Name: applying live cell imaging and cryo-electron tomography to resolve spatiotemporal features of the legionella pneumophila dot/icm secretion system
Uploaded: 2020-03-10T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Applying Live Cell Imaging and Cryo-Electron Tomography to Resolve Spatiotemporal Features of the Legionella pneumophila Dot/Icm Secretion System at JoVE.com

D.C. und C.R.R. wurden vom NIH (R37AI041699 und R21AI130671) unterstützt. D.P., B.H. und J.L wurden von den National Institutes of Health (R01AI087946 und R01GM107629) unterstützt.

HINWEIS: Alle Verfahren, die das Wachstum, die Manipulation und die Bildgebung von L. pneumophila beinhalten, sollten in einem Labor der biologischen Sicherheitsstufe 2 in Übereinstimmung mit den lokalen Richtlinien durchgeführt werden.
1. Einfügung von sfGFP in L. pneumophila Chromosom mit Allelic Exchange und Double Selection Strategy (Abbildung 2, Abbildung 3)
<ol><li>Klonen Sie in den Genersatzvektor pSR47S<...

<ol>
	<li>Franco, I. S., Shuman, H. A., Charpentier, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+perplexing+functions+and+surprising+origins+of+Legionella+pneumophila+type+IV+secretion+effectors.">The perplexing functions and surprising origins of Legionella pneumophila type IV secretion effectors.</a> Cellular Microbiology. 11, 1435-1443 (2009).</li><li>Burstein, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-scale+identification+of+Legionella+pneumophila+effectors+using+a+machine+learning+approach.">Genome-scale identification of Legionella pneumophila effectors using a machine learning approach.</a> PLOS Pathogens. 5, 1000508 (2009).</li><li>Ninio, S., Roy, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effector+proteins+translocated+by+Legionella+pneumophila:+strength+in+numbers.">Effector proteins translocated by Legionella pneumophila: strength in numbers.</a> Trends in Microbiology. 15, 372-380 (2007).</li><li>Vogel, J. P., Andrews, H. L., Wong, S. K., Isberg, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conjugative+transfer+by+the+virulence+system+of+Legionella+pneumophila.">Conjugative transfer by the virulence system of Legionella pneumophila.</a> Science. 279, 873-876 (1998).</li><li>Isberg, R. R., O'Connor, T. J., Heidtman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Legionella+pneumophila+replication+vacuole:+making+a+cosy+niche+inside+host+cells.">The Legionella pneumophila replication vacuole: making a cosy niche inside host cells.</a> Nature Reviews Microbiology. 7, 13-24 (2009).</li><li>Roy, C. R., Berger, K. H., Isberg, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Legionella+pneumophila+DotA+protein+is+required+for+early+phagosome+trafficking+decisions+that+occur+within+min+of+bacterial+uptake.">Legionella pneumophila DotA protein is required for early phagosome trafficking decisions that occur within min of bacterial uptake.</a> Molecular Microbiology. 28, 663-674 (1998).</li><li>Archer, K. A., Roy, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MyD88-Dependent+Responses+Involving+Toll-Like+Receptor+2+Are+Important+for+Protection+and+Clearance+of+Legionella+pneumophila+in+a+Mouse+Model+of+Legionnaires'+Disease.">MyD88-Dependent Responses Involving Toll-Like Receptor 2 Are Important for Protection and Clearance of Legionella pneumophila in a Mouse Model of Legionnaires' Disease.</a> Infection and Immunity. 74, 3325-3333 (2006).</li><li>Nagai, H., Kubori, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+IVB+Secretion+Systems+of+Legionella+and+Other+Gram-Negative+Bacteria.">Type IVB Secretion Systems of Legionella and Other Gram-Negative Bacteria.</a> Frontiers in Microbiology. 2, 136 (2011).</li><li>Kubori, T., Nagai, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Type+IVB+secretion+system:+an+enigmatic+chimera.">The Type IVB secretion system: an enigmatic chimera.</a> Current Opinion in Microbiology. 29, 22-29 (2016).</li><li>Chetrit, D., Hu, B., Christie, P. J., Roy, C. R., Liu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+unique+cytoplasmic+ATPase+complex+defines+the+Legionella+pneumophila+type+IV+secretion+channel.">A unique cytoplasmic ATPase complex defines the Legionella pneumophila type IV secretion channel.</a> Nature Microbiology. 3, 678-686 (2018).</li><li>Merriam, J. J., Mathur, R., Maxfield-Boumil, R., Isberg, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+Legionella+pneumophila+fliI+gene:+intracellular+growth+of+a+defined+mutant+defective+for+flagellum+biosynthesis.">Analysis of the Legionella pneumophila fliI gene: intracellular growth of a defined mutant defective for flagellum biosynthesis.</a> Infection and Immunity. 65, 2497-2501 (1997).