Name: applying live cell imaging and cryo-electron tomography to resolve spatiotemporal features of the legionella pneumophila dot/icm secretion system
Uploaded: 2020-03-10T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Applying Live Cell Imaging and Cryo-Electron Tomography to Resolve Spatiotemporal Features of the Legionella pneumophila Dot/Icm Secretion System at JoVE.com

D.C. og C.R.R. ble støttet av NIH (R37AI041699 og R21AI130671). D.P., B.H., og J.L ble støttet av National Institutes of Health (R01AI087946 og R01GM107629).

MERK: Alle prosedyrer som involverer vekst, manipulering og bildebehandling av L. pneumofila bør utføres i et biologisk sikkerhetsnivå 2-laboratorium i samsvar med lokale retningslinjer.
1. Innsetting av sfGFP i L. pneumophila kromosom ved hjelp av allelic Exchange og Double Selection Strategy (Figur 2, Figur 3)
<ol><li>Klone inn i generstatningsvektoren pSR47S11 følgende sekvens: 1000 b...

<ol>
	<li>Franco, I. S., Shuman, H. A., Charpentier, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+perplexing+functions+and+surprising+origins+of+Legionella+pneumophila+type+IV+secretion+effectors.">The perplexing functions and surprising origins of Legionella pneumophila type IV secretion effectors.</a> Cellular Microbiology. 11, 1435-1443 (2009).</li><li>Burstein, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-scale+identification+of+Legionella+pneumophila+effectors+using+a+machine+learning+approach.">Genome-scale identification of Legionella pneumophila effectors using a machine learning approach.</a> PLOS Pathogens. 5, 1000508 (2009).</li><li>Ninio, S., Roy, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effector+proteins+translocated+by+Legionella+pneumophila:+strength+in+numbers.">Effector proteins translocated by Legionella pneumophila: strength in numbers.</a> Trends in Microbiology. 15, 372-380 (2007).</li><li>Vogel, J. P., Andrews, H. L., Wong, S. K., Isberg, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conjugative+transfer+by+the+virulence+system+of+Legionella+pneumophila.">Conjugative transfer by the virulence system of Legionella pneumophila.</a> Science. 279, 873-876 (1998).</li><li>Isberg, R. R., O'Connor, T. J., Heidtman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Legionella+pneumophila+replication+vacuole:+making+a+cosy+niche+inside+host+cells.">The Legionella pneumophila replication vacuole: making a cosy niche inside host cells.</a> Nature Reviews Microbiology. 7, 13-24 (2009).</li><li>Roy, C. R., Berger, K. H., Isberg, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Legionella+pneumophila+DotA+protein+is+required+for+early+phagosome+trafficking+decisions+that+occur+within+min+of+bacterial+uptake.">Legionella pneumophila DotA protein is required for early phagosome trafficking decisions that occur within min of bacterial uptake.</a> Molecular Microbiology. 28, 663-674 (1998).</li><li>Archer, K. A., Roy, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MyD88-Dependent+Responses+Involving+Toll-Like+Receptor+2+Are+Important+for+Protection+and+Clearance+of+Legionella+pneumophila+in+a+Mouse+Model+of+Legionnaires'+Disease.">MyD88-Dependent Responses Involving Toll-Like Receptor 2 Are Important for Protection and Clearance of Legionella pneumophila in a Mouse Model of Legionnaires' Disease.</a> Infection and Immunity. 74, 3325-3333 (2006).</li><li>Nagai, H., Kubori, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+IVB+Secretion+Systems+of+Legionella+and+Other+Gram-Negative+Bacteria.">Type IVB Secretion Systems of Legionella and Other Gram-Negative Bacteria.</a> Frontiers in Microbiology. 2, 136 (2011).</li><li>Kubori, T., Nagai, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Type+IVB+secretion+system:+an+enigmatic+chimera.">The Type IVB secretion system: an enigmatic chimera.</a> Current Opinion in Microbiology. 29, 22-29 (2016).</li><li>Chetrit, D., Hu, B., Christie, P. J., Roy, C. R., Liu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+unique+cytoplasmic+ATPase+complex+defines+the+Legionella+pneumophila+type+IV+secretion+channel.">A unique cytoplasmic ATPase complex defines the Legionella pneumophila type IV secretion channel.</a> Nature Microbiology. 3, 678-686 (2018).</li><li>Merriam, J. J., Mathur, R., Maxfield-Boumil, R., Isberg, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+Legionella+pneumophila+fliI+gene:+intracellular+growth+of+a+defined+mutant+defective+for+flagellum+biosynthesis.">Analysis of the Legionella pneumophila fliI gene: intracellular growth of a defined mutant defective for flagellum biosynthesis.</a> Infection and Immunity. 65, 2497-2501 (1997).