Name: applying live cell imaging and cryo-electron tomography to resolve spatiotemporal features of the legionella pneumophila dot/icm secretion system
Uploaded: 2020-03-10T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Applying Live Cell Imaging and Cryo-Electron Tomography to Resolve Spatiotemporal Features of the Legionella pneumophila Dot/Icm Secretion System at JoVE.com

הבירה ו-C.R.R. תמכו ב-NIH (R37AI041699 וR21AI130671). D.P., B.H. ו-J. L תמכו במוסדות הבריאות הלאומיים (R01AI087946 וR01GM107629).

הערה: יש לבצע את כל ההליכים הכרוכים בצמיחה, מניפולציה והדמיה של L. משאבה ברמת בטיחות ביולוגית 2 בהתאם להנחיות המקומיות.
1. החדרת התכנה לתוך כרומוזום L. משאבה באמצעות Allelic Exchange ואסטרטגיית בחירה כפולה (איור 2, איור 3)
<ol><li>שיבוט לתוך החלפת ...

<ol>
	<li>Franco, I. S., Shuman, H. A., Charpentier, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+perplexing+functions+and+surprising+origins+of+Legionella+pneumophila+type+IV+secretion+effectors.">The perplexing functions and surprising origins of Legionella pneumophila type IV secretion effectors.</a> Cellular Microbiology. 11, 1435-1443 (2009).</li><li>Burstein, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-scale+identification+of+Legionella+pneumophila+effectors+using+a+machine+learning+approach.">Genome-scale identification of Legionella pneumophila effectors using a machine learning approach.</a> PLOS Pathogens. 5, 1000508 (2009).</li><li>Ninio, S., Roy, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effector+proteins+translocated+by+Legionella+pneumophila:+strength+in+numbers.">Effector proteins translocated by Legionella pneumophila: strength in numbers.</a> Trends in Microbiology. 15, 372-380 (2007).</li><li>Vogel, J. P., Andrews, H. L., Wong, S. K., Isberg, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conjugative+transfer+by+the+virulence+system+of+Legionella+pneumophila.">Conjugative transfer by the virulence system of Legionella pneumophila.</a> Science. 279, 873-876 (1998).</li><li>Isberg, R. R., O'Connor, T. J., Heidtman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Legionella+pneumophila+replication+vacuole:+making+a+cosy+niche+inside+host+cells.">The Legionella pneumophila replication vacuole: making a cosy niche inside host cells.</a> Nature Reviews Microbiology. 7, 13-24 (2009).</li><li>Roy, C. R., Berger, K. H., Isberg, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Legionella+pneumophila+DotA+protein+is+required+for+early+phagosome+trafficking+decisions+that+occur+within+min+of+bacterial+uptake.">Legionella pneumophila DotA protein is required for early phagosome trafficking decisions that occur within min of bacterial uptake.</a> Molecular Microbiology. 28, 663-674 (1998).</li><li>Archer, K. A., Roy, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MyD88-Dependent+Responses+Involving+Toll-Like+Receptor+2+Are+Important+for+Protection+and+Clearance+of+Legionella+pneumophila+in+a+Mouse+Model+of+Legionnaires'+Disease.">MyD88-Dependent Responses Involving Toll-Like Receptor 2 Are Important for Protection and Clearance of Legionella pneumophila in a Mouse Model of Legionnaires' Disease.</a> Infection and Immunity. 74, 3325-3333 (2006).</li><li>Nagai, H., Kubori, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+IVB+Secretion+Systems+of+Legionella+and+Other+Gram-Negative+Bacteria.">Type IVB Secretion Systems of Legionella and Other Gram-Negative Bacteria.</a> Frontiers in Microbiology. 2, 136 (2011).</li><li>Kubori, T., Nagai, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Type+IVB+secretion+system:+an+enigmatic+chimera.">The Type IVB secretion system: an enigmatic chimera.</a> Current Opinion in Microbiology. 29, 22-29 (2016).</li><li>Chetrit, D., Hu, B., Christie, P. J., Roy, C. R., Liu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+unique+cytoplasmic+ATPase+complex+defines+the+Legionella+pneumophila+type+IV+secretion+channel.">A unique cytoplasmic ATPase complex defines the Legionella pneumophila type IV secretion channel.</a> Nature Microbiology. 3, 678-686 (2018).</li><li>Merriam, J. J., Mathur, R., Maxfield-Boumil, R., Isberg, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+Legionella+pneumophila+fliI+gene:+intracellular+growth+of+a+defined+mutant+defective+for+flagellum+biosynthesis.">Analysis of the Legionella pneumophila fliI gene: intracellular growth of a defined mutant defective for flagellum biosynthesis.</a> Infection and Immunity. 65, 2497-2501 (1997).