</li><li>Feeley, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Charcoal-yeast+extract+agar:+primary+isolation+medium+for+Legionella+pneumophila.">Charcoal-yeast extract agar: primary isolation medium for Legionella pneumophila.</a> Journal of Clinical Microbiology. 10, 437-441 (1979).</li><li>Andrews, H. L., Vogel, J. P., Isberg, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+linked+Legionella+pneumophila+genes+essential+for+intracellular+growth+and+evasion+of+the+endocytic+pathway.">Identification of linked Legionella pneumophila genes essential for intracellular growth and evasion of the endocytic pathway.</a> Infection and Immunity. 66, 950-958 (1998).</li><li>Morado, D. R., Hu, B., Liu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+Tomoauto:+A+Protocol+for+High-throughput+Automated+Cryo-electron+Tomography.">Using Tomoauto: A Protocol for High-throughput Automated Cryo-electron Tomography.</a> Journal of Visualized Experiments. (107), e53608 (2016).</li><li>Hu, B., Lara-Tejero, M., Kong, Q., Galan, J. E., Liu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Situ+Molecular+Architecture+of+the+Salmonella+Type+III+Secretion+Machine.">In Situ Molecular Architecture of the Salmonella Type III Secretion Machine.</a> Cell. 168, 1065-1074 (2017).</li><li>Mastronarde, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+electron+microscope+tomography+using+robust+prediction+of+specimen+movements.">Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements.</a> Journal of Structural Biology. 152, 36-51 (2005).</li><li>Zheng, S. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MotionCor2:+anisotropic+correction+of+beam-induced+motion+for+improved+cryo-electron+microscopy.">MotionCor2: anisotropic correction of beam-induced motion for improved cryo-electron microscopy.</a> Nature Methods. 14, 331-332 (2017).</li><li>Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computer+visualization+of+three-dimensional+image+data+using+IMOD.">Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD.</a> Journal of Structural Biology. 116, 71-76 (1996).</li><li>Gilbert, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Iterative+methods+for+the+three-dimensional+reconstruction+of+an+object+from+projections.">Iterative methods for the three-dimensional reconstruction of an object from projections.</a> Journal of Theoretical Biology. 36, 105-117 (1972).</li><li>Radermacher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Weighted+Back-projection+Methods.">Weighted Back-projection Methods.</a> Electron Tomography. , 245-273 (2007).</li><li>Winkler, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tomographic+subvolume+alignment+and+subvolume+classification+applied+to+myosin+V+and+SIV+envelope+spikes.">Tomographic subvolume alignment and subvolume classification applied to myosin V and SIV envelope spikes.</a> Journal of Structural Biology. 165, 64-77 (2009).</li><li>Winkler, H., Taylor, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+marker-free+alignment+with+simultaneous+geometry+determination+and+reconstruction+of+tilt+series+in+electron+tomography.">Accurate marker-free alignment with simultaneous geometry determination and reconstruction of tilt series in electron tomography.</a> Ultramicroscopy. 106, 240-254 (2006).</li><li>Prevost, M. S., Waksman, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-ray+crystal+structures+of+the+type+IVb+secretion+system+DotB+ATPases.">X-ray crystal structures of the type IVb secretion system DotB ATPases.</a> Protein Science. 27, 1464-1475 (2018).</li><li>Miklos, G. L., Rubin, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+the+genome+project+in+determining+gene+function:+insights+from+model+organisms.">The role of the genome project in determining gene function: insights from model organisms.</a> Cell. 86, 521-529 (1996).</li><li>Reyrat, J. M., Pelicic, V., Gicquel, B., Rappuoli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Counterselectable+markers:+untapped+tools+for+bacterial+genetics+and+pathogenesis.">Counterselectable markers: untapped tools for bacterial genetics and pathogenesis.</a> Infection and Immunity. 66, 4011-4017 (1998).</li><li>Yu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Molecule+Studies+in+Live+Cells.">Single-Molecule Studies in Live Cells.</a> Annual Review of Physical Chemistry. 67, 565-585 (2016).</li><li>Stewart, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-electron+microscopy+and+cryo-electron+tomography+of+nanoparticles.">Cryo-electron microscopy and cryo-electron tomography of nanoparticles.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: Nanomedicine and Nanobiotechnology. 9, (2017).</li></ol>