</li><li>Feeley, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Charcoal-yeast+extract+agar:+primary+isolation+medium+for+Legionella+pneumophila.">Charcoal-yeast extract agar: primary isolation medium for Legionella pneumophila.</a> Journal of Clinical Microbiology. 10, 437-441 (1979).</li><li>Andrews, H. L., Vogel, J. P., Isberg, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+linked+Legionella+pneumophila+genes+essential+for+intracellular+growth+and+evasion+of+the+endocytic+pathway.">Identification of linked Legionella pneumophila genes essential for intracellular growth and evasion of the endocytic pathway.</a> Infection and Immunity. 66, 950-958 (1998).</li><li>Morado, D. R., Hu, B., Liu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+Tomoauto:+A+Protocol+for+High-throughput+Automated+Cryo-electron+Tomography.">Using Tomoauto: A Protocol for High-throughput Automated Cryo-electron Tomography.</a> Journal of Visualized Experiments. (107), e53608 (2016).</li><li>Hu, B., Lara-Tejero, M., Kong, Q., Galan, J. E., Liu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Situ+Molecular+Architecture+of+the+Salmonella+Type+III+Secretion+Machine.">In Situ Molecular Architecture of the Salmonella Type III Secretion Machine.</a> Cell. 168, 1065-1074 (2017).</li><li>Mastronarde, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+electron+microscope+tomography+using+robust+prediction+of+specimen+movements.">Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements.</a> Journal of Structural Biology. 152, 36-51 (2005).</li><li>Zheng, S. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MotionCor2:+anisotropic+correction+of+beam-induced+motion+for+improved+cryo-electron+microscopy.">MotionCor2: anisotropic correction of beam-induced motion for improved cryo-electron microscopy.</a> Nature Methods. 14, 331-332 (2017).</li><li>Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computer+visualization+of+three-dimensional+image+data+using+IMOD.">Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD.</a> Journal of Structural Biology. 116, 71-76 (1996).</li><li>Gilbert, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Iterative+methods+for+the+three-dimensional+reconstruction+of+an+object+from+projections.">Iterative methods for the three-dimensional reconstruction of an object from projections.</a> Journal of Theoretical Biology. 36, 105-117 (1972).</li><li>Radermacher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Weighted+Back-projection+Methods.">Weighted Back-projection Methods.</a> Electron Tomography. , 245-273 (2007).</li><li>Winkler, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tomographic+subvolume+alignment+and+subvolume+classification+applied+to+myosin+V+and+SIV+envelope+spikes.">Tomographic subvolume alignment and subvolume classification applied to myosin V and SIV envelope spikes.</a> Journal of Structural Biology. 165, 64-77 (2009).</li><li>Winkler, H., Taylor, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+marker-free+alignment+with+simultaneous+geometry+determination+and+reconstruction+of+tilt+series+in+electron+tomography.">Accurate marker-free alignment with simultaneous geometry determination and reconstruction of tilt series in electron tomography.</a> Ultramicroscopy. 106, 240-254 (2006).</li><li>Prevost, M. S., Waksman, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-ray+crystal+structures+of+the+type+IVb+secretion+system+DotB+ATPases.">X-ray crystal structures of the type IVb secretion system DotB ATPases.</a> Protein Science. 27, 1464-1475 (2018).</li><li>Miklos, G. L., Rubin, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+the+genome+project+in+determining+gene+function:+insights+from+model+organisms.">The role of the genome project in determining gene function: insights from model organisms.</a> Cell. 86, 521-529 (1996).</li><li>Reyrat, J. M., Pelicic, V., Gicquel, B., Rappuoli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Counterselectable+markers:+untapped+tools+for+bacterial+genetics+and+pathogenesis.">Counterselectable markers: untapped tools for bacterial genetics and pathogenesis.</a> Infection and Immunity. 66, 4011-4017 (1998).</li><li>Yu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Molecule+Studies+in+Live+Cells.">Single-Molecule Studies in Live Cells.</a> Annual Review of Physical Chemistry. 67, 565-585 (2016).</li><li>Stewart, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-electron+microscopy+and+cryo-electron+tomography+of+nanoparticles.">Cryo-electron microscopy and cryo-electron tomography of nanoparticles.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: Nanomedicine and Nanobiotechnology. 9, (2017).</li></ol>

