Name: applying live cell imaging and cryo-electron tomography to resolve spatiotemporal features of the legionella pneumophila dot/icm secretion system
Uploaded: 2020-03-10T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Applying Live Cell Imaging and Cryo-Electron Tomography to Resolve Spatiotemporal Features of the Legionella pneumophila Dot/Icm Secretion System at JoVE.com

D.C.とC.R.R.はNIH(R37AI041699およびR21AI130671)によってサポートされました。D.P.、B.H.、J.Lは国立衛生研究所(R01AI087946およびR01GM107629)によって支援されました。

注:L.肺炎球菌の成長、操作、およびイメージングを含むすべての手順は、局所的なガイドラインに従って生物学的安全レベル2の実験室で行われるべきです。
1. アレル交換と二重選択戦略を用いたL.気球菌染色体へのsfGFPの挿入(図2、図3)
<ol><li>遺伝子置換ベクターpSR47S11にクローンを作成し、次?...

<ol>
	<li>Franco, I. S., Shuman, H. A., Charpentier, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+perplexing+functions+and+surprising+origins+of+Legionella+pneumophila+type+IV+secretion+effectors.">The perplexing functions and surprising origins of Legionella pneumophila type IV secretion effectors.</a> Cellular Microbiology. 11, 1435-1443 (2009).</li><li>Burstein, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-scale+identification+of+Legionella+pneumophila+effectors+using+a+machine+learning+approach.">Genome-scale identification of Legionella pneumophila effectors using a machine learning approach.</a> PLOS Pathogens. 5, 1000508 (2009).</li><li>Ninio, S., Roy, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effector+proteins+translocated+by+Legionella+pneumophila:+strength+in+numbers.">Effector proteins translocated by Legionella pneumophila: strength in numbers.</a> Trends in Microbiology. 15, 372-380 (2007).</li><li>Vogel, J. P., Andrews, H. L., Wong, S. K., Isberg, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conjugative+transfer+by+the+virulence+system+of+Legionella+pneumophila.">Conjugative transfer by the virulence system of Legionella pneumophila.</a> Science. 279, 873-876 (1998).</li><li>Isberg, R. R., O'Connor, T. J., Heidtman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Legionella+pneumophila+replication+vacuole:+making+a+cosy+niche+inside+host+cells.">The Legionella pneumophila replication vacuole: making a cosy niche inside host cells.</a> Nature Reviews Microbiology. 7, 13-24 (2009).</li><li>Roy, C. R., Berger, K. H., Isberg, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Legionella+pneumophila+DotA+protein+is+required+for+early+phagosome+trafficking+decisions+that+occur+within+min+of+bacterial+uptake.">Legionella pneumophila DotA protein is required for early phagosome trafficking decisions that occur within min of bacterial uptake.</a> Molecular Microbiology. 28, 663-674 (1998).</li><li>Archer, K. A., Roy, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MyD88-Dependent+Responses+Involving+Toll-Like+Receptor+2+Are+Important+for+Protection+and+Clearance+of+Legionella+pneumophila+in+a+Mouse+Model+of+Legionnaires'+Disease.">MyD88-Dependent Responses Involving Toll-Like Receptor 2 Are Important for Protection and Clearance of Legionella pneumophila in a Mouse Model of Legionnaires' Disease.</a> Infection and Immunity. 74, 3325-3333 (2006).</li><li>Nagai, H., Kubori, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+IVB+Secretion+Systems+of+Legionella+and+Other+Gram-Negative+Bacteria.">Type IVB Secretion Systems of Legionella and Other Gram-Negative Bacteria.</a> Frontiers in Microbiology. 2, 136 (2011).</li><li>Kubori, T., Nagai, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Type+IVB+secretion+system:+an+enigmatic+chimera.">The Type IVB secretion system: an enigmatic chimera.</a> Current Opinion in Microbiology. 29, 22-29 (2016).</li><li>Chetrit, D., Hu, B., Christie, P. J., Roy, C. R., Liu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+unique+cytoplasmic+ATPase+complex+defines+the+Legionella+pneumophila+type+IV+secretion+channel.">A unique cytoplasmic ATPase complex defines the Legionella pneumophila type IV secretion channel.</a> Nature Microbiology. 3, 678-686 (2018).</li><li>Merriam, J. J., Mathur, R., Maxfield-Boumil, R., Isberg, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+Legionella+pneumophila+fliI+gene:+intracellular+growth+of+a+defined+mutant+defective+for+flagellum+biosynthesis.">Analysis of the Legionella pneumophila fliI gene: intracellular growth of a defined mutant defective for flagellum biosynthesis.</a> Infection and Immunity. 65, 2497-2501 (1997).</li><li>Feeley, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Charcoal-yeast+extract+agar:+primary+isolation+medium+for+Legionella+pneumophila.">Charcoal-yeast extract agar: primary isolation medium for Legionella pneumophila.