Die Aufklärung der Funktionen bakterieller Sekretionssysteme ist der Schlüssel zu einem vollständigen Verständnis der Wirts-Pathogen-Wechselwirkungen. Sekretionssysteme sind komplexe Maschinen, die Effektorenproteine in Wirtszellen injizieren können und in einigen Fällen die Etablierung einer subzellulären Nische fördern, die die bakterielle Replikation unterstützt. Die obige Methode bietet wichtige neue Werkzeuge für die Untersuchung des Dot/Icm-Sekretionssystems des reinspiratorischen bakteriellen Erregers <e...

Legionella pneumophila (L. pneumophila), das ätiologische Mittel der Legionärskrankheit, bewohnt Süßwasserreservoirs, in denen sich die Bakterien vermehren, indem sie sich in aquatischen, freischwimmenden Protozoen animieren. L. pneumophila verursacht Krankheitsausbrüche beim Menschen, wenn das Einatmen von aerosolisierten Bakterien aus Trinkwasserquellen auftritt. In infizierten Zellen ermöglicht die Subversion von Wirtswegen L. pneumophila, die endozytische Reifung des Vakuums, in dem es sich befindet, zu verzögern und die Biogenese eines Zellfachs zu fördern, das die bakterielle Replikation unterstützt. Dieser Prozess wird durch ein spezialisiertes bakterielles Sekretionssystem des Typs IVB (T4BSS) angetrieben, das als Dot/Icm bekannt ist, und seinem Repertoire von über 300 "Effektor"-Proteinen, die während der Infektion in den Wirtcytosol transloziert werden, um die Manipulation der Zellfunktionen1,2,3,4,5zu erleichtern. Mutanten ohne funktionelles Dot/Icm-Gerät liefern keine Effektoren in das Wirtszytosol, sind defekt für die intrazelluläre Replikation und sind in Tiermodellen der Krankheit6,7aviär.
Viele Bakterienarten haben extrem komplexe und dynamische Mehrkomponenten-Maschinen entwickelt, die für Infektionsprozesse benötigt werden. Andere T4BSS wie das Dot/Icm-System sind auch wichtig für die intrazelluläre Replikation von bakteriellen Krankheitserregern wie Coxiella burnetii und Rickettsiella grylli. Obwohl T4BSS evolutionär mit prototypischen IVA-Systemen des Typs verwandt sind, die DNA-Übertragung vermitteln und ein begrenztes Repertoire an Effektorproteinen liefern können, verfügt das Dot/Icm-System über fast doppelt so viele Maschinenkomponenten und liefert eine Vielzahl von Effektoren. Vermutlich hat diese Erweiterung der Anzahl der Komponenten es dem Dot/Icm-Gerät ermöglicht, neue Effektoren einfach unterzubringen und zu integrieren8,9.
Kürzlich haben wir die Kryo-Elektronen-Tomographie (Cryo-ET) verwendet, um die Struktur des Dot/Icm-Geräts in situ zu lösen und zeigten, dass es einen Zellhüllen-Spannkanal bildet, der sich mit einem zytoplasmatischen Komplex verbindet. Weitere Analysen ergaben, dass der zytosolische ATPase DotB durch Wechselwirkungen mit dem zytosolischen ATPase DotO mit dem Dot/Icm-System am L. pneumophila-Zellpol assoziiert. Wir haben entdeckt, dass DotB eine zytosolische Bewegung in den meisten Bakterienzellen zeigt, was darauf hindeutet, dass diese ATPase in einer dynamischen zytosolischen Population vorhanden ist, aber auch mit den polaren Dot/Icm-Komplexen assoziiert wird. Darüber hinaus bildet DotO eine hexamerische Baugruppe von DotO-Dimeren, die mit dem inneren Membrankomplex verbunden sind, und ein DotB-Hexamer verbindet sich mit der Basis dieses zytoplasmatischen Komplexes. Die Montage des DotB-DotO-Energiekomplexes erzeugt einen zytoplasmatischen Kanal, der die Translokation von Substraten durch das T4SS leitet (Abbildung 1)10.
Trotz dieser jüngsten Fortschritte ist wenig darüber bekannt, wie das Dot/Icm-System funktioniert und wie sich jedes Protein zu einem aktiven Apparat zusammenfügt8. Die Aufdeckung der regulatorischen Schaltungen des Dot/Icm T4SS ist von grundlegender Bedeutung für das Verständnis der molekularen Mechanismen von Wirts-Pathogen-Wechselwirkungen. Daher besprechen wir, wie man mit Live-Zellmikroskopie und Kryo-ET wesentliche L. pneumophila Dot/Icm-Systemkomponenten erkennt und charakterisiert, die mit Super-Ordner GFP (sfGFP) markiert sind. Mittels quantitativer Fluoreszenzmikroskopie wird die polare Lokalisation von DotB in einem Wildtyp-Hintergrund oder beim Löschen des Typ-IV-Systems definiert. Die Zeitraffermikroskopie wird verwendet, um Unterschiede in lokalisierung und Dynamik zwischen den zytosolischen AtPases Dot/Icm zu quantifizieren.