Å belyse funksjonene til bakterielle sekresjonssystemer er nøkkelen til en fullstendig forståelse av vertspatogeninteraksjoner. Sekresjonssystemer er komplekse maskiner som kan injisere effektorer proteiner i vertsceller, og i noen tilfeller fremme etablering av en subcellulær nisje som støtter bakteriell replikering. Ovennevnte metode gir viktige nye verktøy for å studere Dot / Icm sekresjonssystemet til luftveisbakteriell patogen Legionella pneumophila, noe som gir ledetråder til mekanismene for effekt...

Legionella pneumophila (L. pneumophila), etiologisk middel for Legionærsykdom, bor i ferskvannsreservoarer, hvor bakteriene forplanter seg ved å infisere og replikere i akvatiske frittsvømmende protozoer. L. pneumofila forårsaker sykdomsutbrudd hos mennesker når innånding av aerosoliserte bakterier fra drikkevannskilder oppstår. I infiserte celler gjør undergraving av vertsveier L. pneumofila å forsinke endocytisk modning av vacuole der den befinner seg og for å fremme biogenesis av et cellulært rom som støtter bakteriell replikering. Denne prosessen er drevet av en spesialisert bakteriell type IVB sekresjon system (T4BSS) kjent som Dot / Icm og dens repertoar av over 300 "effector" proteiner som er translocated til verten cytosol under infeksjon for å lette manipulering av cellulære funksjoner1,2,3,4,5. Mutanter som mangler et funksjonelt Dot / Icm-apparat ikke klarer å levere effektorer inn i vertencytosol, er defekte for intracellulær replikering, og er avirulent i dyremodeller av sykdom6,7.
Mange bakterielle arter har utviklet ekstremt komplekse og dynamiske multikomponentmaskiner som kreves for infeksjonsprosesser. Andre T4BSS som Dot / Icm systemet er også avgjørende for intracellulær replikering av bakterielle patogener som Coxiella burnetii og Rickettsiella grylli. Selv om T4BSS er evolusjonært relatert til prototypiske type IVA-systemer, som medierer DNA-overføring og kan levere et begrenset repertoar av effektorproteiner, har Dot / Icm-systemet nesten dobbelt så mange maskinkomponenter og leverer et bredt utvalg av effektorer. Formodentlig har denne utvidelsen i antall komponenter gjort det mulig for Dot/Icm-apparatet å imøtekomme og integrere nye effektorer enkelt8,9.
Vi brukte nylig kryoelektrontomografi (cryo-ET) for å løse strukturen til Dot/Icm-apparatet in situ og viste at den danner en cellekonvoluttskkende kanal som kobles til et cytoplasmatisk kompleks. Videre analyse viste at den cytosolic ATPase DotB forbinder med Dot / Icm systemet på L. pneumophila cellepol gjennom interaksjoner med cytosolic ATPase DotO. Vi har oppdaget at DotB viser en cytosolic bevegelse i de fleste bakterielle celler, noe som indikerer at denne ATPase er til stede i en dynamisk cytosolic populasjon, men også forbinder med polardot / Icm komplekser. I tillegg danner DotO en hexameric montering av DotO-dimers forbundet med det indre membrankomplekset, og en DotB-hexamer slutter seg til bunnen av dette cytoplasmatiske komplekset. Monteringen av DotB-DotO energikompleks skaper en cytoplasmatisk kanal som styrer translokasjonen av underlag gjennom T4SS (Figur 1)10.
Til tross for disse siste fremskrittene, er lite kjent om hvordan Dot / Icm-systemet fungerer og hvordan hvert protein monteres for å danne et aktivt apparat8. Avdekke regulatoriske kretser av Dot / Icm T4SS er grunnleggende for å forstå de molekylære mekanismene for vertspatogen interaksjoner. Derfor diskuterer vi hvordan du bruker levende cellemikroskopi og cryo-ET for å oppdage og karakterisere essensielle L. pneumophila Dot / Icm systemkomponenter som er merket med super-mappe GFP (sfGFP). Ved hjelp av kvantitativ fluorescensmikroskopi vil polarlokaliseringen av DotB defineres i en vill typebakgrunn eller når type IV-systemet slettes. Tidsforløpmikroskopi vil bli brukt til å kvantifisere forskjeller i lokalisering og dynamikk mellom Dot / Icm cytosolic ATPases.