</a> Journal of Clinical Microbiology. 10, 437-441 (1979).</li><li>Andrews, H. L., Vogel, J. P., Isberg, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+linked+Legionella+pneumophila+genes+essential+for+intracellular+growth+and+evasion+of+the+endocytic+pathway.">Identification of linked Legionella pneumophila genes essential for intracellular growth and evasion of the endocytic pathway.</a> Infection and Immunity. 66, 950-958 (1998).</li><li>Morado, D. R., Hu, B., Liu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+Tomoauto:+A+Protocol+for+High-throughput+Automated+Cryo-electron+Tomography.">Using Tomoauto: A Protocol for High-throughput Automated Cryo-electron Tomography.</a> Journal of Visualized Experiments. (107), e53608 (2016).</li><li>Hu, B., Lara-Tejero, M., Kong, Q., Galan, J. E., Liu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Situ+Molecular+Architecture+of+the+Salmonella+Type+III+Secretion+Machine.">In Situ Molecular Architecture of the Salmonella Type III Secretion Machine.</a> Cell. 168, 1065-1074 (2017).</li><li>Mastronarde, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+electron+microscope+tomography+using+robust+prediction+of+specimen+movements.">Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements.</a> Journal of Structural Biology. 152, 36-51 (2005).</li><li>Zheng, S. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MotionCor2:+anisotropic+correction+of+beam-induced+motion+for+improved+cryo-electron+microscopy.">MotionCor2: anisotropic correction of beam-induced motion for improved cryo-electron microscopy.</a> Nature Methods. 14, 331-332 (2017).</li><li>Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computer+visualization+of+three-dimensional+image+data+using+IMOD.">Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD.</a> Journal of Structural Biology. 116, 71-76 (1996).</li><li>Gilbert, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Iterative+methods+for+the+three-dimensional+reconstruction+of+an+object+from+projections.">Iterative methods for the three-dimensional reconstruction of an object from projections.</a> Journal of Theoretical Biology. 36, 105-117 (1972).</li><li>Radermacher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Weighted+Back-projection+Methods.">Weighted Back-projection Methods.</a> Electron Tomography. , 245-273 (2007).</li><li>Winkler, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tomographic+subvolume+alignment+and+subvolume+classification+applied+to+myosin+V+and+SIV+envelope+spikes.">Tomographic subvolume alignment and subvolume classification applied to myosin V and SIV envelope spikes.</a> Journal of Structural Biology. 165, 64-77 (2009).</li><li>Winkler, H., Taylor, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+marker-free+alignment+with+simultaneous+geometry+determination+and+reconstruction+of+tilt+series+in+electron+tomography.">Accurate marker-free alignment with simultaneous geometry determination and reconstruction of tilt series in electron tomography.</a> Ultramicroscopy. 106, 240-254 (2006).</li><li>Prevost, M. S., Waksman, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-ray+crystal+structures+of+the+type+IVb+secretion+system+DotB+ATPases.">X-ray crystal structures of the type IVb secretion system DotB ATPases.</a> Protein Science. 27, 1464-1475 (2018).</li><li>Miklos, G. L., Rubin, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+the+genome+project+in+determining+gene+function:+insights+from+model+organisms.">The role of the genome project in determining gene function: insights from model organisms.</a> Cell. 86, 521-529 (1996).</li><li>Reyrat, J. M., Pelicic, V., Gicquel, B., Rappuoli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Counterselectable+markers:+untapped+tools+for+bacterial+genetics+and+pathogenesis.">Counterselectable markers: untapped tools for bacterial genetics and pathogenesis.</a> Infection and Immunity. 66, 4011-4017 (1998).</li><li>Yu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Molecule+Studies+in+Live+Cells.">Single-Molecule Studies in Live Cells.</a> Annual Review of Physical Chemistry. 67, 565-585 (2016).</li><li>Stewart, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-electron+microscopy+and+cryo-electron+tomography+of+nanoparticles.">Cryo-electron microscopy and cryo-electron tomography of nanoparticles.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: Nanomedicine and Nanobiotechnology. 9, (2017).</li></ol>