Die kombinierte Anwendung von zwei sich ergänzenden Ansätzen wie Live Imaging und Kryo-ET bietet einen Vorteil gegenüber anderen In-vitro-Systemen. Beide Methoden werden in intakten Zellen durchgeführt und erhalten die natürliche Umgebung des T4BSS, wodurch Störungen der nativen Struktur während der Probenvorbereitung minimiert werden. Da die Überexpression von Proteinen die Stoiiometrie des Sekretionsapparates beeinträchtigen kann, werden sfGFP-Fusionen über allelischen Austausch an das Legionella-Chromosom zurückgegeben, so dass jede Fusion in einer Kopie kodiert ist und die Expression vom endogenen Promotor angetrieben wird. Die Visualisierung chromosomal-kodierter Fusionen ermöglicht die Quantifizierung des genauen Proteinniveaus, das zu einem definierten Zeitpunkt exprimiert wird. Cryo-ET hat auch viele Vorteile bei der Bestimmung der Struktur von Sekretionssystemen. Der bemerkenswerteste Vorteil ist, dass Kryo-ET-Proben aus gefrorenen intakten Zellen bestehen, die native Komplexe im Kontext der bakteriellen Zellarchitektur bewahren. Daher kann Kryo-ET biochemischen Reinigungsansätzen vorzuziehen sein, die Membrankomplexe extrahieren und periphere Proteine aus dem Kernapparat entfernen oder die Gesamtstruktur verändern können. Darüber hinaus fügt die Kennzeichnung eines von Interesse sindden Proteins mit einem sperrigen Protein wie sfGFP eine Masse hinzu, die durch Cryo-ET nachweisbar ist und bei der Kartierung der verschiedenen Unterkomplexe des Dot/Icm-Geräts auf die durch Cryo-ET erhaltene Struktur helfen kann.
Dieser Ansatz ist ein leistungsfähiges Werkzeug, um strukturelle Informationen über multimolekulare Komplexe aufzudecken, die sich in der bakteriellen Zellmembran zusammensetzen. Die Interpretation von Strukturen, die mit diesen Techniken aufgeklärt werden, wird dem Feld helfen zu verstehen, wie T4BSS-Komponenten funktionieren, warum so viele Komponenten für die Funktion benötigt werden, wie die Komponenten innerhalb des größeren Komplexes interagieren und welche Funktionen diese Unterbaugruppen ausführen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 nm colloidal gold particles</td>
			<td>Aurion</td>
			<td>25486</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100x Plan Apo objective (1.4 NA)</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Activated charcoal</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C5510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agaroze GPG/LMP, low melt</td>
			<td>American bioanalytical</td>
			<td>AB00981</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto dehydrated agar</td>
			<td>BD</td>
			<td>214010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoolSNAP EZ 20 MHz digital monochrome camera</td>
			<td>Photometrics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gene Frame, 1.7x2.8 cm, 125 &#181;L</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AB-0578</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Holey Carbon grid R 2/1 Cu 200 mesh</td>
			<td>Quantifoil</td>
			<td>Q225-CR1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iron(III) nitrate nonahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>216828</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2 Summit camera for cryo-EM</td>
			<td>GATAN</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Cysteine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C7352</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope cover slides 22x22 mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-542B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope cover slides 24x50 mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-545K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides 25x75x1 mm</td>
			<td>Globe Scientific</td>
			<td>1380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SlideBook 6.0</td>
			<td>Intelligent Imaging Innovations</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectra X light engine</td>
			<td>Lumencor</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq 2X Master Mix</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>M0270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Titan Krios</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract</td>
			<td>BD</td>
			<td>212750</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

applying live cell imaging and cryo-electron tomography to resolve spatiotemporal features of the legionella pneumophila dot/icm secretion system