Den kombinerte anvendelsen av to komplementære tilnærminger som live imaging og cryo-ET gir en fordel i forhold til andre in vitro systemer. Begge metodene utføres i intakte celler og bevare det naturlige miljøet i T4BSS, og dermed minimere avbrudd av den opprinnelige strukturen under prøveforberedelse. Fordi overuttrykk av proteiner kan svekke stoichiometry av sekresjonsapparatet, returneres sfGFP-fusjoner via allelisk utveksling til Legionella-kromosomet slik at hver fusjon er kodet i enkelt kopi og uttrykket drives av den endogene arrangøren. Visualisering av kromosomalt kodet fusjoner gjør det mulig å kvantifisere det nøyaktige proteinnivået som uttrykkes på et definert tidspunkt. Cryo-ET har også mange fordeler for å bestemme strukturen av sekresjonssystemer. Den mest bemerkelsesverdige fordelen er at kryo-ET prøver består av frosne intakte celler som bevarer innfødte komplekser i sammenheng med bakteriell cellearkitektur. Derfor kan cryo-ET være å foretrekke fremfor biokjemiske rensemetoder, som trekker ut membrankomplekser og kan fjerne perifere proteiner fra kjerneapparatet eller endre den generelle strukturen. I tillegg, tagging et protein av interesse med en klumpete protein som sfGFP legger en masse som er påviselig av cryo-ET og kan bistå med å kartlegge de ulike subkomplekser av Dot / Icm apparatet på strukturen oppnådd av cryo-ET.
Denne tilnærmingen er et kraftig verktøy for å avdekke strukturell informasjon om multimolekylære komplekser som monteres i bakteriecellemembranen. Tolkningen av strukturer som er belyst ved hjelp av disse teknikkene, vil hjelpe feltet med å forstå hvordan T4BSS-komponenter fungerer, hvorfor så mange komponenter er nødvendige for funksjon, hvordan komponentene samhandler innenfor det større komplekse, og hvilke funksjoner disse subassemblies utføre.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 nm colloidal gold particles</td>
			<td>Aurion</td>
			<td>25486</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100x Plan Apo objective (1.4 NA)</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Activated charcoal</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C5510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agaroze GPG/LMP, low melt</td>
			<td>American bioanalytical</td>
			<td>AB00981</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto dehydrated agar</td>
			<td>BD</td>
			<td>214010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoolSNAP EZ 20 MHz digital monochrome camera</td>
			<td>Photometrics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gene Frame, 1.7x2.8 cm, 125 &#181;L</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AB-0578</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Holey Carbon grid R 2/1 Cu 200 mesh</td>
			<td>Quantifoil</td>
			<td>Q225-CR1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iron(III) nitrate nonahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>216828</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2 Summit camera for cryo-EM</td>
			<td>GATAN</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Cysteine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C7352</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope cover slides 22x22 mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-542B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope cover slides 24x50 mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-545K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides 25x75x1 mm</td>
			<td>Globe Scientific</td>
			<td>1380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SlideBook 6.0</td>
			<td>Intelligent Imaging Innovations</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectra X light engine</td>
			<td>Lumencor</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq 2X Master Mix</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>M0270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Titan Krios</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract</td>
			<td>BD</td>
			<td>212750</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