</li><li>Feeley, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Charcoal-yeast+extract+agar:+primary+isolation+medium+for+Legionella+pneumophila.">Charcoal-yeast extract agar: primary isolation medium for Legionella pneumophila.</a> Journal of Clinical Microbiology. 10, 437-441 (1979).</li><li>Andrews, H. L., Vogel, J. P., Isberg, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+linked+Legionella+pneumophila+genes+essential+for+intracellular+growth+and+evasion+of+the+endocytic+pathway.">Identification of linked Legionella pneumophila genes essential for intracellular growth and evasion of the endocytic pathway.</a> Infection and Immunity. 66, 950-958 (1998).</li><li>Morado, D. R., Hu, B., Liu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+Tomoauto:+A+Protocol+for+High-throughput+Automated+Cryo-electron+Tomography.">Using Tomoauto: A Protocol for High-throughput Automated Cryo-electron Tomography.</a> Journal of Visualized Experiments. (107), e53608 (2016).</li><li>Hu, B., Lara-Tejero, M., Kong, Q., Galan, J. E., Liu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Situ+Molecular+Architecture+of+the+Salmonella+Type+III+Secretion+Machine.">In Situ Molecular Architecture of the Salmonella Type III Secretion Machine.</a> Cell. 168, 1065-1074 (2017).</li><li>Mastronarde, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+electron+microscope+tomography+using+robust+prediction+of+specimen+movements.">Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements.</a> Journal of Structural Biology. 152, 36-51 (2005).</li><li>Zheng, S. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MotionCor2:+anisotropic+correction+of+beam-induced+motion+for+improved+cryo-electron+microscopy.">MotionCor2: anisotropic correction of beam-induced motion for improved cryo-electron microscopy.</a> Nature Methods. 14, 331-332 (2017).</li><li>Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computer+visualization+of+three-dimensional+image+data+using+IMOD.">Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD.</a> Journal of Structural Biology. 116, 71-76 (1996).</li><li>Gilbert, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Iterative+methods+for+the+three-dimensional+reconstruction+of+an+object+from+projections.">Iterative methods for the three-dimensional reconstruction of an object from projections.</a> Journal of Theoretical Biology. 36, 105-117 (1972).</li><li>Radermacher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Weighted+Back-projection+Methods.">Weighted Back-projection Methods.</a> Electron Tomography. , 245-273 (2007).</li><li>Winkler, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tomographic+subvolume+alignment+and+subvolume+classification+applied+to+myosin+V+and+SIV+envelope+spikes.">Tomographic subvolume alignment and subvolume classification applied to myosin V and SIV envelope spikes.</a> Journal of Structural Biology. 165, 64-77 (2009).</li><li>Winkler, H., Taylor, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+marker-free+alignment+with+simultaneous+geometry+determination+and+reconstruction+of+tilt+series+in+electron+tomography.">Accurate marker-free alignment with simultaneous geometry determination and reconstruction of tilt series in electron tomography.</a> Ultramicroscopy. 106, 240-254 (2006).</li><li>Prevost, M. S., Waksman, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-ray+crystal+structures+of+the+type+IVb+secretion+system+DotB+ATPases.">X-ray crystal structures of the type IVb secretion system DotB ATPases.</a> Protein Science. 27, 1464-1475 (2018).</li><li>Miklos, G. L., Rubin, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+the+genome+project+in+determining+gene+function:+insights+from+model+organisms.">The role of the genome project in determining gene function: insights from model organisms.</a> Cell. 86, 521-529 (1996).</li><li>Reyrat, J. M., Pelicic, V., Gicquel, B., Rappuoli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Counterselectable+markers:+untapped+tools+for+bacterial+genetics+and+pathogenesis.">Counterselectable markers: untapped tools for bacterial genetics and pathogenesis.</a> Infection and Immunity. 66, 4011-4017 (1998).</li><li>Yu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Molecule+Studies+in+Live+Cells.">Single-Molecule Studies in Live Cells.</a> Annual Review of Physical Chemistry. 67, 565-585 (2016).</li><li>Stewart, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-electron+microscopy+and+cryo-electron+tomography+of+nanoparticles.">Cryo-electron microscopy and cryo-electron tomography of nanoparticles.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: Nanomedicine and Nanobiotechnology. 9, (2017).</li></ol>