細菌分泌系の機能を解明することは、宿主と病原体の相互作用を完全に理解する鍵です。分泌系は、エフェクタータンパク質を宿主細胞に注入できる複雑な機械であり、場合によっては細菌複製をサポートする細胞内ニッチの確立を促進する。上記の方法は、呼吸器病原体レジオネラ肺炎球菌のDot/Icm分泌システムを研究するための重要な新しいツールを提供し、病原性に不可欠なエフ...

レジオネラ菌(L.肺炎球菌)は、レジオネラ症の病因である淡水貯留層に生息し、水生自由水泳原生動物の中で細菌が感染して複製することによって増殖する。L. 気球菌は、飲料水源からのエアロゾル化細菌の吸入が発生すると、ヒトで病気の発生を引き起こす。感染した細胞では、宿主経路の転覆により、L.肺炎球菌は、それが存在する液胞のエンドサイト成熟を遅らせ、細菌複製をサポートする細胞コンパートメントの生生生成を促進することができる。このプロセスは、Dot/Icmとして知られている特殊な細菌タイプIVB分泌システム(T4BSS)と、感染中に宿主サイトゾルに転化される300以上の「エフェクター」タンパク質のレパートリーによって駆動され、細胞機能1、2、3、4、5の操作を容易にする。機能的なDot/Icm装置を欠いている変異体は、宿主サイトゾルにエフェクターを送達できず、細胞内複製に欠陥があり、疾患6,7の動物モデルにおいてアビリエントである。
多くの細菌種は、感染プロセスに必要な非常に複雑で動的なマルチコンポーネントマシンを開発してきました。Dot/Icmシステムのような他のT4BSSも、コクシエラ・ブルネティやリケッチエラ・グリリなどの細菌病原体の細胞内複製に不可欠である。T4BSSは、DNAの伝達を媒介し、エフェクタータンパク質の限られたレパートリーを提供できる原型型IVA系と進化的に関連していますが、Dot/Icmシステムは機械成分のほぼ2倍を有し、多種多様なエフェクターを提供します。おそらく、コンポーネント数のこの拡大は、Dot / Icm装置が新しいエフェクタを容易に8,9に収容し、統合することを可能にしました。
我々は最近、クライオ電子断層撮影(cryo-ET)を使用して、その場でドット/Icm装置の構造を解き、細胞質複合体に接続する細胞エンベロープスパンチャネルを形成することを示した。さらなる分析は、細胞体ATPase DotOとの相互作用を通じて、細胞内のTPCとの関連がL.ニューモフィラ細胞極のドット/Icm系と関連することを明らかにした。DotBは、ほとんどの細菌細胞に細胞間運動を示すことを発見し、このATPaseが動的な細胞構造集団に存在するが、極性ドット/Icm複合体にも関連していることを示している。さらに、DotOは、内膜複合体に関連するDotOダイマーの六方体集合体を形成し、この細胞質複合体の基部にDotBヘキサマーが結合する。DotB-DotOエネルギー複合体のアセンブリは、T4SS(図1)10を介して基板の転座を指示する細胞質チャネルを作成する。
これらの最近の進歩にもかかわらず、Dot/Icmシステムがどのように機能し、各タンパク質がどのように組み立てて活性装置8を形成するかについてはほとんど知られていない。Dot/Icm T4SSの制御回路を明らかにすることは、宿主と病原体の相互作用の分子メカニズムを理解する上で重要です。そこで、スーパーフォルダGFP(sfGFP)でタグ付けされた必須L.肺炎球菌ドット/Icmシステムコンポーネントを検出し、特徴付けるために、生細胞顕微鏡とcryo-ETを使用する方法について説明します。定量的蛍光顕微鏡を用いて、DotBの極地局在化は野生型のバックグラウンドで、またはタイプIV系が削除されたときに定義される。タイムラプス顕微鏡は、ドット/Icm細胞体ATPases間の局在およびダイナミクスの違いを定量化するために使用されます。
ライブイメージングやクライオETなどの2つの相補的アプローチを組み合わせることで、他のインビトロシステムと比較して利点があります。両方の方法は無傷の細胞で行われ、T4BSSの自然環境を維持し、サンプル調製中のネイティブ構造の破壊を最小限に抑えます。タンパク質の過剰発現は分泌装置の染色法を損なう可能性があるため、sfGFP融合は、各融合が単一コピーでコードされ、発現が内因性プロモーターによって駆動されるように、レジオネラ染色体へのアレジオン交換を介して返される。染色体でコード化された融合の可視化により、定義された時点で発現しているタンパク質の正確なレベルを定量化することができます。Cryo-ETには、分泌システムの構造を決定するための多くの利点があります。最も顕著な利点は、cryo-ETサンプルが細菌細胞アーキテクチャの文脈で天然複合体を保存する凍結された無傷の細胞で構成されているということです。その結果、cryo-ETは、膜複合体を抽出し、コア装置から末梢タンパク質を取り除くか、または全体的な構造を変更することができる生化学的精製アプローチよりも好ましい場合があります。さらに、関心のあるタンパク質にsfGFPなどのかさばるタンパク質をタグ付けすると、cryo-ETによって検出可能な質量が追加され、Dot/Icm装置の異なるサブコンプレックスをcryo-ETによって得られた構造にマッピングするのに役立ちます。
このアプローチは、細菌細胞膜に組み立てる多分子複合体に関する構造情報を明らかにするための強力なツールです。これらの手法を用いて解明された構造の解釈は、T4BSS コンポーネントの機能、機能に必要なコンポーネントの数、コンポーネントの相互作用、およびこれらの機能を理解するのに役立ちます。サブアセンブリが実行されます。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 nm colloidal gold particles</td>
			<td>Aurion</td>
			<td>25486</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100x Plan Apo objective (1.4 NA)</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Activated charcoal</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C5510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agaroze GPG/LMP, low melt</td>
			<td>American bioanalytical</td>
			<td>AB00981</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto dehydrated agar</td>
			<td>BD</td>
			<td>214010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoolSNAP EZ 20 MHz digital monochrome camera</td>
			<td>Photometrics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gene Frame, 1.7x2.8 cm, 125 &#181;L</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AB-0578</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Holey Carbon grid R 2/1 Cu 200 mesh</td>
			<td>Quantifoil</td>
			<td>Q225-CR1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iron(III) nitrate nonahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>216828</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2 Summit camera for cryo-EM</td>
			<td>GATAN</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Cysteine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C7352</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope cover slides 22x22 mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-542B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope cover slides 24x50 mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-545K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides 25x75x1 mm</td>
			<td>Globe Scientific</td>
			<td>1380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SlideBook 6.0</td>
			<td>Intelligent Imaging Innovations</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectra X light engine</td>
			<td>Lumencor</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq 2X Master Mix</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>M0270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Titan Krios</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract</td>
			<td>BD</td>
			<td>212750</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