applying live cell imaging and cryo-electron tomography to resolve spatiotemporal features of the legionella pneumophila dot/icm secretion system

Dot / Icm sekresjonssystemet legionella pneumophila er en kompleks type IV sekresjonssystem (T4SS) nanomaskin som lokaliserer på bakteriepolen og medierer levering av protein- og DNA-substrater for å målrette celler, en prosess som vanligvis krever direkte celle-til-celle-kontakt. Vi har nylig løst strukturen til Dot / Icm-apparatet ved kryoelektrontomografi (cryo-ET) og viste at den danner en cellekonvoluttskkende kanal som kobles til et cytoplasmatisk kompleks. Bruk av to komplementære tilnærminger som bevarer den opprinnelige strukturen i prøven, fluorescerende mikroskopi i levende celler og cryo-ET, tillater in situ visualisering av proteiner og assimilering av stoichiometry og tidspunktet for produksjonen av hver maskinkomponent i forhold til andre Dot / Icm underenheter. For å undersøke kravene til polar posisjonering og karakterisere dynamiske funksjoner forbundet med T4SS-maskinbiogenese, har vi smeltet sammen et genkoding av supermappe grønt fluorescerende protein til Dot/Icm ATPase-gener i sine opprinnelige posisjoner på kromosomet. Følgende metode integrerer kvantitativ fluorescensmikroskopi av levende celler og cryo-ET for å kvantifisere polar lokalisering, dynamikk og struktur av disse proteinene i intakte bakterielle celler. Bruk av disse tilnærmingene for å studere Legionella pneumophila T4SS er nyttig for å karakterisere funksjonen til Dot / Icm-systemet og kan tilpasses for å studere et bredt utvalg av bakterielle patogener som bruker T4SS eller andre typer bakteriellsekresjonskomplekser.

Homolog rekombinasjon med dobbeltvalg i to trinn ble brukt til å konstruere den definerte innsettingen av sfGFP. I det første trinnet ble triparental parring utført, hvor pRK600 konjugativ plasmid (en IncP plasmid) fra E. coli helper stamme MT616 ble mobilisert til donor E. coli belastning med selvmordvektor pSR47S som inneholder sfGFP genet flankert av de to homologe regioner, opprinnelsen til overføring oriT og Bacillus til subis counterselection gene sacB. Deretter konjugeringss...

Watch this Scientific Journal Video about Applying Live Cell Imaging and Cryo-Electron Tomography to Resolve Spatiotemporal Features of the Legionella pneumophila Dot/Icm Secretion System at JoVE.com

Applying Live Cell Imaging and Cryo-Electron Tomography to Resolve Spatiotemporal Features of the Legionella pneumophila Dot/Icm Secretion System

Avbildning av bakterielle celler er en voksende systembiologi tilnærming fokusert på å definere statiske og dynamiske prosesser som dikterer funksjonen til store makromolekylære maskiner. Her brukes integrering av kvantitativ levende celleavbildning og kryoelektrontomografi til å studere Legionella pneumophila type IV sekresjonssystemarkitektur og funksjoner.

