Name: applying live cell imaging and cryo-electron tomography to resolve spatiotemporal features of the legionella pneumophila dot/icm secretion system
Uploaded: 2020-03-10T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Applying Live Cell Imaging and Cryo-Electron Tomography to Resolve Spatiotemporal Features of the Legionella pneumophila Dot/Icm Secretion System at JoVE.com

D.C. и C.R.R. были поддержаны NIH (R37AI041699 и R21AI130671). D.P., B.H. и J.L. были поддержаны Национальными институтами здоровья (R01AI087946 и R01GM107629).

ПРИМЕЧАНИЕ: Все процедуры, связанные с ростом, манипуляцией и визуализацией Л. пневмофилы, должны выполняться в лаборатории уровня биологической безопасности 2 в соответствии с местными руководящими принципами.
1. Вставка sfGFP в L. pneumophila Хромосомы использованием а...

<ol>
	<li>Franco, I. S., Shuman, H. A., Charpentier, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+perplexing+functions+and+surprising+origins+of+Legionella+pneumophila+type+IV+secretion+effectors.">The perplexing functions and surprising origins of Legionella pneumophila type IV secretion effectors.</a> Cellular Microbiology. 11, 1435-1443 (2009).</li><li>Burstein, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-scale+identification+of+Legionella+pneumophila+effectors+using+a+machine+learning+approach.">Genome-scale identification of Legionella pneumophila effectors using a machine learning approach.</a> PLOS Pathogens. 5, 1000508 (2009).</li><li>Ninio, S., Roy, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effector+proteins+translocated+by+Legionella+pneumophila:+strength+in+numbers.">Effector proteins translocated by Legionella pneumophila: strength in numbers.</a> Trends in Microbiology. 15, 372-380 (2007).</li><li>Vogel, J. P., Andrews, H. L., Wong, S. K., Isberg, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conjugative+transfer+by+the+virulence+system+of+Legionella+pneumophila.">Conjugative transfer by the virulence system of Legionella pneumophila.</a> Science. 279, 873-876 (1998).</li><li>Isberg, R. R., O'Connor, T. J., Heidtman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Legionella+pneumophila+replication+vacuole:+making+a+cosy+niche+inside+host+cells.">The Legionella pneumophila replication vacuole: making a cosy niche inside host cells.</a> Nature Reviews Microbiology. 7, 13-24 (2009).</li><li>Roy, C. R., Berger, K. H., Isberg, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Legionella+pneumophila+DotA+protein+is+required+for+early+phagosome+trafficking+decisions+that+occur+within+min+of+bacterial+uptake.">Legionella pneumophila DotA protein is required for early phagosome trafficking decisions that occur within min of bacterial uptake.</a> Molecular Microbiology. 28, 663-674 (1998).</li><li>Archer, K. A., Roy, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MyD88-Dependent+Responses+Involving+Toll-Like+Receptor+2+Are+Important+for+Protection+and+Clearance+of+Legionella+pneumophila+in+a+Mouse+Model+of+Legionnaires'+Disease.">MyD88-Dependent Responses Involving Toll-Like Receptor 2 Are Important for Protection and Clearance of Legionella pneumophila in a Mouse Model of Legionnaires' Disease.</a> Infection and Immunity. 74, 3325-3333 (2006).</li><li>Nagai, H., Kubori, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+IVB+Secretion+Systems+of+Legionella+and+Other+Gram-Negative+Bacteria.">Type IVB Secretion Systems of Legionella and Other Gram-Negative Bacteria.</a> Frontiers in Microbiology. 2, 136 (2011).</li><li>Kubori, T., Nagai, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Type+IVB+secretion+system:+an+enigmatic+chimera.">The Type IVB secretion system: an enigmatic chimera.</a> Current Opinion in Microbiology. 29, 22-29 (2016).</li><li>Chetrit, D., Hu, B., Christie, P. J., Roy, C. R., Liu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+unique+cytoplasmic+ATPase+complex+defines+the+Legionella+pneumophila+type+IV+secretion+channel.">A unique cytoplasmic ATPase complex defines the Legionella pneumophila type IV secretion channel.</a> Nature Microbiology. 3, 678-686 (2018).</li><li>Merriam, J. J., Mathur, R., Maxfield-Boumil, R., Isberg, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+Legionella+pneumophila+fliI+gene:+intracellular+growth+of+a+defined+mutant+defective+for+flagellum+biosynthesis.">Analysis of the Legionella pneumophila fliI gene: intracellular growth of a defined mutant defective for flagellum biosynthesis.</a> Infection and Immunity. 65, 2497-2501 (1997).</li><li>Feeley, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Charcoal-yeast+extract+agar:+primary+isolation+medium+for+Legionella+pneumophila.">Charcoal-yeast extract agar: primary isolation medium for Legionella pneumophila.