applying live cell imaging and cryo-electron tomography to resolve spatiotemporal features of the legionella pneumophila dot/icm secretion system

レジオネラ・ニューモフィルのドット/Icm分泌系は、細菌極で局所化し、タンパク質およびDNA基質を標的細胞に送達する複雑なIV分泌系(T4SS)ナノマシンであり、一般的に直接細胞間接触を必要とするプロセスである。我々は最近、凍結電子断層撮影(cryo-ET)によってドット/Icm装置の構造を解明し、細胞質複合体に接続する細胞エンベロープスパンチャネルを形成することを示した。生きた細胞とcryo-ETにおける蛍光顕微鏡法を用いて、試料のネイティブ構造を保存する2つの相補的アプローチを適用することで、タンパク質の可視化と、他のDot/Icmサブユニットに対する各機械成分の生産時期と同化をその時点で可能にします。極位置の要件を調べ、T4SS機械生物発生に関連する動的特徴を特徴付けるために、染色体上のネイティブ位置でスーパーフォルダグリーン蛍光タンパク質をドット/Icm ATPase遺伝子にコードする遺伝子を融合しました。以下の方法は、生体細胞の定量的蛍光顕微鏡とcryo-ETを統合し、これらのタンパク質の細胞内の極地の局在、ダイナミクス、および構造を定量化します。レジオネラ・ニューモフィラT4SSを研究するためにこれらのアプローチを適用することは、ドット/Icmシステムの機能を特徴付けるために有用であり、T4SSまたは他のタイプの細菌分泌複合体を利用する多種多様な細菌病原体を研究するために適応することができる。