להבהיר את הפונקציות של מערכות הפרשה חיידקית הוא המפתח להבנה מלאה של אינטראקציות מארח הפתוגן. מערכות הפרשה הן מכונות מורכבות שיכולות להזריק חלבונים לתוך תאי מחשב מארחים, ובמקרים מסוימים מקדמים את הקמתה של נישה תת-תאית התומכת בשכפול חיידקי. השיטה הנ ל מספקת כלים חדשים חשובים ללימוד נקודה/Icm...

הלגיונרים האלה משאבה (L. משאבה), הסוכן הפרוטולוגי של מחלת הלגיונרים, שוכן מאגרי מים מתוקים, שם החיידקים מופצים על ידי הדבקה ושכפול בתוך מימיים שחיה בחינם פרוטותים. ל. משאבה הגורמת להתפרצויות של מחלות בבני אדם כאשר האינהלציה של חיידקים aerosolized ממקורות מים ראויים לשתייה מתרחשת. בתאים נגועים, החתרנות של מסלולים מארחים מאפשר L. משאבה המרחפת כדי לעכב התבגרות endocytic של החללים שבהם הוא שוכן לקדם biogenesis של תא התא התומך שכפול חיידקי. תהליך זה מונע על ידי סוג חיידקי מיוחדות ivb הפרשה (T4BSS) המכונה נקודה/Icm והרפרטואר שלה של מעל 300 "אפקטור" חלבונים כי הם translocated לתוך מארח ציטוסול במהלך הזיהום כדי להקל על מניפולציה של פונקציות סלולריות1,2,3,4,5. מוטציות חסרות נקודה תפקודית/Icm מנגנון להיכשל לספק את העריקים לתוך המחשב המארח ציטוסול, פגומים עבור שכפול תאיים, והם avirulent במודלים של בעלי חיים של מחלה6,7.
זנים חיידקיים רבים פיתחו מכונות רב רכיבי מורכבות ודינמיות מאוד הנדרשות לתהליכי זיהום. אחרים T4BSS כמו מערכת נקודה/Icm חיוניים גם עבור שכפול תאיים של פתוגנים חיידקיים כגון Coxiella בורנתיבי ו ריקטסיאלה grylli. למרות T4BSS הקשורים באבולוצאוסיים מערכות מסוג מערכת ה-DNA, אשר מתווכים העברת דנ א והוא יכול לספק רפרטואר מוגבל של חלבונים אפקטור, מערכת נקודה/Icm יש כמעט פי שניים מרכיבי מחשב ומספק מגוון רחב של מכונות. ככל הנראה, התרחבות זו במספר הרכיבים אפשרה למנגנון הנקודה/Icm להכיל ולשלב בקלות מחדש את האפשרות8,9.
השתמשנו לאחרונה טומוגרפיה אלקטרון-אלקטרונים (ההקפאה) כדי לפתור את המבנה של מנגנון נקודה/Icm באתרו והראה כי זה יוצר תא מעטפה מפורש ערוץ המתחבר למתחם cytoplasmic. ניתוח נוסף עולה כי ציטוסולוג ATPase DotB מקורביו עם מערכת נקודה/Icm בקוטב התא L. משאבה מנועי באמצעות אינטראקציות עם מיקוד. גילינו כי DotB מציג את התנועה ציטוסולג בתאי חיידקי ביותר, המציין כי ATPase זה קיים באוכלוסייה cytosolic דינאמי אך גם מקורביו עם נקודה קוטבית/מתחמי Icm. בנוסף, הקבוצה מהווה הרכבה של הקסאמרס הקשורה למכלול הממברנה הפנימי, והיא מצטרפת לבסיס של מתחם cytoplasmic זה. ההרכבה של מורכבות DotB-לעשות אנרגיה יוצר ערוץ cytoplasmic המנחה את הטרנסלוקציה של מצעים דרך T4SS (איור 1)10.
למרות ההתקדמות האחרונה, מעט ידוע על איך מערכת נקודה/Icm פונקציות ואיך כל חלבון מרכיב ליצור מנגנון פעיל8. חשיפת המעגלים הרגולטורים של הנקודה/Icm T4SS היא בסיסית כדי להבין את המנגנונים המולקולריים של אינטראקציות מארח הפתוגן. לכן, אנו דנים כיצד להשתמש במיקרוסקופיה תא לחיות והקפאה-ET כדי לזהות ולאפיין את הרכיבים החיוניים L. משאבה האנטי/Icm המערכת מתויגים עם סופר תיקיית gfp (sfgfp). באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטית כמותי, לוקליזציה קוטבי של DotB יוגדר ברקע סוג פראי או כאשר מערכת הרביעי סוג מחיקת. מיקרוסקופ הזמן לשגות ישמש לכמת הבדלים בלוקליזציה ודינמיקה בין הנקודה/Icm ציטוסולטים ATPases.