</a> Journal of Clinical Microbiology. 10, 437-441 (1979).</li><li>Andrews, H. L., Vogel, J. P., Isberg, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+linked+Legionella+pneumophila+genes+essential+for+intracellular+growth+and+evasion+of+the+endocytic+pathway.">Identification of linked Legionella pneumophila genes essential for intracellular growth and evasion of the endocytic pathway.</a> Infection and Immunity. 66, 950-958 (1998).</li><li>Morado, D. R., Hu, B., Liu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+Tomoauto:+A+Protocol+for+High-throughput+Automated+Cryo-electron+Tomography.">Using Tomoauto: A Protocol for High-throughput Automated Cryo-electron Tomography.</a> Journal of Visualized Experiments. (107), e53608 (2016).</li><li>Hu, B., Lara-Tejero, M., Kong, Q., Galan, J. E., Liu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Situ+Molecular+Architecture+of+the+Salmonella+Type+III+Secretion+Machine.">In Situ Molecular Architecture of the Salmonella Type III Secretion Machine.</a> Cell. 168, 1065-1074 (2017).</li><li>Mastronarde, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+electron+microscope+tomography+using+robust+prediction+of+specimen+movements.">Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements.</a> Journal of Structural Biology. 152, 36-51 (2005).</li><li>Zheng, S. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MotionCor2:+anisotropic+correction+of+beam-induced+motion+for+improved+cryo-electron+microscopy.">MotionCor2: anisotropic correction of beam-induced motion for improved cryo-electron microscopy.</a> Nature Methods. 14, 331-332 (2017).</li><li>Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computer+visualization+of+three-dimensional+image+data+using+IMOD.">Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD.</a> Journal of Structural Biology. 116, 71-76 (1996).</li><li>Gilbert, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Iterative+methods+for+the+three-dimensional+reconstruction+of+an+object+from+projections.">Iterative methods for the three-dimensional reconstruction of an object from projections.</a> Journal of Theoretical Biology. 36, 105-117 (1972).</li><li>Radermacher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Weighted+Back-projection+Methods.">Weighted Back-projection Methods.</a> Electron Tomography. , 245-273 (2007).</li><li>Winkler, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tomographic+subvolume+alignment+and+subvolume+classification+applied+to+myosin+V+and+SIV+envelope+spikes.">Tomographic subvolume alignment and subvolume classification applied to myosin V and SIV envelope spikes.</a> Journal of Structural Biology. 165, 64-77 (2009).</li><li>Winkler, H., Taylor, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+marker-free+alignment+with+simultaneous+geometry+determination+and+reconstruction+of+tilt+series+in+electron+tomography.">Accurate marker-free alignment with simultaneous geometry determination and reconstruction of tilt series in electron tomography.</a> Ultramicroscopy. 106, 240-254 (2006).</li><li>Prevost, M. S., Waksman, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-ray+crystal+structures+of+the+type+IVb+secretion+system+DotB+ATPases.">X-ray crystal structures of the type IVb secretion system DotB ATPases.</a> Protein Science. 27, 1464-1475 (2018).</li><li>Miklos, G. L., Rubin, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+the+genome+project+in+determining+gene+function:+insights+from+model+organisms.">The role of the genome project in determining gene function: insights from model organisms.</a> Cell. 86, 521-529 (1996).</li><li>Reyrat, J. M., Pelicic, V., Gicquel, B., Rappuoli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Counterselectable+markers:+untapped+tools+for+bacterial+genetics+and+pathogenesis.">Counterselectable markers: untapped tools for bacterial genetics and pathogenesis.</a> Infection and Immunity. 66, 4011-4017 (1998).</li><li>Yu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Molecule+Studies+in+Live+Cells.">Single-Molecule Studies in Live Cells.</a> Annual Review of Physical Chemistry. 67, 565-585 (2016).</li><li>Stewart, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-electron+microscopy+and+cryo-electron+tomography+of+nanoparticles.">Cryo-electron microscopy and cryo-electron tomography of nanoparticles.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: Nanomedicine and Nanobiotechnology. 9, (2017).</li></ol>

Выяснение функций бактериальных систем секреции является ключом к полному пониманию взаимодействия хозяина-патогена. Системы секретии являются сложными машинами, которые могут вводить эффекторы белков в клетки-хозяина, а в некоторых случаях способствовать созданию субклеточной ниш...

