 240-254 (2006).</li><li>Prevost, M. S., Waksman, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-ray+crystal+structures+of+the+type+IVb+secretion+system+DotB+ATPases.">X-ray crystal structures of the type IVb secretion system DotB ATPases.</a> Protein Science. 27, 1464-1475 (2018).</li><li>Miklos, G. L., Rubin, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+the+genome+project+in+determining+gene+function:+insights+from+model+organisms.">The role of the genome project in determining gene function: insights from model organisms.</a> Cell. 86, 521-529 (1996).</li><li>Reyrat, J. M., Pelicic, V., Gicquel, B., Rappuoli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Counterselectable+markers:+untapped+tools+for+bacterial+genetics+and+pathogenesis.">Counterselectable markers: untapped tools for bacterial genetics and pathogenesis.</a> Infection and Immunity. 66, 4011-4017 (1998).</li><li>Yu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Molecule+Studies+in+Live+Cells.">Single-Molecule Studies in Live Cells.</a> Annual Review of Physical Chemistry. 67, 565-585 (2016).</li><li>Stewart, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-electron+microscopy+and+cryo-electron+tomography+of+nanoparticles.">Cryo-electron microscopy and cryo-electron tomography of nanoparticles.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: Nanomedicine and Nanobiotechnology. 9, (2017).</li></ol>

Het verduidelijken van de functies van bacteriële afscheidingssystemen is de sleutel tot een volledig begrip van host-pathogene interacties. Secretiesystemen zijn complexe machines die effectoreneiwitten in gastheercellen kunnen injecteren en in sommige gevallen de oprichting van een subcellulaire niche bevorderen die bacteriële replicatie ondersteunt. De bovenstaande methode biedt belangrijke nieuwe instrumenten voor het bestuderen van de Dot / Icm afscheidingsysteem van de respiratoire bacteriële pathogene Legio...