היישום המשולב של שתי גישות משלימות כגון הדמיה חיה ו-ההקפאה מספק יתרון לעומת אחרים במערכות מבחנה. שתי השיטות מבוצעות בתאים שלמים ושומרות על הסביבה הטבעית של T4BSS, ובכך מזעור השיבוש של המבנה היליד במהלך הכנת המדגם. כי יתר הביטוי של חלבונים עלול לפגוע הסטואיצ'ימטריה של מכשיר הפרשת, sfGFP fusions מוחזרים באמצעות allelic exchange לתוך כרומוזום הלגיונרים , כך שכל היתוך מקודד בעותק אחד והביטוי מונע על ידי מקדם אנדוגני. הדמיה של fusions מקודד כרומוסומלית מאפשרת לכמת את רמת החלבון המדויקת המתבטאת בנקודת זמן מוגדרת. ל-"הקפאה" יש גם יתרונות רבים לקביעת מבנה מערכות הפרשה. היתרון הבולט ביותר הוא שדגימות ההקפאה מורכבות מתאי שלמים קפואים הישמרו על מתחמי מקומיים בהקשר של ארכיטקטורת תאים חיידקיים. כתוצאה מכך, ההקפאה עשויה להיות עדיפה על גישות הטיהור הביוכימי, אשר לחלץ מתחמי ממברנה עשוי להתפשט חלבונים היקפיים ממנגנון הליבה או לשנות את המבנה הכללי. בנוסף, תיוג חלבון של עניין עם חלבון מגושם כגון sfGFP מוסיף מסה שניתן לגילוי על-ידי ההקפאה והוא יכול לסייע עם מיפוי subcomplexes שונים של המנגנון נקודה/Icm על המבנה המתקבל על ידי המקפיא-ET.
גישה זו היא כלי רב עוצמה לגילוי מידע מבני על מתחמים רב מולקולריים להרכיב קרום התא חיידקי. הפרשנות של מבנים הובהר באמצעות טכניקות אלה תסייע לשדה להבין כיצד T4BSS רכיבי הפונקציה, מדוע רכיבים רבים כל כך נדרשים לפונקציה, איך הרכיבים אינטראקציה בתוך המתחם הגדול, ומה פונקציות אלה בצע הרכבות משנה.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 nm colloidal gold particles</td>
			<td>Aurion</td>
			<td>25486</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100x Plan Apo objective (1.4 NA)</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Activated charcoal</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C5510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agaroze GPG/LMP, low melt</td>
			<td>American bioanalytical</td>
			<td>AB00981</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto dehydrated agar</td>
			<td>BD</td>
			<td>214010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoolSNAP EZ 20 MHz digital monochrome camera</td>
			<td>Photometrics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gene Frame, 1.7x2.8 cm, 125 &#181;L</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AB-0578</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Holey Carbon grid R 2/1 Cu 200 mesh</td>
			<td>Quantifoil</td>
			<td>Q225-CR1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iron(III) nitrate nonahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>216828</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2 Summit camera for cryo-EM</td>
			<td>GATAN</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Cysteine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C7352</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope cover slides 22x22 mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-542B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope cover slides 24x50 mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-545K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides 25x75x1 mm</td>
			<td>Globe Scientific</td>
			<td>1380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SlideBook 6.0</td>
			<td>Intelligent Imaging Innovations</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectra X light engine</td>
			<td>Lumencor</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq 2X Master Mix</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>M0270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Titan Krios</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract</td>
			<td>BD</td>
			<td>212750</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

applying live cell imaging and cryo-electron tomography to resolve spatiotemporal features of the legionella pneumophila dot/icm secretion system