Легионелла пневмофила (L. pneumophila), этиологическое вещество болезни легионеров, обитает пресноводных резервуаров, где бактерии размножаются путем заражения и репликации в водной свободного плавания простейшие. L. пневмофила вызывает вспышки болезней у людей при вдыхании аэрозольных бактерий из источников питьевой воды. В инфицированных клетках, подрыв путей хозяина позволяет L. пневмофила отложить эндоцитарное созревание вакуол, в котором он проживает и содействовать биогенеза клеточного отсека, который поддерживает бактериальную репликацию. Этот процесс обусловлен специализированной бактериальной системой секреции IVB (T4BSS), известной как Dot/Icm, и его репертуар из более чем 300 "эффекторов" белков, которые трансвируются в цитозол хозяина во время инфекции для облегчения манипуляции клеточными функциями1,2,3,4,5. Мутанты, не имеющие функционального аппарата Dot/Icm, не могут доставить эффекторов в цитозол хозяина, неполноценны для внутриклеточной репликации и являются avirulent в животных моделях болезни6,7.
Многие бактериальные виды разработали чрезвычайно сложные и динамические многокомпонентные машины, которые необходимы для инфекционных процессов. Другие T4BSS, как Dot / Icm системы также имеют важное значение для внутриклеточной репликации бактериальных патогенов, таких как Coxiella burnetii и Rickettsiella grylli. Хотя T4BSS эволюционно связаны с прототипами типа IVA систем, которые посредничают передачи ДНК и может доставить ограниченный репертуар эффекторных белков, Dot / Icm система имеет почти в два раза больше компонентов машины и обеспечивает широкий спектр эффекторов. Предположительно, это расширение числа компонентов позволило Dot / Icm аппарат для размещения и интеграции новых эффекторов легко8,9.
Недавно мы использовали криоэлектронную томографию (крио-ET) для решения структуры дот-icm аппарата на месте и показали, что он образует клеточный конвертографический канал, который соединяется с цитоплазмическим комплексом. Дальнейший анализ показал, что цитосолико ATPase DotB ассоциируется с системой Dot/Icm на клеточном полюсе L. pneumophila через взаимодействие с цитосолическим ATPase DotO. Мы обнаружили, что DotB отображает цитозоликовое движение в большинстве бактериальных клеток, указывая, что это ATPase присутствует в динамической цитосолильной популяции, но также ассоциируется с полярными комплексами Dot/Icm. Кроме того, DotO образует гексамерную сборку димеров DotO, связанных с внутренним мембранным комплексом, и гексамер DotB присоединяется к основанию этого цитоплазмического комплекса. Сборка энергетического комплекса DotB-DotO создает цитоплазмический канал, который направляет транслокацию субстратов через T4SS(рисунок 1)10.
Несмотря на эти последние достижения, мало что известно о том, как работает система Dot/Icm и как каждый белок собирается, чтобы сформировать активный аппарат8. Раскрытие регулятивной схемы Dot/Icm T4SS имеет основополагающее значение для понимания молекулярных механизмов взаимодействия хоста и патогена. Поэтому мы обсуждаем, как использовать живую клеточную микроскопию и крио-ET для обнаружения и характеристики основных компонентов системы L. pneumophila Dot/Icm, которые помечены супер-папками GFP (sfGFP). Используя количественную флуоресценционную микроскопию, полярная локализация DotB будет определяться в фоновом режиме дикого типа или при удалении системы типа IV. Микроскопия замедленного времени будет использоваться для количественной оценки различий в локализации и динамике между цитосоликами AtPases Dot/Icm.
Комбинированное применение двух взаимодополняющих подходов, таких как живая визуализация и крио-ET, обеспечивает преимущество по сравнению с другими системами in vitro. Оба метода выполняются в нетронутых клетках и сохраняют естественную среду T4BSS, тем самым минимизируя нарушение родной структуры во время подготовки образца. Поскольку переэкспрессия белков может ухудшить стоихиометрию секреционного аппарата, слияние sfGFP возвращается через аллельский обмен на хромосому Legionella, так что каждый синтез закодирован в единственном экземпляре и выражение определяется эндогенным промоутером. Визуализация хромосомно закодированных слияний позволяет количественно определить точный уровень белка, выраженного в определенный момент времени. Cryo-ET также имеет много преимуществ для определения структуры систем секреции. Наиболее заметным преимуществом является то, что образцы крио-ET состоят из замороженных нетронутых клеток, которые сохраняют родные комплексы в контексте архитектуры бактериальных клеток. Следовательно, крио-ET может быть предпочтительнее биохимических подходов к очистке, которые извлекают мембранные комплексы и могут вывести периферийные белки из основного аппарата или изменять общую структуру. Кроме того, пометка белка интерес с громоздким белком, таким как sfGFP добавляет массу, которая обнаруживается крио-ET и может помочь с картированием различных подкомплексов dot/ Icm аппарата на структуру, полученную крио-ET.
Этот подход является мощным инструментом для раскрытия структурной информации о многомолекулярных комплексах, которые собираются в мембране бактериальных клеток. Интерпретация структур, разъясняемых с помощью этих методов, поможет полевому полю понять, как функционируют компоненты T4BSS, почему так много компонентов требуется для работы, как компоненты взаимодействуют в рамках большего комплекса и какие функции эти функции подсборки выполняют.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 nm colloidal gold particles</td>
			<td>Aurion</td>
			<td>25486</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100x Plan Apo objective (1.4 NA)</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Activated charcoal</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C5510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agaroze GPG/LMP, low melt</td>
			<td>American bioanalytical</td>
			<td>AB00981</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto dehydrated agar</td>
			<td>BD</td>
			<td>214010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoolSNAP EZ 20 MHz digital monochrome camera</td>
			<td>Photometrics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gene Frame, 1.7x2.8 cm, 125 &#181;L</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AB-0578</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Holey Carbon grid R 2/1 Cu 200 mesh</td>
			<td>Quantifoil</td>
			<td>Q225-CR1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iron(III) nitrate nonahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>216828</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2 Summit camera for cryo-EM</td>
			<td>GATAN</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Cysteine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C7352</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope cover slides 22x22 mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-542B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope cover slides 24x50 mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-545K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides 25x75x1 mm</td>
			<td>Globe Scientific</td>
			<td>1380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SlideBook 6.0</td>
			<td>Intelligent Imaging Innovations</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectra X light engine</td>
			<td>Lumencor</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq 2X Master Mix</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>M0270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Titan Krios</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract</td>
			<td>BD</td>
			<td>212750</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