Bruke Live Cell Imaging og Cryo-Electron Tomography for å løse spatiotemporal funksjoner av Legionella pneumophila Dot / Icm Sekresjon System

The Dot/Icm secretion system of Legionella pneumophila is a complex type IV secretion system (T4SS) nanomachine that localizes at the bacterial pole and ...

Denne protokollen er nyttig for å karakterisere monteringsfunksjonene til bakterielle sekresjonskomplekser og kan føre til en grunnleggende forståelse av molekylære mekanismer som kreves for vertspatogeninteraksjoner. Denne teknikken integrerer komplementære tilnærminger som bevarer den opprinnelige strukturen i prøven og tillater og ser til visualisering av proteinkomplekser i intakte bakterielle celler. Det øker vår forståelse av de strukturelle funksjonsrelasjonene til bakterielle sekresjonssystemer.Denne metoden kan tilpasses for å studere andre typer sekresjonssystemer eller andre cellulære komplekser i et bredt spekter av bakterielle arter. Start med å lage agarose pads for live celle imaging. Forbered ca 30 ml 1% lav smelte agarose løsning i vann og mikrobølgeovn det i en glasskolbe i ca 90 sekunder virvlende det av og til til agarose er helt oppløst.Plasser to 22 av 22 av 0,15 mm glasssklier på kanten av en 25 med 75 med 1,1 mm glasssklie en på toppen av den andre. Deretter stabler du to av de mindre lysbildene på den andre kanten. Pipette ca 1 ml av smeltet agarose inn i midtlyset mellom de to øvre glassskliene og plasser en annen stor sklie på toppen av smeltet agarose og sørg for å unngå dannelse av luftbobler.Avkjøl lysbildene ved fire grader celsius i 15 minutter, og bruk deretter en skalpell eller barberblad for å forsiktig kutte puten i små firkanter. Fest en dobbeltsidig selvklebende ramme på en 25 med 75 med 1,1 mm glasssklie og plasser flere pads på lysbildet. Oppløs en tung flekk av Legionella Pneumophila i 1 ml dobbeltdestillert vann.Deretter vortex og pipette to til tre mikroliter av fortynningen på pads. Plasser forsiktig en 58 med 24 og 0,15 mm dekselslipp over kleberammen. Velg celler for bildebehandling ved hjelp av lys feltbelysning.Deretter, i opptaksvinduet i mikroskopets programvare, Juster ND til 180 og binning til to og to. Bruk 488 nanometerkanalen til å eksponere prøven for 500 til 1000 millisekunder og validere fluorescensens spesifisitet ved å avbilde ukodet Legionella Pneumophila med de samme parametrene. For å kvantifisere polariteten, juster bildekontrasten slik at bakteriene er godt synlige.Zoom deretter inn på interesseområdet og bruk regionverktøyet til å plassere et 0,25 med 1,3 mikrometerrektangel som starter på stangen og strekker seg inn i cytoplasma og sørger for at rektangelet forblir innenfor bakteriegrensene. Merk minst 200 bakterier og lag masker ved hjelp av regionen til å maskere knappen i analysemenyen. Klikk på maskestatistikk og velg objekt under maskeomfang.Merk deretter gjennomsnittlig intensitet og varians under funksjoner og intensitet. Eksporter dataene som en tekstfil og bruk regnearkprogrammet til å beregne polaritetspoengene for hver bakterie som forholdet mellom variansen og gjennomsnittsintensiteten. For applikasjoner med høy gjennomstrømming bruker du mikroskopi for ansiktskontrast til å skaffe tokanalsbilder.Sørg for å velge synsfelt der bakteriene er fullstendig separert. Deretter justerer du ansiktskanalkontrasten til bildet til et nivå der bakteriene er godt synlige. Åpne bildet med to kanaler, og start vinduet opprett segmentmaske.Juster den aktuelle terskelen, og fjern deretter de små objektene ved å klikke definer objekter-knappen og justere minimumsstørrelsen til 100 piksler. Under finjuster maske velger du fjerne kanter objekter og separate masker av bakterier som ligger ved siden av hverandre. For å kvantifisere dynamikken i fusjonsproteinene, åpne bildeopptaksvinduet og markere tidsforløp.Skriv inn to i boksen antall tidspunkter. Få to vellykkede bilder av