נקודה/Icm הפרשת מערכת של הלגיונרים משאבה האלה היא סוג מורכב IV הפרשה מערכת (T4SS) nanomachine כי לאתר את הקוטב החיידקי ו סכסוכי את המסירה של חלבונים ו-DNA מצעים כדי למקד את התאים, תהליך בדרך כלל דורש קשר ישיר תא אל התא. לאחרונה פתרנו את המבנה של מנגנון נקודה/Icm על ידי טומוגרפיה ההקפאה-אלקטרון (ההקפאה) והראו כי הוא יוצר מעטפת תא מפורש ערוץ המתחבר למתחם cytoplasmic. החלת שתי גישות משלימות לשימור המבנה היליד של הדגימה, מיקרוסקופ פלורסנט בתאי החיים וההקפאה, מאפשר ויזואליזציה באתרו של חלבונים והטמעה של הסטואיצ'ימטריה והעיתוי של ייצור של כל רכיב מחשב ביחס ליחידות אחרות של נקודה/Icm. כדי לחקור את הדרישות עבור מיצוב קוטבי ולאפיין תכונות דינמיות המשויכות T4SS מחשב biogenesis, יש לנו התמזגו הקידוד הגן הירוק של התיקייה הפלואורסצנט חלבון פלורסנט נקודה/Icm ATPase במיקומים מקוריים שלהם על הכרומוזום. השיטה הבאה משלבת מיקרוסקופ קרינה פלואורסצנטית כמותי של תאים חיים והקפאה-ET כדי לכמת לוקליזציה קוטבית, דינמיקה, ומבנה של חלבונים אלה בתאים חיידקיים שלמים. החלת גישות אלה עבור לימוד הלגיונרים האלה משאבה T4SS היא שימושית לאפיון הפונקציה של מערכת נקודה/Icm והוא יכול להיות מותאם ללמוד מגוון רחב של פתוגנים חיידקיים המשתמשים T4SS או סוגים אחרים של מכלולי הפרשה חיידקיים.

שילוב מחדש של הומוולוגי עם מבחר כפול בשני שלבים שימש לבניית ההכנסה המוגדרת של sfGFP. , בצעד הראשון ההזדווגות triparental ורית בוצעה, שם pRK600 מצונת החומר הנפץ של החיידק הקולי של e. COLI MT616 היה מגוייס החיידק e. coli מאמץ עם וקטור ההתאבדות pSR47S המכיל את הגן sfgfp מוקף על ידי שני אזורים הומולוגיים, מקור ?...

Watch this Scientific Journal Video about Applying Live Cell Imaging and Cryo-Electron Tomography to Resolve Spatiotemporal Features of the Legionella pneumophila Dot/Icm Secretion System at JoVE.com

Applying Live Cell Imaging and Cryo-Electron Tomography to Resolve Spatiotemporal Features of the Legionella pneumophila Dot/Icm Secretion System

הדמיה של תאים חיידקיים היא גישה ביולוגיה מערכות מתפתחים התמקדו הגדרת תהליכים סטטיים ודינאמיים המכתיבים את הפונקציה של מכונות macromolecular גדולות. כאן, שילוב של הדמיה תא כמותי לחיות וטומוגרפיה מסוג ההקפאה משמשת לחקר הלגיונרים האלה הפרשת מערכת הפרשה ופונקציות.

החלת הדמיית תאים בשידור חי וטומוגרפיה ממוחשבת כדי לפתור את התכונות הספאטימיות של הלגיונרים האלה מערכת הפרשות

The Dot/Icm secretion system of Legionella pneumophila is a complex type IV secretion system (T4SS) nanomachine that localizes at the bacterial pole and ...