applying live cell imaging and cryo-electron tomography to resolve spatiotemporal features of the legionella pneumophila dot/icm secretion system

Система секреции Dot/Icm пневмофилы Legionella является сложной системой секреции IV типа (T4SS), которая локализует на бактериальном полюсе и опосредует доставку белков и субстратов ДНК в клетки-мишени, процесс, обычно требующий прямого контакта между клетками и клетками. Недавно мы решили структуру аппарата Dot/Icm с помощью криоэлектронной томографии (крио-ET) и показали, что он образует клеточный конвертографический канал, который соединяется с цитоплазмическим комплексом. Применение двух взаимодополняющих подходов, сохраняющих родную структуру образца, флуоресцентную микроскопию в живых клетках и крио-ET, позволяет на месте визуализировать белки и усвоение стоихиометрии и сроки производства каждого компонента машины по сравнению с другими подразделениями Dot/Icm. Для изучения требований к полярному позиционированию и характеристики динамических особенностей, связанных с биогенезом машины T4SS, мы сплавили ген, кодируя суперфолдер зеленый флуоресцентный белок, к генам Dot/Icm ATPase на их родных позициях на хромосоме. Следующий метод интегрирует количественную флуоресценцию микроскопии живых клеток и крио-ET для количественной оценки полярной локализации, динамики и структуры этих белков в нетронутых бактериальных клетках. Применение этих подходов для изучения Legionella пневмофилы T4SS полезно для характеристики функции Dot / Icm системы и могут быть адаптированы для изучения широкого спектра бактериальных патогенов, которые используют T4SS или других типов бактериальных комплексов секреции.