Legionella Pneumophila som uttrykker det fluorescerende proteinet av interesse. Juster bildekontrasten til cellene er godt synlige.Bruk deretter regionverktøyet til å plassere en 0,25 med 0,25 mikrometer firkant i midten av minst 400 celler. Deretter bruker du områdeknappen til å maskere knappen i analysemenyen for å opprette en maske av firkantene av interesse. Opprett en ny tom maske, og bruk pikselverktøyet til å merke hele celleområdet med minst 25 tilfeldige celler.Opprett en annen maske, og bruk det store penselverktøyet til å merke områder mellom cellene. Til slutt velger du maskestatistikk og kontrollerer at objektet er valgt under maskeomfang for maske én. Velg gjennomsnittsintensitet under funksjoner og intensitet.Eksporter dataene og gjenta prosessen for maske 2. For maske 3 velger du hele masken og eksporterer gjennomsnittsintensiteten. For å forberede elektron kryotomografiprøven, vokse en tung flekk av Legionella Pneumophila på CYE Agrastreptomisum plater i 48 timer ved 37 grader Celsius.Resuspend cellene i vann til en OD 600 på ca 0,7. Tilsett deretter fem mikroliter med kolloidale gullpartikler til 20 mikroliter av cellefjæringen. Glød utslipp et holey karbongitter og pipette fem mikroliter av celleblandingen på den.La det stå i ett minutt. Blot gitteret med filterpapir og frys det i flytende etan ved hjelp av et gravitasjonsdrevet stempelapparat. Etter å ha satt superfolder GFP inn i Legionella Pneumophila-kromosomet, ble live cellefluoreserende mikroskopi utført for å sammenligne det fluorescerende signalet med den til foreldrenes superfolder GFP negativ belastning.I tillegg ble lysfeltmikroskopi brukt til å undersøke andelen celler med et bestemt fluorescerende signal. Bare en brøkdel av cellene som produserte DotB superfolder GFP viste polar lokalisering av fusjonsproteinet. Ved karakterisering av fordelingen av DotB fluorescerende signal, ble det funnet at intensiteten av DotB superfolder GFP på polene var omtrent to ganger høyere enn i cytosolen.For å undersøke om DotB superfolder GFP polar lokalisering var avhengig av en fullt montert type fire sekresjonssystem, polaritet score av DotB superfolder GFP ble bestemt for individuelle celler i en vill type, og i en type fire sekresjon system mutant. Faktisk forsvant polar posisjonering av DotB superfolder GFP da Dot / ICM-systemet ble slettet. Dynamiske mønstre indikerte at DotB ATPase var tilstede i en dynamisk cytosolisk befolkning og ble rekruttert til det polare lokaliserte Dot/ICM type fire sekresjonssystemet ved en sen fase monteringsreaksjon.Høy gjennomstrømning cryo-ET ble brukt til å visualisere intakt type fire sekresjonssystemapparat i en Legionella Pneumophila belastning uttrykker DotB superfolder GFP. Rekonstruksjon av cellen avslørte flere Dot / ICM-maskiner innebygd i cellekonvolutten. Den generelle plasseringen av DotB og superfolder GFP i forhold til den intakte type fire sekresjonssystemmaskinen ble også bestemt.Tredimensjonale overflategjengivelser indikerte at superfolder GFP er plassert under DotB hexamer, som monteres som en plate ved foten av det cytoplasmatiske ATPase-komplekset. Når du prøver denne teknikken, sørg for å vurdere stabiliteten av fusjonproteiner og funksjonaliteten til tag sekresjonssystemet før du går videre til bildeoppkjøp. Modellering og tilpasning kan være effektive måter å analysere dynamiske mønstre og strukturelle tettheter samt for evaluering av konformasjonsendringer eller lokalisering av underenheter i strukturen.Denne tilnærmingen kan bidra til å forstå hvordan ulike type fire hemmelige systemkomponenter fungerer, hvordan de samhandler i det større komplekset, og hvilke funksjoner forskjellige delmonteringer utfører.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Applying Live Cell Imaging and Cryo-Electron Tomography to Resolve Spatiotemporal Features of the Legionella pneumophila Dot/Icm Secretion System