Legionella pneumophila (L. pneumophila), de etiologische agent van legionairs ziekte, woont zoetwaterreservoirs, waar de bacteriën zich voortplanten door te infecteren en te repliceren in aquatische vrijzwemmen protozoa. L. pneumophila veroorzaakt ziekte-uitbraken bij de mens wanneer inademing van aerosolized bacteriën uit drinkbare waterbronnen optreedt. In geïnfecteerde cellen, subversie van gastheer trajecten kan L. pneumophila te vertragen endocytische rijping van de vacuole waarin het zich bevindt en biogenese van een cellulair compartiment dat bacteriële replicatie ondersteunt bevorderen. Dit proces wordt aangedreven door een gespecialiseerd bacterieel type IVB secretie systeem (T4BSS) bekend als Dot / Icm en het repertoire van meer dan 300 "effector" eiwitten die worden overgedragen in de gastheer cytosol tijdens infectie te vergemakkelijken manipulatie van cellulaire functies1,2,3,4,5. Mutanten die geen functioneel Dot/Icm-apparaat hebben, leveren geen effectoren in de gastheercytosol, zijn defect voor intracellulaire replicatie en zijn avirulent in diermodellen van ziekte6,7.
Veel bacteriële soorten hebben extreem complexe en dynamische multicomponent machines ontwikkeld die nodig zijn voor infectieprocessen. Andere T4BSS zoals de Dot / Icm systeem zijn ook essentieel voor intracellulaire replicatie van bacteriële pathogenen zoals Coxiella burnetii en Rickettsiella grylli. Hoewel T4BSS evolutionair verwant zijn aan prototypische IVA-systemen, die DNA-overdracht bemiddelen en een beperkt repertoire van effectoreiwitten kunnen leveren, heeft het Dot/Icm-systeem bijna twee keer zoveel machinecomponenten en levert het een breed scala aan effectoren. Vermoedelijk heeft deze uitbreiding van het aantal componenten het Dot/Icm-apparaat in staatgesteld om gemakkelijk8,9nieuwe effectoren op te vangen en te integreren.
We hebben onlangs cryo-elektronentomografie (cryo-ET) gebruikt om de structuur van het Dot/Icm-apparaat in situ op te lossen en toonden aan dat het een cel-overloopkanaal vormt dat verbinding maakt met een cytoplasma-complex. Verdere analyse toonde aan dat de cytosolic ATPase DotB associeert met het Dot/Icm systeem op de L. pneumophila celpool door middel van interacties met de cytosolic ATPase DotO. We hebben ontdekt dat DotB een cytosoieke beweging vertoont in de meeste bacteriële cellen, wat aangeeft dat deze ATPase aanwezig is in een dynamische cytosoieke populatie, maar ook associeert met de polaire Dot/Icm complexen. Daarnaast vormt DotO een hexameric assemblage van DotO dimers geassocieerd met het binnenste membraan complex, en een DotB hexamer sluit zich aan bij de basis van dit cytoplasmacomplex. De assemblage van het energiecomplex DotB-DotO creëert een cytoplasmathermisch kanaal dat de translocatie van substraten door de T4SS(figuur 1)10leidt.
Ondanks deze recente vooruitgang is er weinig bekend over hoe het Dot/Icm-systeem functioneert en hoe elk eiwit samenkomt om een actief apparaat te vormen8. Het blootleggen van de regelgevingscircuits van de Dot/Icm T4SS is van fundamenteel belang voor het begrijpen van de moleculaire mechanismen van host-pathogene interacties. Daarom bespreken we hoe we live celmicroscopie en cryo-ET kunnen gebruiken om essentiële L. pneumophila Dot/Icm-systeemcomponenten te detecteren en te karakteriseren die zijn gelabeld met supermap GFP (sfGFP). Met behulp van kwantitatieve fluorescentiemicroscopie wordt de polarisatie van DotB gedefinieerd in een wilde achtergrond of wanneer het type IV-systeem wordt verwijderd. Time-lapse microscopie zal worden gebruikt om verschillen in lokalisatie en dynamiek tussen de Dot/Icm cytosolic ATPases te kwantificeren.
De gecombineerde toepassing van twee complementaire benaderingen zoals live imaging en cryo-ET biedt een voordeel ten opzichte van andere in vitro systemen. Beide methoden worden uitgevoerd in intacte cellen en behouden de natuurlijke omgeving van de T4BSS, waardoor verstoring van de oorspronkelijke structuur tijdens de voorbereiding van het monster wordt geminimaliseerd. Omdat overexpressie van eiwitten de stoichiometry van het secretieapparaat kan aantasten, worden sfGFP-fusies via allelic exchange teruggestuurd naar het Legionella-chromosoom, zodat elke fusie in één exemplaar wordt gecodeerd en de expressie wordt aangedreven door de endogene promotor. Visualisatie van chromosoomgecodeerde fusies maakt het mogelijk om het exacte eiwitgehalte op een bepaald tijdstip te kwantificeren. Cryo-ET heeft ook veel voordelen voor het bepalen van de structuur van secretiesystemen. Het meest opvallende voordeel is dat cryo-ET monsters bestaan uit bevroren intacte cellen die inheemse complexen behouden in de context van bacteriële celarchitectuur. Cryo-ET kan dus de voorkeur krijgen boven biochemische zuiveringsbenaderingen, die membraancomplexen extraheren en perifere eiwitten uit het kernapparaat kunnen halen of de algehele structuur kunnen wijzigen. Bovendien voegt het taggen van een eiwit met een omvangrijk eiwit zoals sfGFP een massa toe die door cryo-ET kan worden gedetecteerd en kan helpen bij het in kaart brengen van de verschillende subcomplexen van het Dot/Icm-apparaat op de structuur die door cryo-ET wordt verkregen.
Deze aanpak is een krachtig hulpmiddel voor het blootleggen van structurele informatie over multimoleculaire complexen die zich in het bacteriële celmembraan verzamelen. De interpretatie van structuren die met behulp van deze technieken worden toegelicht, zal het veld helpen begrijpen hoe T4BSS-componenten functioneren, waarom zoveel componenten nodig zijn voor functie, hoe de componenten interageren binnen het grotere complex en welke functies deze subassemblies presteren.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 nm colloidal gold particles</td>
			<td>Aurion</td>
			<td>25486</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100x Plan Apo objective (1.4 NA)</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Activated charcoal</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C5510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agaroze GPG/LMP, low melt</td>
			<td>American bioanalytical</td>
			<td>AB00981</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto dehydrated agar</td>
			<td>BD</td>
			<td>214010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoolSNAP EZ 20 MHz digital monochrome camera</td>
			<td>Photometrics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gene Frame, 1.7x2.8 cm, 125 &#181;L</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AB-0578</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Holey Carbon grid R 2/1 Cu 200 mesh</td>
			<td>Quantifoil</td>
			<td>Q225-CR1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iron(III) nitrate nonahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>216828</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2 Summit camera for cryo-EM</td>
			<td>GATAN</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Cysteine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C7352</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope cover slides 22x22 mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-542B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope cover slides 24x50 mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-545K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides 25x75x1 mm</td>
			<td>Globe Scientific</td>
			<td>1380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SlideBook 6.0</td>
			<td>Intelligent Imaging Innovations</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectra X light engine</td>
			<td>Lumencor</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq 2X Master Mix</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>M0270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Titan Krios</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract</td>
			<td>BD</td>
			<td>212750</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