Для построения определенной вставки sfGFP использовалась гомологовая рекомбинация с двойным отбором в два этапа. На первом этапе было проведено трехродительское спаривание, где pRK600 конъюгативная плазмида (инкп плазмида) из штамма E. coli helper MT616 была мобилизована донору штамма ...

Watch this Scientific Journal Video about Applying Live Cell Imaging and Cryo-Electron Tomography to Resolve Spatiotemporal Features of the Legionella pneumophila Dot/Icm Secretion System at JoVE.com

Applying Live Cell Imaging and Cryo-Electron Tomography to Resolve Spatiotemporal Features of the Legionella pneumophila Dot/Icm Secretion System

Изображение бактериальных клеток является новым подходом биологии систем, ориентированных на определение статических и динамических процессов, которые диктуют функцию крупных макромолекулярных машин. Здесь для изучения архитектуры и функций системы секреции системы секреции legionella pneumophila IV типа используется интеграция количественной визуализации живых клеток и криоэлектронной томографии.

Применение Live Cell Imaging и крио-электронной томографии для устранения пространственно-временной особенностей системы Legionella pneumophila Dot/Icm Secretion

The Dot/Icm secretion system of Legionella pneumophila is a complex type IV secretion system (T4SS) nanomachine that localizes at the bacterial pole and ...