2段階で二重選択との相同組換えがsfGFPの定義された挿入を構築するために使用された。第1のステップでは、大腸菌ヘルパー株MT616からのpRK600共役プラスミド(IncPプラスミド)を2つの相同領域に横たわるsfGFP遺伝子を含む自殺ベクターpSR47Sを用いてドナー大腸菌株に動員したトライペアレンタル交配を行った。次に、pRK600からの共役系は、pSR47S誘導体をL.肺炎球菌</em...

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Applying Live Cell Imaging and Cryo-Electron Tomography to Resolve Spatiotemporal Features of the Legionella pneumophila Dot/Icm Secretion System

細菌細胞のイメージングは、大きな高分子機械の機能を決定する静的および動的プロセスの定義に焦点を当てた新しいシステム生物学アプローチです。ここでは、定量的ライブ細胞イメージングとクライオ電子断層撮影の統合により、レジオネラ菌型肺炎球体系IV型分泌系のアーキテクチャと機能を研究しています。

レジオネラ肺球菌ドット/Icm分泌系の空間的特徴を解決するためのライブ細胞イメージングとクライオ電子断層撮影の適用

The Dot/Icm secretion system of Legionella pneumophila is a complex type IV secretion system (T4SS) nanomachine that localizes at the bacterial pole and ...