applying live cell imaging and cryo-electron tomography to resolve spatiotemporal features of the legionella pneumophila dot/icm secretion system

De Dot/Icm secretie systeem van Legionella pneumophila is een complex type IV secretie systeem (T4SS) nanomachine dat lokaliseert bij de bacteriële pool en bemiddelt de levering van eiwitten en DNA substraten om cellen te richten, een proces dat over het algemeen directe cel-naar-cel contact. We hebben onlangs de structuur van het Dot/Icm-apparaat opgelost door cryo-elektronentomografie (cryo-ET) en hebben aangetoond dat het een cel-overspannen kanaal vormt dat verbinding maakt met een cytoplasma-complex. Toepassing van twee complementaire benaderingen die de inheemse structuur van het monster te behouden, fluorescerende microscopie in levende cellen en cryo-ET, maakt in situ visualisatie van eiwitten en assimilatie van de stoichiometry en timing van de productie van elke machine component ten opzichte van andere Dot / Icm subeenheden. Om de vereisten voor polaire positionering te onderzoeken en dynamische kenmerken te karakteriseren die verband houden met T4SS-machinebiogenese, hebben we een gencoderingsupermap groen fluorescerend eiwit samengevoegd met Dot/Icm ATPase-genen op hun oorspronkelijke posities op het chromosoom. De volgende methode integreert kwantitatieve fluorescentiemicroscopie van levende cellen en cryo-ET om polaire lokalisatie, dynamiek en structuur van deze eiwitten in intacte bacteriële cellen te kwantificeren. Het toepassen van deze benaderingen voor het bestuderen van de Legionella pneumophila T4SS is nuttig voor het karakteriseren van de functie van het Dot/Icm-systeem en kan worden aangepast om een breed scala aan bacteriële pathogenen te bestuderen die gebruik maken van de T4SS of andere soorten bacteriële afscheidingscomplexen.

Homologe recombinatie met dubbele selectie in twee stappen werd gebruikt om de gedefinieerde invoeging van sfGFP te construeren. In de eerste stap werd triparentalparing uitgevoerd, waarbij de pRK600 conjugative plasmid (een IncP plasmid) van de E. coli helper stam MT616 werd gemobiliseerd om de donor E. coli stam met de zelfmoordvector pSR47S met het sfGFP gen geflankeerd door de twee homologe regio's, de oorsprong van transfer oriT en de Bacillus subtilis counterselection gen sacB. V...

Watch this Scientific Journal Video about Applying Live Cell Imaging and Cryo-Electron Tomography to Resolve Spatiotemporal Features of the Legionella pneumophila Dot/Icm Secretion System at JoVE.com

Applying Live Cell Imaging and Cryo-Electron Tomography to Resolve Spatiotemporal Features of the Legionella pneumophila Dot/Icm Secretion System

Beeldvorming van bacteriële cellen is een opkomende systeembiologiebenadering gericht op het definiëren van statische en dynamische processen die de functie van grote macromoleculaire machines dicteren. Hier wordt integratie van kwantitatieve live celbeeldvorming en cryo-elektronentomografie gebruikt om legionella pneumophila type IV secretiesysteemarchitectuur en -functies te bestuderen.