Этот протокол полезен для характеристики монтажных функций бактериальных секреции комплексов и может привести к фундаментальному пониманию молекулярных механизмов, необходимых для взаимодействия патогенов-хозяина. Этот метод интегрирует дополнительные подходы, которые сохраняют родную структуру образца и позволяют и видят визуализацию белковых комплексов в нетронутых бактериальных клетках. Это увеличивает наше понимание структурных функциональных отношений бактериальных систем секреции.Этот метод может быть адаптирован для изучения других типов систем секреции или других клеточных комплексов в широком спектре бактериальных видов. Начните с создания агарозы колодки для живой визуализации клеток. Подготовка около 30 мл 1%низкого раствора расплава агарозы в воде и микроволновой печи его в стеклянной колбе в течение примерно 90 секунд закрученного его время от времени, пока агароза полностью растворяется.Поместите два 22 на 22 на 0,15 мм стеклянные слайды на краю 25 на 75 на 1,1 мм стеклянный слайд один поверх другого. Затем сложите еще два небольших слайда на другом краю. Pipette около 1 мл расплавленной агарозы в центре слайда между двумя верхними стеклянными горками и место другой большой слайд на вершине расплавленной агарозы убедившись, чтобы избежать образования пузырьков воздуха.Охладить слайды при четырех градусах по Цельсию в течение 15 минут, а затем использовать скальпель или лезвие бритвы, чтобы аккуратно разрезать площадку на небольшие квадратики. Зафиксирует двустороннюю клеевую раму на стеклянной горке 25 на 75 на 1,1 мм и поместите несколько колодок на горку. Растворите тяжелый участок Legionella Pneumophila в 1 мл двойной дистиллированной воды.Затем вихрь и пипетка два-три микролитера разбавления на прокладки. Аккуратно поместите крышку 58 на 24 на 0,15 мм над клейкой рамой. Выберите ячейки для визуализации с помощью яркого освещения поля.Затем, в окне захвата программного обеспечения микроскопа, отрегулируйте ND до 180 и биннинг на два на два. Используйте 488 нанометровый канал, чтобы выставить образец на 500-1000 миллисекунд и проверить специфичность флуоресценции с помощью изображений нетеговых Legionella Pneumophila с теми же параметрами. Чтобы количественно оценить полярность, отрегулируйте контраст изображения, чтобы бактерии были хорошо видны.Затем увеличьте область интереса и используйте инструмент региона, чтобы поместить прямоугольник 0,25 на 1,3 микрометра, начиная с полюса и расширяясь в цитоплазму, убедившись, что прямоугольник остается в пределах бактериальных границ. Отметь не менее 200 бактерий и создайте маски, используя область для маскировки кнопки в меню анализа. Нажмите на статистику масок и выберите объект под маской.Затем отметут среднее интенсивность и дисперсию по характеристикам и интенсивности. Экспорт данных в качестве текстового файла и использование приложения электронной таблицы для расчета полярности оценки каждой бактерии, как соотношение между дисперсией и среднего интенсивности. Для высокой пропускной способности приложения используют микроскопию контрастности лица для получения изображений двойного канала.Убедитесь в том, чтобы выбрать поля зрения, где бактерии полностью разделены. Затем отрегулируйте контраст лица канала изображения до уровня, при котором бактерии хорошо видны. Откройте двойное изображение канала и запустите окно маски сегмента.Отрегулируйте соответствующий порог, затем удалите небольшие объекты, нажав кнопку определения объектов и отрегулируя минимальный размер до 100 пикселей. Под маской уточнить, выберите удалить края объектов и отдельных масок бактерий, которые примыкают друг к другу. Для количественной оценки динамики белков синтеза откройте окно захвата изображения и отметь промежуток времени.Введите два в поле времени точек. Приобрети два успешных изображения Legionella Pneumophila, выражающ флуоресцентный белок интереса. Отрегулируйте контраст изображения до тех пор, пока ячейки не будут хорошо видны.Затем используйте инструмент региона, чтобы поместить квадрат 0,25 на 0,25 микрометра в середине не менее 400 ячеек. Далее используйте область, чтобы замаскировать кнопку в меню анализа, чтобы создать маску квадратов интереса. Создайте новую пустую маску и используйте пиксельный инструмент, чтобы отметить всю область ячейки, по крайней мере 25 случайных ячеек.Создайте другую маску и используйте большой инструмент кисти, чтобы отметить области между ячейками. Наконец, выберите статистику масок и убедитесь, что объект выбран под маской для маски один. По функциям и интенсивности выбирайте средняя интенсивность.Экспортировать данные и повторить процесс для маски 2. Для маски 3, выберите всю маску и экспортировать средняя интенсивность. Чтобы подготовить образец криотомографии электрона, вырастить тяжелый участок Legionella Pneumophila на пластинах CYE Agrastreptomisum в течение 48 часов при 37 градусах по Цельсию.Переусердовать клетки в воде до OD 600 около 0,7. Затем добавьте пять микролитров коллоидных частиц золота в 20 микролитров клеточной суспензии. Свечение разряда дырявой углеродной сетки и пипетки пять микролитров клеточной смеси на нем.Пусть это стоять в течение одной минуты. Пятно сетки с фильтровальной бумагой и заморозить его в жидком этан с помощью гравитационного аппарата поршень. После вставки суперфолдер GFP в хромосому Legionella Pneumophila, живая флуоресцентная микроскопия клетки была выполнена для сравнения флуоресцентного сигнала с родительским суперфолдерным отрицательным штаммом GFP.Кроме того, для изучения доли клеток с определенным флуоресцентным сигналом использовалась яркая полевая микроскопия. Лишь часть клеток, которые произвели DotB суперфолдер GFP отображается поляризация синтеза белка. При характеристике распределения флуоресцентного сигнала DotB было установлено, что интенсивность суперфольбера DotB GFP на полюсах была примерно в два раза выше, чем в цитозоле.Для исследования того, зависела ли полярная локализация DotB superfolder GFP от полностью собранной системы секреции типа 4, для отдельных клеток в диком типе и в мутанте системы секреции типа четыре были определены полярные баллы суперфолдерного GFP DotB. Действительно, полярное позиционирование суперфолькера DotB GFP исчезло, когда система Dot/ICM была удалена. Динамические модели показали, что DotB ATPase присутствует в динамической цитозолической популяции и был завербован в полярную локализованную систему секреции типа Dot/ICM на поздней стадии сборки.Высокая пропускная способность крио-ET была использована для визуализации нетронутой типа четыре аппарата системы секреции в штамме Legionella Pneumophila, выражающего сверхтябрящий GFP DotB. Реконструкция ячейки выявила несколько машин Dot/ICM, встроенных в оболочку ячейки. Было также определено общее позиционирование DotB и суперфолдерного GFP по отношению к нетронутой машине системы секреции типа 4.Трехмерные визуализации поверхности показали, что сверхтябрь GFP расположен ниже гексамера DotB, который собирается в качестве диска у основания цитоплазмического комплекса ATPase. При попытке этого метода, убедитесь, что для оценки стабильности синтеза белков и функциональность системы секреции тегов, прежде чем приступить к изображению приобретения. Моделирование и примерка могут быть эффективными способами анализа динамических моделей и структурной плотности, а также для оценки конформациальных изменений или локализации подразделений в структуру.Такой подход может помочь понять, как функционируют секретные компоненты секретной системы типа четыре, как они взаимодействуют в рамках более сложного комплекса и какие функции выполняют различные подсемейные работы.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Applying Live Cell Imaging and Cryo-Electron Tomography to Resolve Spatiotemporal Features of the Legionella pneumophila Dot/Icm Secretion System