פרוטוקול זה שימושי לאפיון פונקציות ההרכבה של מתחמי הפרשת חיידקים והוא יכול להוביל להבנה בסיסית של המנגנונים המולקולריים הנדרשים לאינטראקציות פתוגן מארח. טכניקה זו משלבת גישות משלימות המשמרות את המבנה הטבעי של המדגם ומאפשרות ומראות הדמיה של קומפלקסים חלבונים בתאי חיידקים שלמים. זה מגביר את ההבנה שלנו של יחסי תפקוד מבניים של מערכות הפרשת חיידקים.שיטה זו יכולה להיות מותאמת לחקר סוגים אחרים של מערכות הפרשה או מתחמים סלולריים אחרים במגוון רחב של מינים חיידקיים. התחל על ידי ביצוע רפידות agarose עבור הדמיה של תאים חיים. הכינו כ-30 מ"ל של תמיסת אגרוז נמסה נמוכה במים וקצו אותו בבקבוק זכוכית במשך כ-90 שניות ומסתחררים אותו מדי פעם עד שהאגרוז מומס לחלוטין.מקום שתי שקופיות זכוכית 22 על 22 על ידי 0.15mm על קצה של 25 על ידי 75 על ידי 1.1mm שקופית זכוכית אחד על גבי השני. לאחר מכן, חסוף שתי שקופיות קטנות יותר בקצה השני. פיפטה על 1 מ"ל של מותך התעורר לתוך השקופית המרכזית בין שתי מגלשות זכוכית העליון ולמקום שקופית גדולה נוספת על גבי אגרוז מותך הקפדה להימנע היווצרות של בועות אוויר.מצננים את השקופיות בארבע מעלות במשך 15 דקות ואז משתמשים באזמל או בסכין גילוח כדי לחתוך בעדינות את הפנקס לריבועים קטנים. תקן מסגרת דבק דו-צדדית על מגלשת זכוכית של 25 על 75 על 1.1 מ"מ והצב מספר רפידות במגלשה. ממיסים חלקה כבדה של לגיונלה Pneumophila ב 1 מ"ל של מים מזוקקים כפולים.ואז מערבולת ופיגט 2-3 מיקרוליטרים של הדילול על הרפידות. מניחים בעדינות כיסוי 58 על 24 על 0.15 מ"מ מעל מסגרת דבק. בחר תאים להדמיה באמצעות תאורת שדה בהירה.לאחר מכן, בחלון הלכידה של תוכנת המיקרוסקופ, כוונן את ה- ND ל- 180 ואת התאם לשניים על שניים. השתמש בערוץ 488 ננומטר כדי לחשוף את המדגם עבור 500 עד 1000 אלפיות שנייה ולאמת את הספציפיות של הפלואורסצנטיות על ידי הדמיה לגיונלה Pneumophila untagged עם אותם פרמטרים. לכמת את הקוטביות, התאימו את ניגודיות התמונה כך שהחיידקים יהיו גלויים בבירור.לאחר מכן הגדל את אזור העניין ולהשתמש בכלי האזור כדי למקם מלבן 0.25 על 1.3 מיקרומטר החל בקוטב ולהרחיב לתוך הציטופלסמה ולוודא כי המלבן נשאר בתוך גבולות החיידקים. סמן לפחות 200 חיידקים וצור מסכות באמצעות האזור כדי להסוות כפתור בתפריט הניתוח. לחצו על סטטיסטיקת המסיכה ובחרו עצם תחת טווח מסיכה.לאחר מכן סמן עוצמה ושונות ממוצעות תחת תכונות ועוצמה. יצא את הנתונים כקובץ טקסט ולהשתמש ביישום הגיליון האלקטרוני כדי לחשב את ציוני הקוטביות של כל חיידק כיחס בין השונות לבין העוצמה הממוצעת. עבור יישומי תפוקה גבוהה השתמש במיקרוסקופיה של ניגודיות פנים כדי להשיג תמונות ערוץ כפול.הקפד לבחור שדות תצוגה שבהם החיידקים מופרדים לחלוטין. לאחר מכן, התאימו את ניגודיות ערוץ הפנים של התמונה לרמה שבה החיידקים נראים בבירור. פתחו את תמונת הערוץ הכפול וה הפעלו את חלון יצירת מסיכת המקטע.התאימו את הסף המתאים ולאחר מכן הסירו את העצמים הקטנים בלחיצה על לחצן 'הגדר אובייקטים' והתאמת הגודל המינימלי ל- 100 פיקסלים. תחת מסיכת עידון, בחר להסיר עצמים בקצוות ומסיכות נפרדות של חיידקים הסמוכים זה לזה. לכימות הדינמיקה של חלבוני ההיתוך, פתחו את חלון לכידת התמונה וסמן את דעך הזמן.הזן שתיים בתיבה מספר נקודות זמן. לרכוש שתי תמונות מוצלחות של לגיונלה Pneumophila להביע את החלבון פלואורסצנטי של עניין. התאימו את חדות התמונה עד שהתאים יהיו גלויים בבירור.