Das Dot/Icm-Sekretionssystem von Legionella pneumophila ist eine komplexe Typ-IV-Sekretionssystem (T4SS)-Nanomaschine, die am Bakteriellen Pol lokalisiert und die Lieferung von Protein- und DNA-Substraten an Zielzellen vermittelt, ein Prozess, der in der Regel einen direkten Zell-zu-Zell-Kontakt erfordert. Wir haben vor kurzem die Struktur des Dot/Icm-Apparats mittels Kryo-Elektronentomographie (Cryo-ET) gelöst und gezeigt, dass es einen Zellhüllen-Spannkanal bildet, der sich mit einem zytoplasmatischen Komplex verbindet. Die Anwendung von zwei komplementären Ansätzen, die die native Struktur der Probe erhalten, die fluoreszierende Mikroskopie in lebenden Zellen und Kryo-ET, ermöglicht die in situ-Visualisierung von Proteinen und die Assimilation der Stoiterminatrie und das Timing der Produktion jeder Maschinenkomponente im Vergleich zu anderen Dot/Icm-Untereinheiten. Um die Anforderungen an die polare Positionierung zu untersuchen und dynamische Merkmale im Zusammenhang mit der T4SS-Maschinenbiogenese zu charakterisieren, haben wir ein Gen kodiert, das superfolder green fluorescent protein zu Dot/Icm ATPase-Genen an ihren nativen Positionen auf dem Chromosom kodiert. Die folgende Methode integriert die quantitative Fluoreszenzmikroskopie lebender Zellen und Kryo-ET, um polare Lokalisation, Dynamik und Struktur dieser Proteine in intakten Bakterienzellen zu quantifizieren. Die Anwendung dieser Ansätze für die Untersuchung der Legionella pneumophila T4SS ist nützlich für die Charakterisierung der Funktion des Dot/Icm-Systems und kann angepasst werden, um eine Vielzahl von bakteriellen Krankheitserregern zu untersuchen, die die T4SS oder andere Arten von bakteriellen Sekretionskomplexen nutzen.

Homologe Rekombination mit doppelter Auswahl in zwei Schritten wurde verwendet, um die definierte Einfügung von sfGFP zu konstruieren. Im ersten Schritt wurde eine triparentale Paarung durchgeführt, bei der das konjugative Plasmid pRK600 (ein IncP-Plasmid) aus dem E. coli-Helferstamm MT616 mit dem Selbstmordvektor pSR47S, der das sfGFP-Gen enthält, das von den beiden homologen Regionen, dem Ursprung des TransferoriTs und dem Bacillus subtilis-Gegenselektions-SacB, flankiert wurde, zum Spender E. ...

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Applying Live Cell Imaging and Cryo-Electron Tomography to Resolve Spatiotemporal Features of the Legionella pneumophila Dot/Icm Secretion System

Die Bildgebung von Bakterienzellen ist ein aufkommendem systembiologischen Ansatz, der sich auf die Definition statischer und dynamischer Prozesse konzentriert, die die Funktion großer makromolekularer Maschinen diktieren. Hier wird die Integration von quantitativer Live-Zell-Bildgebung und Kryo-Elektronentomographie verwendet, um Legionella pneumophila Typ IV Sekretionssystemarchitektur und -funktionen zu untersuchen.

Anwendung von Live Cell Imaging und Cryo-Electron Tomography zur Auflösung der raumzeitlichen Merkmale des Legionella pneumophila Dot/Icm Sekretionssystems

The Dot/Icm secretion system of Legionella pneumophila is a complex type IV secretion system (T4SS) nanomachine that localizes at the bacterial pole and ...