Determination of Molecular Structures of HIV Envelope Glycoproteins using Cryo-Electron Tomography and Automated Sub-tomogram Averaging

Определение молекулярной структуры гликопротеинов ВИЧ Конверт использованием крио-электронной томографии и автоматизированных Sub-томограмма усреднения

Since its discovery nearly 30 years ago, more than 60 million people have been infected with the human immunodeficiency virus (HIV) (www.usaid.gov). The ...

Use of an Optical Trap for Study of Host-Pathogen Interactions for Dynamic Live Cell Imaging

Использование оптической ловушки для изучения хост-Возбудитель Взаимодействие для динамических изображений Живая сотовый

Dynamic live cell imaging allows direct visualization of real-time interactions between cells of the immune system1, 2; however, the lack of spatial and ...

Real-time Live Imaging of T-cell Signaling Complex Formation

В режиме реального времени Живая съемка Т-клеточного сигнального комплекса Формирование

Protection against infectious diseases is mediated by the immune system 1,2. T lymphocytes are the master coordinators of the immune system, regulating ...

Live Cell Imaging of Alphaherpes Virus Anterograde Transport and Spread

Живая изображений Сотовые Alphaherpes Вирус Антероградный транспорта и распространения

Advances in live cell fluorescence microscopy  techniques, as well as the construction of recombinant viral strains that  express fluorescent fusion ...

Use of Galleria mellonella as a Model Organism to Study Legionella pneumophila Infection

Use of Galleria mellonella as a Model Organism to Study Legionella pneumophila Infection

Использование<em&gt; Галерея MELLONELLA</em&gt; В качестве модельного организма по изучению<em&gt; Легионелл</em&gt; Инфекция

Legionella pneumophila, the causative agent of a severe pneumonia named Legionnaires&#39; disease, is an important human pathogen that infects and ...

Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes

Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes

Визуализация InlC секрецию по расследованию сотовой инфекции по бактериальным патогеном<em&gt; листерий</em

Bacterial intracellular  pathogens can be conceived as molecular tools to dissect cellular signaling  cascades due to their capacity to exquisitely ...

Applying an Inducible Expression System to Study Interference of Bacterial Virulence Factors with Intracellular Signaling

Применяя INDUCIBLE системы экспрессии для изучения помех бактериальных факторов вирулентности с внутриклеточной сигнализации

The technique presented here allows one to analyze at which step a target protein, or alternatively a small molecule, interacts with the components of a ...

Legionella pneumophila Outer Membrane Vesicles: Isolation and Analysis of Their Pro-inflammatory Potential on Macrophages

Legionella pneumophila Outer Membrane Vesicles: Isolation and Analysis of Their Pro-inflammatory Potential on Macrophages

Легионелл везикул наружной мембраны: Выделение и анализ их провоспалительного потенциала на макрофагах

Bacteria are able to secrete a variety of molecules via various secretory systems. Besides the secretion of molecules into the extracellular space or ...

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

Роман фидер бесплатная система для массового производства мышиных естественных клеток-киллеров в пробирке

Natural killer (NK) cells belong to the innate immune system and are a first-line anti-cancer immune defense; however, they are suppressed in the tumor ...

Isolation, Fixation, and Immunofluorescence Imaging of Mouse Adrenal Glands

Изоляция, фиксации и изображений иммунофлюоресценции мыши надпочечников

Immunofluorescence is a well-established technique for detection of antigens in tissues with the employment of fluorochrome-conjugated antibodies and has ...