לאחר מכן השתמש בכלי האזור כדי למקם ריבוע מיקרומטר של 0.25 על 0.25 באמצע לפחות 400 תאים. לאחר מכן, השתמשו באזור למסיכה בתפריט 'ניתוח' ליצירת מסיכה של ריבועים מעניינים. צרו מסיכה ריקה חדשה ולהשתמש בכלי הפיקסלים לסי סימון כל אזור התא של לפחות 25 תאים אקראיים.צרו מסיכה נוספת ולהשתמש בכלי המברשת הגדול לסי סימון אזורים בין התאים. לבסוף, בחרו סטטיסטיקת מסיכה ודאו שהעצם נבחר תחת טווח מסיכה למסיכה אחת. תחת תכונות ועוצמה, בחר בעוצמה ממוצעת.יצא את הנתונים וחזור על התהליך עבור מסיכה 2. למסיכה 3, בחרו בכל המסיכה וייצאו את העוצמה הממוצעת. כדי להכין את דגימת קריוטומוגרפיה אלקטרונים, לגדל חלקה כבדה של לגיונלה Pneumophila על CYE Agrastreptomisum צלחות במשך 48 שעות ב 37 מעלות צלזיוס.תן שימוש חוזר בתאים במים ל- OD 600 של כ- 0.7. לאחר מכן להוסיף חמישה microliters של חלקיקי זהב קולואידי ל 20 microliters של ההשעיה התא. זוהר לפרוק רשת פחמן חורי פיפטה חמישה microliters של תערובת התא על זה.תן לזה לעמוד לדקה אחת. תצלום את הרשת עם נייר סינון ותקפיא אותה באתן נוזלי באמצעות מנגנון בוכנה מונחה כבידה. לאחר החדרת GFP superfolder לתוך כרומוזום לגיונלה Pneumophila, מיקרוסקופיה פלואורסצנטי תא חי בוצעה כדי להשוות את האות פלואורסצנטי עם זה של זן שלילי GFP superfolder ההורים.בנוסף, נעשה שימוש במיקרוסקופיה של שדה בהיר כדי לבחון את שיעור התאים עם אות פלואורסצנטי ספציפי. רק חלק קטן מהתאים שייצרו את GFP של תיקיית העל DotB הציג לוקליזציה קוטבית של חלבון ההיתוך. כאשר אפיינו את התפלגות האות הפלואורסצנטי של DotB, נמצא כי עוצמת ה- GFP של סופרפליפר DotB בקטבים הייתה גבוהה פי שניים בערך מאשר בציטוסול.כדי לחקור אם לוקליזציה קוטבית GFP של DotB הייתה תלויה במערכת הפרשת סוג 4 שהורכבה במלואה, נקבעו ציוני קוטביות של GFP של תיקיית-על DotB עבור תאים בודדים בסוג פראי, ובמוטנט מערכת הפרשות מסוג 4. ואכן, מיקום הקוטב של DotB superfolder GFP נעלם כאשר מערכת Dot / ICM נמחקה. דפוסים דינמיים הצביעו על כך שה- DotB ATPase היה נוכח באוכלוסייה ציטוסולית דינמית וגויס למערכת הפרשת דוט/ICM מקוטבת מסוג 4 בתגובת הרכבה בשלב מאוחר.cryo-ET תפוקה גבוהה שימש כדי לדמיין את מנגנון מערכת הפרשת סוג ארבע שלם במתח לגיונלה Pneumophila המבטא DotB superfolder GFP. שחזור התא חשף מכונות Dot/ICM מרובות המוטבעות במעטפת התא. המיקום הכולל של DotB ו GFP superfolder ביחס לסוג שלם ארבע מכונת מערכת הפרשה נקבעה גם.עיבודי משטח תלת מימדיים הצביעו על כך ש- GFP של תיקיית העל ממוקם מתחת להקסמר DotB, אשר מתכנס כדיסק בבסיס קומפלקס ATPase הציטופלסמי. בעת ניסיון טכניקה זו, הקפד להעריך את היציבות של חלבוני ההיתוך ואת הפונקציונליות של מערכת הפרשת התגים לפני שתמשיך לרכישת תמונה. מידול והתאמה יכולים להיות דרכים יעילות לנתח את הדפוסים הדינמיים ואת הצפיפות המבנית, כמו גם להערכת שינויים קונפורמיים או לוקליזציה של תת-יוניות לתוך המבנה.גישה זו יכולה לסייע בהבנת אופן הפעולה של רכיבי מערכת סודיים מסוג ארבע שונים, כיצד הם מקיימים אינטראקציה בתוך המורכבות הגדולה יותר ומהן הפונקציות שפונקציות של תתי-קומפלקסים שונים מבצעות.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Applying Live Cell Imaging and Cryo-Electron Tomography to Resolve Spatiotemporal Features of the Legionella pneumophila Dot/Icm Secretion System