Dieses Protokoll ist nützlich, um die Assembling-Funktionen von bakteriellen Sekretionskomplexen zu charakterisieren und kann zu einem grundlegenden Verständnis der molekularen Mechanismen führen, die für Wirtspathogen-Wechselwirkungen erforderlich sind. Diese Technik integriert komplementäre Ansätze, die die native Struktur der Probe erhalten und die Visualisierung von Proteinkomplexen in intakten Bakterienzellen ermöglichen und sehen. Es erhöht unser Verständnis der strukturellen Funktionsbeziehungen von bakteriellen Sekretionssystemen.Diese Methode kann angepasst werden, um andere Arten von Sekretionssystemen oder anderen zellulären Komplexen in einer Vielzahl von Bakterienarten zu studieren. Beginnen Sie mit der Herstellung von Agarose-Pads für die Live-Zell-Bildgebung. Bereiten Sie ca. 30 ml 1%low melt Agarose Lösung in Wasser und Mikrowelle es in einem Glaskolben für etwa 90 Sekunden wirbeln es gelegentlich, bis die Agarose vollständig gelöst ist.Platzieren Sie zwei 22 x 22 x 0,15 mm Glasschlitten am Rand eines 25 x 75 x 1,1mm Glasschlittens übereinander. Stapeln Sie dann zwei weitere der kleineren Folien auf der anderen Kante. Pipette ca. 1 ml der geschmolzenen Agarose in die Mitte gleiten zwischen den beiden oberen Glasrutschen und legen Sie eine weitere große Rutsche auf die geschmolzene Agarose, um die Bildung von Luftblasen zu vermeiden.Kühlen Sie die Dias bei vier Grad Celsius für 15 Minuten, dann verwenden Sie ein Skalpell oder Rasierklinge, um das Pad sanft in kleine Quadrate zu schneiden. Befestigen Sie einen doppelseitigen Kleberahmen auf einem 25 x 75 x 1,1 mm Glasschlitten und legen Sie mehrere Pads auf den Schlitten. Lösen Sie ein schweres Pflaster von Legionella Pneumophila in 1 ml doppelt destilliertem Wasser auf.Dann Wirbel und Pipette zwei bis drei Mikroliter der Verdünnung auf die Pads. Legen Sie einen 58 x 24 x 0,15 mm-Deckel über den Kleberahmen. Wählen Sie Zellen für die Bildgebung mit heller Feldbeleuchtung aus.Passen Sie dann im Aufnahmefenster der Software des Mikroskops die ND auf 180 und die Binning auf zwei um zwei an. Verwenden Sie den 488-Nanometer-Kanal, um die Probe für 500 bis 1000 Millisekunden freizulegen und die Spezifität der Fluoreszenz zu validieren, indem Sie Legionella Pneumophila mit den gleichen Parametern abbilden. Um die Polarität zu quantifizieren, passen Sie den Bildkontrast so an, dass die Bakterien deutlich sichtbar sind.Zoomen Sie dann auf den Bereich von Interesse und verwenden Sie das Regionswerkzeug, um ein 0,25 mal 1,3 Mikrometer Rechteck zu platzieren, das am Pol beginnt und sich in das Zytoplasma ausdehnt, um sicherzustellen, dass das Rechteck innerhalb der bakteriellen Grenzen verbleibt. Markieren Sie mindestens 200 Bakterien und erstellen Sie Masken, indem Sie die Schaltfläche "Region zum Maskieren" im Analysemenü verwenden. Klicken Sie auf Maskenstatistiken und wählen Sie das Objekt unter Maskenbereich aus.Markieren Sie dann die mittlere Intensität und Varianz unter Features und Intensität. Exportieren Sie die Daten als Textdatei und verwenden Sie die Tabellenkalkulationsanwendung, um die Polaritätswerte jedes Bakteriums als Verhältnis zwischen der Varianz und der mittleren Intensität zu berechnen. Für Anwendungen mit hohem Durchsatz verwenden Sie Gesichtskontrastmikroskopie, um Dual-Channel-Bilder zu erfassen.Achten Sie darauf, Sichtfelder zu wählen, in denen die Bakterien vollständig getrennt sind. Passen Sie als Nächstes den Gesichtskanalkontrast des Bildes auf eine Ebene an, auf der die Bakterien deutlich sichtbar sind. Öffnen Sie das Dual-Channel-Bild, und starten Sie das Fenster "Segmentmasken erstellen".Passen Sie den entsprechenden Schwellenwert an, und entfernen Sie dann die kleinen Objekte, indem Sie auf die Schaltfläche Objekte definieren klicken und die Mindestgröße auf 100 Pixel anpassen. Wählen Sie unter Maske verfeinern Kantenobjekte und separate Masken von Bakterien, die nebeneinander liegen, aus. Um die Dynamik der Fusionsproteine zu quantifizieren, öffnen Sie das Bildaufnahmefenster und markieren Sie den Zeitraffer.Geben Sie zwei in das Feld Anzahl der Zeitpunkte ein. Erwerben Sie zwei erfolgreiche Bilder von Legionella Pneumophila, die das fluoreszierende Protein von Interesse ausdrücken. Passen Sie den Bildkontrast