Live Cell Imaging en Cryo-Electron Tomography toepassen op Resolve Spatiotemporal Features of the Legionella pneumophila Dot/Icm Secretion System

The Dot/Icm secretion system of Legionella pneumophila is a complex type IV secretion system (T4SS) nanomachine that localizes at the bacterial pole and ...

Dit protocol is nuttig voor het karakteriseren van de assemblagefuncties van bacteriële afscheidingscomplexen en kan leiden tot een fundamenteel begrip van de moleculaire mechanismen die nodig zijn voor interacties met gastheerpathogen. Deze techniek integreert complementaire benaderingen die de inheemse structuur van het monster behouden en maakt het mogelijk en te zien aan visualisatie van eiwitten complexen in intacte bacteriële cellen. Het verhoogt ons begrip van de structurele functierelaties van bacteriële afscheidingssystemen.Deze methode kan worden aangepast om andere soorten afscheidingssystemen of andere cellulaire complexen in een breed scala van bacteriële soorten te bestuderen. Begin met het maken van agarose pads voor live cel beeldvorming. Bereid ongeveer 30 mL van 1%laag smelten agarose oplossing in water en magnetron het in een glazen kolf voor ongeveer 90 seconden wervelende het af en toe totdat de agarose volledig is opgelost.Plaats twee glazen schuifglijden van 22 bij 22 bij 0,15 mm op de rand van een glazen schuif van 25 bij 75 bij 1,1 mm bovenop de andere. Stapel vervolgens nog twee van de kleinere dia's aan de andere rand. Pipette ongeveer 1 mL van de gesmolten agarose in het midden dia tussen de twee bovenste glazen platen en plaats een andere grote dia op de top van de gesmolten agarose om ervoor te zorgen dat de vorming van luchtbellen te voorkomen.Koel de dia's op vier graden celsius gedurende 15 minuten gebruik dan een scalpel of scheermesje om het pad voorzichtig te snijden in kleine vierkantjes. Bevestig een dubbelzijdig lijmframe op een 25 bij 75 bij 1,1 mm glazen schuif en plaats verschillende pads op de glijbaan. Los een zware patch legionella Pneumophila op in 1 mL dubbelgedestilleerd water.Dan vortex en pipet twee tot drie microliters van de verdunning op de pads. Plaats voorzichtig een afdek van 58 bij 24 bij 0,15 mm over het kleefframe. Selecteer cellen voor beeldvorming met heldere veldverlichting.Vervolgens, in het vangstvenster van de software van de microscoop, pas de ND aan 180 en de binning aan twee door twee. Gebruik het kanaal van 488 nanometer om het monster 500 tot 1000 milliseconden bloot te leggen en valideer de specificiteit van de fluorescentie door niet-getagged Legionella Pneumophila met dezelfde parameters te berekenen. Om polariteit te kwantificeren, past u het beeldcontrast aan zodat de bacteriën duidelijk zichtbaar zijn.Zoom vervolgens in op het interessegebied en gebruik het gebiedsgereedschap om een rechthoek van 0,25 bij 1,3 micrometer te plaatsen vanaf de paal en zich uit te breiden tot het cytoplasma om ervoor te zorgen dat de rechthoek binnen de bacteriële grenzen blijft. Markeer ten minste 200 bacteriën en maak maskers met behulp van de regio te maskeren knop in het analysemenu. Klik op maskerstatistieken en kies object onder maskerbereik.Markeer vervolgens de gemiddelde intensiteit en variantie onder functies en intensiteit. Exporteer de gegevens als een tekstbestand en gebruik de spreadsheettoepassing om de polariteitsscores van elke bacterie te berekenen als de verhouding tussen de variantie en de gemiddelde intensiteit. Voor toepassingen met een hoge doorvoer gebruik maken van face contrast microscopie om dual channel beelden te verwerven.Zorg ervoor dat u velden van mening te kiezen waar de bacteriën volledig zijn gescheiden. Pas vervolgens het gezichtskanaalcontrast van het beeld aan op een niveau waarop de bacteriën duidelijk zichtbaar zijn. Open de dual-channel afbeelding en start het venster Segmentmasker maken.Pas de juiste drempelwaarde aan en verwijder vervolgens de kleine objecten door op de knop Objecten definiëren te klikken en de minimumgrootte aan te passen aan 100 pixels. Selecteer onder het verfijnen van masker de optie Randenobjecten verwijderen en afzonderlijke maskers van bacteriën die naast elkaar liggen. Om de dynamiek van de fusie-eiwitten te kwantificeren, opent u het beeldopnamevenster en markeert u time lapse.Voer