Determination of Molecular Structures of HIV Envelope Glycoproteins using Cryo-Electron Tomography and Automated Sub-tomogram Averaging

קביעת מבנים מולקולריים של גליקופרוטאינים HIV מעטפה באמצעות אלקטרונים cryo-טומוגרפיה ו ממוצעים אוטומטי תת tomogram

Since its discovery nearly 30 years ago, more than 60 million people have been infected with the human immunodeficiency virus (HIV) (www.usaid.gov). The ...

Use of an Optical Trap for Study of Host-Pathogen Interactions for Dynamic Live Cell Imaging

השימוש מלכודת אופטית לחקר מארח הפתוגן אינטראקציות עבור הדמיה דינמי תא חי

Dynamic live cell imaging allows direct visualization of real-time interactions between cells of the immune system1, 2; however, the lack of spatial and ...

Real-time Live Imaging of T-cell Signaling Complex Formation

הדמית חיה בזמן אמת של T-תא איתות גיבוש קומפלקס

Protection against infectious diseases is mediated by the immune system 1,2. T lymphocytes are the master coordinators of the immune system, regulating ...

Live Cell Imaging of Alphaherpes Virus Anterograde Transport and Spread

הדמיה של תא חי התחבורה אנטרוגרדית וירוס Alphaherpes ומורחים

Advances in live cell fluorescence microscopy  techniques, as well as the construction of recombinant viral strains that  express fluorescent fusion ...

Use of Galleria mellonella as a Model Organism to Study Legionella pneumophila Infection

Use of Galleria mellonella as a Model Organism to Study Legionella pneumophila Infection

שימוש<em&gt; Mellonella Galleria</em&gt; כאורגניזם מודל לחקר<em&gt; הלגיונלה pneumophila</em&gt; זיהום

Legionella pneumophila, the causative agent of a severe pneumonia named Legionnaires&#39; disease, is an important human pathogen that infects and ...

Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes

Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes

ההדמיה InlC הפרשה לחקר זיהום נייד על ידי פתוגן החיידקים<em&gt; חיידקי ליסטריה</em

Bacterial intracellular  pathogens can be conceived as molecular tools to dissect cellular signaling  cascades due to their capacity to exquisitely ...

Applying an Inducible Expression System to Study Interference of Bacterial Virulence Factors with Intracellular Signaling

יישום מערכת ביטוי עין מתנהלת לחקר הפרעות של גורמים בקטריאלי ארסיות עם איתות תאיים

The technique presented here allows one to analyze at which step a target protein, or alternatively a small molecule, interacts with the components of a ...

Legionella pneumophila Outer Membrane Vesicles: Isolation and Analysis of Their Pro-inflammatory Potential on Macrophages

Legionella pneumophila Outer Membrane Vesicles: Isolation and Analysis of Their Pro-inflammatory Potential on Macrophages

הלגיונלה pneumophila החיצון ממברנה שלפוחית: בידוד ניתוח של פוטנציאל פרו-דלקתיים שלהם על המקרופאגים

Bacteria are able to secrete a variety of molecules via various secretory systems. Besides the secretion of molecules into the extracellular space or ...

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

הרומן מזין ללא מערכת לייצור המוני של תאים רוצח טבעי מאתר במבחנה

Natural killer (NK) cells belong to the innate immune system and are a first-line anti-cancer immune defense; however, they are suppressed in the tumor ...

Isolation, Fixation, and Immunofluorescence Imaging of Mouse Adrenal Glands

בידוד, קיבוע, Immunofluorescence הדמיה של העכבר בלוטת יותרת הכליה

Immunofluorescence is a well-established technique for detection of antigens in tissues with the employment of fluorochrome-conjugated antibodies and has ...