an, bis die Zellen deutlich sichtbar sind.Verwenden Sie dann das Regionswerkzeug, um ein 0,25 mal 0,25 Mikrometer-Quadrat in der Mitte von mindestens 400 Zellen zu platzieren. Verwenden Sie als Nächstes die Schaltfläche Bereich zum Maskieren im Analysemenü, um eine Maske der quadratisch interessierten Quadrate zu erstellen. Erstellen Sie eine neue leere Maske, und markieren Sie mit dem Pixelwerkzeug den gesamten Zellbereich von mindestens 25 zufälligen Zellen.Erstellen Sie eine weitere Maske, und markieren Sie mit dem großen Pinselwerkzeug Bereiche zwischen den Zellen. Wählen Sie schließlich Maskenstatistiken aus, und stellen Sie sicher, dass das Objekt unter Maskenbereich für Maske 1 ausgewählt ist. Wählen Sie unter Features und Intensität die mittlere Intensität aus.Exportieren Sie die Daten, und wiederholen Sie den Vorgang für Maske 2. Wählen Sie für Maske 3 die gesamte Maske aus, und exportieren Sie die mittlere Intensität. Um die Elektronenkryotomographie Probe vorzubereiten, wachsen sie 48 Stunden lang bei 37 Grad Celsius auf CYE Agrastreptomisumplatten.Setzen Sie die Zellen in Wasser auf eine OD 600 von etwa 0,7 aus. Dann fügen Sie fünf Mikroliter kolloidalen Goldpartikel zu 20 Mikroliter der Zellsuspension hinzu. Glühen entlädt ein löchriges Kohlenstoffgitter und Pipette fünf Mikroliter der Zellmischung darauf.Lassen Sie es für eine Minute stehen. Das Gitter mit Filterpapier bedrucken und mit einem schwerkraftgetriebenen Kolbengerät in flüssigem Ethan einfrieren. Nach dem Einsetzen von Superfolder GFP in das Legionella Pneumophila-Chromosom wurde eine livezellfluoreszierende Mikroskopie durchgeführt, um das fluoreszierende Signal mit dem des elterlichen Superfolders GFP zu vergleichen.Darüber hinaus wurde die Hellfeldmikroskopie verwendet, um den Anteil der Zellen mit einem spezifischen fluoreszierenden Signal zu untersuchen. Nur ein Bruchteil der Zellen, die DotB-Superfolder GFP produzierten, zeigte eine polare Lokalisation des Fusionsproteins. Bei der Charakterisierung der Verteilung des DotB-Fluoreszenzsignals wurde festgestellt, dass die Intensität des DotB-Superfoldergfpbs an den Polen etwa zwei Mal höher war als im Zytosol.Um zu untersuchen, ob die DotB-Superfolder GFP-Polarlokalisation von einem vollständig montierten Sekretionssystem Typ 4 abhängig war, wurden Polaritätswerte von DotB Superfolder GFP für einzelne Zellen in einem wilden Typ und in einem Typ-4-Sekretionssystemmutanten ermittelt. Tatsächlich verschwand die polare Positionierung des DotB-Superordners GFP, als das Dot/ICM-System gelöscht wurde. Dynamische Muster deuteten darauf hin, dass der DotB ATPase in einer dynamischen zytosolischen Population vorhanden war und in einer späten Montagereaktion in das polarlokalisierte Dot/ICM Typ 4-Sekretionssystem rekrutiert wurde.Hochdurchsatz-Kryo-ET wurde verwendet, um das intakte Sekretionssystemgerät Typ 4 in einem Legionella Pneumophila-Stamm zu visualisieren, der DotB-Superfolder GFP exsemitt. Bei der Rekonstruktion der Zelle wurden mehrere Dot/ICM-Maschinen entdeckt, die in die Zellhülle eingebettet waren. Die Gesamtpositionierung von DotB und Superfolder GFP in Bezug auf die intakte Sekretionssystemmaschine Typ 4 wurde ebenfalls ermittelt.Dreidimensionale Oberflächendarstellungen zeigten an, dass sich das Superfolder GFP unterhalb des DotB-Hexamers befindet, der sich als Scheibe an der Basis des zytoplasmatischen ATPase-Komplexes zusammensetzt. Achten Sie beim Versuch dieser Technik darauf, die Stabilität der Fusionsproteine und die Funktionalität des Tag-Sekretionssystems zu bewerten, bevor Sie mit der Bildaufnahme fortfahren. Modellierung und Anpassung können effektive Möglichkeiten sein, die dynamischen Muster und strukturellen Dichten zu analysieren sowie konforme Veränderungen oder die Lokalisierung von Untereinheiten in die Struktur zu bewerten.Dieser Ansatz kann helfen zu verstehen, wie verschiedene Typ-vier geheime Systemkomponenten funktionieren, wie sie innerhalb des größeren Komplexes interagieren und welche Funktionen verschiedene Unterbaugruppen ausführen.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Applying Live Cell Imaging and Cryo-Electron Tomography to Resolve Spatiotemporal Features of the Legionella pneumophila Dot/Icm Secretion System