er twee in het vak tijdstippen in. Verwerven twee succesvolle beelden van Legionella Pneumophila uitdrukken van de fluorescerende eiwit van belang. Pas het afbeeldingscontrast aan totdat de cellen duidelijk zichtbaar zijn.Gebruik vervolgens het gebiedsgereedschap om een vierkant van 0,25 bij 0,25 micrometer in het midden van ten minste 400 cellen te plaatsen. Gebruik vervolgens de knop Regio om de knop te maskeren in het analysemenu om een masker van de vierkanten van belang te maken. Maak een nieuw leeg masker en gebruik het pixelgereedschap om het hele celgebied van ten minste 25 willekeurige cellen te markeren.Maak een ander masker en gebruik het grote penseel om gebieden tussen de cellen te markeren. Selecteer ten slotte maskerstatistieken en controleer of het object is geselecteerd onder maskerbereik voor masker één. Kies onder functies en intensiteit de gemiddelde intensiteit.Exporteer de gegevens en herhaal het proces voor masker 2. Selecteer voor masker 3 het hele masker en exporteer de gemiddelde intensiteit. Om het elektronen cryotomografiemonster voor te bereiden, kweekt u een zware patch Legionella Pneumophila op CYE Agrastreptomisum-platen gedurende 48 uur bij 37 graden Celsius.Resuspend de cellen in water tot een OD 600 van ongeveer 0,7. Voeg vervolgens vijf microliter colloïdale gouddeeltjes toe aan 20 microliter van de celsuspensie. Gloed ontlading een holey carbon grid en pipet vijf microliters van het celmengsel op.Laat het even staan. Dep het rooster met filterpapier en bevries het in vloeibaar ethaan met behulp van een zwaartekracht-gedreven zuiger apparaat. Na het inbrengen van superfolder GFP in het Legionella Pneumophila chromosoom, werd levende cel fluorescerende microscopie uitgevoerd om het fluorescerende signaal te vergelijken met dat van de ouderlijke superfolder GFP negatieve stam.Bovendien werd heldere veldmicroscopie gebruikt om het aandeel cellen met een specifiek fluorescerend signaal te onderzoeken. Slechts een fractie van de cellen die DotB superfolder GFP geproduceerd toonde polaire lokalisatie van de fusie-eiwit. Bij het karakteriseren van de verdeling van DotB tl-signaal, bleek dat de intensiteit van DotB superfolder GFP aan de polen was ongeveer twee keer hoger dan in de cytosol.Om te onderzoeken of DotB superfolder GFP polarisatie afhankelijk was van een volledig geassembleerd type vier afscheidingssysteem, werden polariteitsscores van DotB superfolder GFP bepaald voor individuele cellen in een wild type, en in een gemuteerd type vier afscheidingssysteem. Inderdaad, polaire positionering van DotB superfolder GFP verdwenen toen de Dot / ICM-systeem werd verwijderd. Dynamische patronen gaven aan dat de DotB ATPase aanwezig was in een dynamische cytosolische populatie en werd aangeworven om de gepolariseerde Dot / ICM type vier secretie systeem in een laat stadium montage reactie.Hoge doorvoer cryo-ET werd gebruikt om het intacte type vier secretiesysteem apparaat te visualiseren in een Legionella Pneumophila stam uitdrukken DotB superfolder GFP. Reconstructie van de cel bleek meerdere Dot / ICM machines ingebed in de cel envelop. Ook de algehele positionering van DotB en superfolder GFP ten opzichte van de intacte type vier secretiesysteemmachine werd bepaald.Driedimensionale oppervlakterenders gaven aan dat superfolder GFP onder de DotB-hexamer is geplaatst, die als schijf aan de basis van het cytoplasmische ATPase-complex wordt geplaatst. Bij het proberen van deze techniek, zorg ervoor dat de stabiliteit van de fusie-eiwitten en de functionaliteit van de tag secretie systeem te beoordelen alvorens over te gaan tot beeldverwerving. Modellering en montage kunnen effectieve manieren zijn om de dynamische patronen en structurele dichtheden te analyseren, evenals voor de evaluatie van conformatieveranderingen of lokalisatie van subeenheden in de structuur.Deze aanpak kan helpen bij het begrijpen hoe verschillende geheime systeemcomponenten van type vier functioneren, hoe ze binnen het grotere complex interageren en welke functies verschillende subassemblages uitvoeren.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Applying Live Cell Imaging and Cryo-Electron Tomography to Resolve Spatiotemporal Features of the Legionella pneumophila Dot/Icm Secretion System