Determination of Molecular Structures of HIV Envelope Glycoproteins using Cryo-Electron Tomography and Automated Sub-tomogram Averaging

Fastsettelse av Molecular Structures av HIV Konvolutt glykoproteiner bruker Cryo-Electron Tomography og Automated Sub-tomogram gjennomsnitt

Since its discovery nearly 30 years ago, more than 60 million people have been infected with the human immunodeficiency virus (HIV) (www.usaid.gov). The ...

Use of an Optical Trap for Study of Host-Pathogen Interactions for Dynamic Live Cell Imaging

Dynamic live cell imaging allows direct visualization of real-time interactions between cells of the immune system1, 2; however, the lack of spatial and ...

Real-time Live Imaging of T-cell Signaling Complex Formation

Real-time Live Imaging av T-celle signalisering Complex Formation

Protection against infectious diseases is mediated by the immune system 1,2. T lymphocytes are the master coordinators of the immune system, regulating ...

Live Cell Imaging of Alphaherpes Virus Anterograde Transport and Spread

Live Cell Imaging av Alphaherpes Virus Anterograd Transport og Spread

Advances in live cell fluorescence microscopy  techniques, as well as the construction of recombinant viral strains that  express fluorescent fusion ...

Use of Galleria mellonella as a Model Organism to Study Legionella pneumophila Infection

Use of Galleria mellonella as a Model Organism to Study Legionella pneumophila Infection

Ved å bruke<em&gt; Galleria mellonella</em&gt; Som modellorganisme for å studere<em&gt; Legionella pneumophila</em&gt; Infeksjon

Legionella pneumophila, the causative agent of a severe pneumonia named Legionnaires&#39; disease, is an important human pathogen that infects and ...

Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes

Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes

Imaging inlc Secretion å etterforske Cellular Infeksjon av Bakteriell Patogen<em&gt; Listeria monocytogenes</em

Bacterial intracellular  pathogens can be conceived as molecular tools to dissect cellular signaling  cascades due to their capacity to exquisitely ...

Applying an Inducible Expression System to Study Interference of Bacterial Virulence Factors with Intracellular Signaling

Påføre en induserbar Expression System for å studere forstyrrelser av bakteriell virulensfaktorer med intracellulære signal

The technique presented here allows one to analyze at which step a target protein, or alternatively a small molecule, interacts with the components of a ...

Legionella pneumophila Outer Membrane Vesicles: Isolation and Analysis of Their Pro-inflammatory Potential on Macrophages

Legionella pneumophila Outer Membrane Vesicles: Isolation and Analysis of Their Pro-inflammatory Potential on Macrophages

Legionella pneumophila ytre membran Blemmer: Isolering og analyse av deres Pro-inflammatorisk potensialet på Makrofager

Bacteria are able to secrete a variety of molecules via various secretory systems. Besides the secretion of molecules into the extracellular space or ...

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

En roman mater-fritt System for masseproduksjon av Murine naturlige drepe celler In Vitro

Natural killer (NK) cells belong to the innate immune system and are a first-line anti-cancer immune defense; however, they are suppressed in the tumor ...

Isolation, Fixation, and Immunofluorescence Imaging of Mouse Adrenal Glands

Isolasjon, fiksering og Immunofluorescence avbildning av musen binyrene

Immunofluorescence is a well-established technique for detection of antigens in tissues with the employment of fluorochrome-conjugated antibodies and has ...