Determination of Molecular Structures of HIV Envelope Glycoproteins using Cryo-Electron Tomography and Automated Sub-tomogram Averaging

Bestimmung von Molekülstrukturen von HIV Hüllglycoproteine ​​mit Cryo-Elektronen-Tomographie und automatisierte Sub-Tomogramm Averaging

Since its discovery nearly 30 years ago, more than 60 million people have been infected with the human immunodeficiency virus (HIV) (www.usaid.gov). The ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Use of an Optical Trap for Study of Host-Pathogen Interactions for Dynamic Live Cell Imaging

Die Verwendung einer optischen Falle für das Studium der Wirt-Pathogen-Interaktionen für Dynamic Live Cell Imaging

Dynamic live cell imaging allows direct visualization of real-time interactions between cells of the immune system1, 2; however, the lack of spatial and ...

Real-time Live Imaging of T-cell Signaling Complex Formation

Echtzeit-Live-Imaging von T-Zell-Signaling Complex Formation

Protection against infectious diseases is mediated by the immune system 1,2. T lymphocytes are the master coordinators of the immune system, regulating ...

Live Cell Imaging of Alphaherpes Virus Anterograde Transport and Spread

Live Cell Imaging von Alphaherpes Virus Anterograde Transport und Aufstrich

Advances in live cell fluorescence microscopy  techniques, as well as the construction of recombinant viral strains that  express fluorescent fusion ...

Use of Galleria mellonella as a Model Organism to Study Legionella pneumophila Infection

Use of Galleria mellonella as a Model Organism to Study Legionella pneumophila Infection

Die Verwendung von<em&gt; Galleria mellon</em&gt; Als Modellorganismus zum Studium<em&gt; Legionella pneumophila</em&gt; Infektion

Legionella pneumophila, the causative agent of a severe pneumonia named Legionnaires&#39; disease, is an important human pathogen that infects and ...

Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes

Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes

Imaging InlC Sekretion to Cellular-Infektion durch den bakteriellen Erreger untersuchen<em&gt; Listeria monocytogenes</em

Bacterial intracellular  pathogens can be conceived as molecular tools to dissect cellular signaling  cascades due to their capacity to exquisitely ...

Applying an Inducible Expression System to Study Interference of Bacterial Virulence Factors with Intracellular Signaling

Anlegen eines induzierbaren Expression System zu Störungen der bakteriellen Virulenzfaktoren mit Intrazelluläre Signal Studieren

The technique presented here allows one to analyze at which step a target protein, or alternatively a small molecule, interacts with the components of a ...

Legionella pneumophila Outer Membrane Vesicles: Isolation and Analysis of Their Pro-inflammatory Potential on Macrophages

Legionella pneumophila Outer Membrane Vesicles: Isolation and Analysis of Their Pro-inflammatory Potential on Macrophages

Legionella pneumophila der äußeren Membran - Vesikeln: Isolierung und Analyse ihrer Pro-inflammatorische Potential auf Makrophagen

Bacteria are able to secrete a variety of molecules via various secretory systems. Besides the secretion of molecules into the extracellular space or ...

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

Ein neuartiges Feeder-freie System für die Massenproduktion von murinen Natural Killer Cells In Vitro

Natural killer (NK) cells belong to the innate immune system and are a first-line anti-cancer immune defense; however, they are suppressed in the tumor ...

Isolation, Fixation, and Immunofluorescence Imaging of Mouse Adrenal Glands

Isolierung, Fixierung und Immunfluoreszenz Imaging der Maus Nebennieren

Immunofluorescence is a well-established technique for detection of antigens in tissues with the employment of fluorochrome-conjugated antibodies and has ...