このプロトコルは、細菌分泌複合体の組立機能を特徴付けるのに有用であり、宿主病原体相互作用に必要な分子機構の基本的な理解につながる可能性がある。この技術は、サンプルのネイティブ構造を維持し、無傷の細菌細胞内のタンパク質複合体の可視化を可能にし、見ることができる補完的なアプローチを統合します。細菌分泌系の構造機能関係についての理解を深めます。この方法は、多種多様な細菌種における他のタイプの分泌系または他の細胞複合体を研究するために適応することができる。生細胞イメージング用のアガロースパッドを作ることから始めます。約30mLの1%低溶融アガロース溶液を水中に調製し、ガラスフラスコで約90秒間マイクロ波で、アガロースが完全に溶解するまで時折渦巻きます。22×22×0.15mmのガラススライドを25×75×1.1mmガラススライドの端に置きます。次に、もう一方の端に小さいスライドを 2 つ重ねて積み重ねます。溶融アガロースの約1mLのピペットは、2つの上のガラススライドの間の中央スライドに入り、溶融アガロースの上に別の大きなスライドを置き、気泡の形成を避けることを確認した。スライドを摂氏4度で15分間冷やし、メスまたはカミソリの刃を使ってパッドを小さな正方形にそっと切ります。25×75×1.1mmのガラススライドに両面接着フレームを固定し、スライド上に複数のパッドを置きます。レジオネラ・ニューモフィラの重いパッチを1mLの二重蒸留水に溶かします。次いで、渦とピペットを2~3マイクロリットルの希釈液をパッドに入れる。58 x 24 x 0.15 mm のカバースリップを接着剤フレームの上にそっと置きます。明視野照明を使用してイメージングするセルを選択します。次に、顕微鏡のソフトウェアのキャプチャウィンドウで、NDを180に、ビニングを2つずつ調整します。488ナノメートルのチャネルを使用して、サンプルを500〜1000ミリ秒に曝露し、同じパラメータでタグなしレジオネラ肺炎球菌をイメージングして蛍光の特異性を検証します。極性を定量化するには、画像のコントラストを調整して、細菌がはっきりと見えるようにします。次に、対象領域を拡大し、領域ツールを使用して、0.25 ~1.3 マイクロメートルの長方形を極から始めて細胞質に伸ばし、長方形が細菌の境界内に残っていることを確認します。少なくとも200個の細菌をマークし、分析メニューのマスクボタンに領域を使用してマスクを作成します。マスク統計をクリックし、マスクスコープの下のオブジェクトを選択します。次に、特徴と強度の下で平均強度と分散をマークします。データをテキストファイルとしてエクスポートし、スプレッドシートアプリケーションを使用して、各細菌の極性スコアを分散と平均強度の比率として計算します。高スループットアプリケーションでは、両面コントラスト顕微鏡を使用してデュアルチャンネル画像を取得します。細菌が完全に分離されている視野を選択してください。次に、画像の顔チャネルコントラストを、細菌がはっきりと見えるレベルに調整します。デュアルチャンネルイメージを開き、セグメントマスク作成ウィンドウを起動します。適切なしきい値を調整し、[オブジェクトの定義] ボタンをクリックして最小サイズを 100 ピクセルに調整して、小さなオブジェクトを削除します。[マスクをリファイン]で、[エッジ オブジェクトを削除する]を選択し、互いに隣接するバクテリアのマスクを分離します。融合タンパク質のダイナミクスを定量化するには、画像キャプチャウィンドウを開き、時間経過をマークします。[時間ポイント数]ボックスに 2 を入力します。目的の蛍光タンパク質を発現するレジオネラ・ニューモフィラの2つの成功した画像を取得します。セルがはっきりと見えるまで、画像のコントラストを調整します。次に、領域ツールを使用して、少なくとも 400 個のセルの中央に 0.25 0.25 マイクロメートルの正方形を配置します。次に、分析メニューの「マスクする領域」ボタンを使用して、対象となる正方形のマスクを作成します。新しい空のマスクを作成し、ピクセルツールを使用して、少なくとも 25 個のランダムセルのセル領域全体をマークします。別のマスクを作成し、大きなブラシツールを使用してセル間の領域をマークします。最後に、マスク統計を選択し、マスク 1 のマスク スコープの下でオブジェクトが選択されていることを確認します。[フィーチャと強度] で、平均強度を選択します。データをエクスポートし、マスク 2 のプロセスを繰り返します。マスク 3 の場合、マスク全体を選択し、平均強度を書き出します。電子凍結造影サンプルを調製するには、摂氏37度で48時間CYEアグラスレプトミズムプレート上のレジオネラ肺炎球菌の重いパッチを成長させます。水中の細胞を約0.7のOD 600に再懸濁する。次に、コロイド状金粒子を5マイクロリットルの細胞懸濁液の20マイクロリットルに加える。グローは、その上に細胞混合物の穴のあいた炭素グリッドとピペット5マイクロリットルを排出します。1分間放置します。フィルターペーパーでグリッドをブロットし、重力駆動プランジャー装置を使用して液体エタンで凍結します。スーパーフォルダGFPをレジオネラ・ニューモフィラ染色体に挿入した後、生細胞蛍光顕微鏡を行い、親のスーパーフォルダーGFP陰性株の蛍光シグナルとを比較した。また、明視野顕微鏡を用いて、特定の蛍光シグナルを有する細胞の割合を調べた。DotBスーパーフォルダGFPを産生した細胞のほんの一部だけが、融合タンパク質の極地局在化を示した。DotB蛍光信号の分布を特徴付けると、極部におけるDotBスーパーフォルダGFPの強度は、サイトゾルの約2倍高いことがわかった。DotBスーパーフォルダGFP極局所化が完全に組み立てられたタイプ4分泌系に依存しているかどうかを調べるには、野生型の個々の細胞と4種類の分泌系変異体でDotBスーパーフォルダGFPの極性スコアを決定した。実際、DotBスーパーフォルダGFPの極位置は、Dot/ICMシステムが削除されると消失しました。動的パターンは、DotB ATPaseが動的細胞種集団に存在し、後期アセンブリ反応で極局所的なドット/ICM型4分泌系に採用されたことを示した。高スループットのcryo-ETはDotBスーパーフォルダGFPを発現するレジオネラ肺炎球菌株で無傷の4つの分泌システム装置を可視化するために使用された。細胞の再構成は、細胞エンベロープに埋め込まれた複数のドット/ICMマシンを明らかにした。DotBとスーパーフォルダGFPの全位置決めも、インタクトタイプ4分泌システムマシンに関連して決定された。3次元サーフェスレンダリングは、スーパーフォルダGFPがドットBヘキサマーの下に配置されていることを示し、細胞質ATPase複合体の基部にディスクとして組み立てる。この手法を試みるときは、画像取得に進む前に、融合タンパク質の安定性とタグ分泌システムの機能性を評価してください。モデリングと適合は、動的パターンと構造密度を解析する方法や、構造構造の構造変化やサブユニットの局所化を評価する効果的な方法です。この方法は、タイプ 4 のシークレット システム コンポーネントがどのように機能するか、複雑なコンポーネント内でどのように相互作用するか、および異なるサブアセンブリがどのような機能を果たすのかを理解するのに役立ちます。