Determination of Molecular Structures of HIV Envelope Glycoproteins using Cryo-Electron Tomography and Automated Sub-tomogram Averaging

Bepaling van de moleculaire structuren van HIV envelop glycoproteïnen met behulp van Cryo-electron tomography en geautomatiseerde Sub-tomogram Middeling

Since its discovery nearly 30 years ago, more than 60 million people have been infected with the human immunodeficiency virus (HIV) (www.usaid.gov). The ...

Use of an Optical Trap for Study of Host-Pathogen Interactions for Dynamic Live Cell Imaging

Het gebruik van een optische val voor de Studie van gastheer-pathogeen interacties voor Dynamic live cell imaging

Dynamic live cell imaging allows direct visualization of real-time interactions between cells of the immune system1, 2; however, the lack of spatial and ...

Real-time Live Imaging of T-cell Signaling Complex Formation

Real-time Live beeldvorming van T-cel signaleringscomplex Vorming

Protection against infectious diseases is mediated by the immune system 1,2. T lymphocytes are the master coordinators of the immune system, regulating ...

Live Cell Imaging of Alphaherpes Virus Anterograde Transport and Spread

Live cell imaging van Alphaherpes Virus Anterograad Transport en Spread

Advances in live cell fluorescence microscopy  techniques, as well as the construction of recombinant viral strains that  express fluorescent fusion ...

Use of Galleria mellonella as a Model Organism to Study Legionella pneumophila Infection

Use of Galleria mellonella as a Model Organism to Study Legionella pneumophila Infection

Gebruik<em&gt; Galleria mellonella</em&gt; Als modelorganisme om te studeren<em&gt; Legionella pneumophila</em&gt; Infectie

Legionella pneumophila, the causative agent of a severe pneumonia named Legionnaires&#39; disease, is an important human pathogen that infects and ...

Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes

Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes

Beeldvorming InlC Afscheiding to Cellular Infectie Onderzoek door de bacteriële pathogenen<em&gt; Listeria monocytogenes</em

Bacterial intracellular  pathogens can be conceived as molecular tools to dissect cellular signaling  cascades due to their capacity to exquisitely ...

Applying an Inducible Expression System to Study Interference of Bacterial Virulence Factors with Intracellular Signaling

Het toepassen van een induceerbare Expression Systeem om interferentie van bacteriële virulentiefactoren met intracellulaire signalering Studie

The technique presented here allows one to analyze at which step a target protein, or alternatively a small molecule, interacts with the components of a ...

Legionella pneumophila Outer Membrane Vesicles: Isolation and Analysis of Their Pro-inflammatory Potential on Macrophages

Legionella pneumophila Outer Membrane Vesicles: Isolation and Analysis of Their Pro-inflammatory Potential on Macrophages

Legionella pneumophila Outer membraanvesicles: Isolatie en analyse van hun pro-inflammatoire Potential op macrofagen

Bacteria are able to secrete a variety of molecules via various secretory systems. Besides the secretion of molecules into the extracellular space or ...

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

Een nieuwe Feeder-vrij systeem voor massaproductie van lymfkliertest Natural Killer cellen In Vitro

Natural killer (NK) cells belong to the innate immune system and are a first-line anti-cancer immune defense; however, they are suppressed in the tumor ...

Isolation, Fixation, and Immunofluorescence Imaging of Mouse Adrenal Glands

Afzondering, fixatie en immunofluorescentie beeldvorming van muis bijnieren

Immunofluorescence is a well-established technique for detection of antigens in tissues with the employment of fluorochrome-conjugated antibodies and has ...