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Applying Live Cell Imaging and Cryo-Electron Tomography to Resolve Spatiotemporal Features of the Legionella pneumophila Dot/Icm Secretion System

Determination of Molecular Structures of HIV Envelope Glycoproteins using Cryo-Electron Tomography and Automated Sub-tomogram Averaging

低温電子断層撮影と自動化されたサブ断層アベレージングを使用して、HIVエンベロープ糖タンパク質の分子構造の決定

Since its discovery nearly 30 years ago, more than 60 million people have been infected with the human immunodeficiency virus (HIV) (www.usaid.gov). The ...

Use of an Optical Trap for Study of Host-Pathogen Interactions for Dynamic Live Cell Imaging

動的な生細胞イメージングのための宿主 - 病原体相互作用の研究のための光トラップの使用

Dynamic live cell imaging allows direct visualization of real-time interactions between cells of the immune system1, 2; however, the lack of spatial and ...

Real-time Live Imaging of T-cell Signaling Complex Formation

複合体形成シグナリングT細胞のリアルタイムのライブイメージング

Protection against infectious diseases is mediated by the immune system 1,2. T lymphocytes are the master coordinators of the immune system, regulating ...

Live Cell Imaging of Alphaherpes Virus Anterograde Transport and Spread

Alphaherpesウイルス順行性輸送とスプレッドの生細胞イメージング

Advances in live cell fluorescence microscopy  techniques, as well as the construction of recombinant viral strains that  express fluorescent fusion ...

Use of Galleria mellonella as a Model Organism to Study Legionella pneumophila Infection

Use of Galleria mellonella as a Model Organism to Study Legionella pneumophila Infection

使用<em&gt;ハチノスツヅリガ</em&gt;モデル生物として研究する<em&gt;レジオネラ·ニューモフィラ</em&gt;感染症

Legionella pneumophila, the causative agent of a severe pneumonia named Legionnaires&#39; disease, is an important human pathogen that infects and ...

Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes

Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes

細菌性病原体による細胞の感染を調査するためにイメージングInlC分泌<em&gt;リステリア菌</em

Bacterial intracellular  pathogens can be conceived as molecular tools to dissect cellular signaling  cascades due to their capacity to exquisitely ...

Applying an Inducible Expression System to Study Interference of Bacterial Virulence Factors with Intracellular Signaling

誘導発現系を適用すると、細胞内シグナル伝達と細菌の病原性因子の干渉を研究するために、

The technique presented here allows one to analyze at which step a target protein, or alternatively a small molecule, interacts with the components of a ...

Legionella pneumophila Outer Membrane Vesicles: Isolation and Analysis of Their Pro-inflammatory Potential on Macrophages

Legionella pneumophila Outer Membrane Vesicles: Isolation and Analysis of Their Pro-inflammatory Potential on Macrophages

レジオネラ・ニューモ外膜小胞：マクロファージ上における炎症誘発ポテンシャルの単離と解析

Bacteria are able to secrete a variety of molecules via various secretory systems. Besides the secretion of molecules into the extracellular space or ...

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

生体外でマウスのナチュラル キラー細胞の大量生産のため新規無料の送り装置システム

Natural killer (NK) cells belong to the innate immune system and are a first-line anti-cancer immune defense; however, they are suppressed in the tumor ...

Isolation, Fixation, and Immunofluorescence Imaging of Mouse Adrenal Glands

分離、固定およびマウス副腎の蛍光イメージング

Immunofluorescence is a well-established technique for detection of antigens in tissues with the employment of fluorochrome-conjugated antibodies and has ...