Name: applying live cell imaging and cryo-electron tomography to resolve spatiotemporal features of the legionella pneumophila dot/icm secretion system
Uploaded: 2020-03-10T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Applying Live Cell Imaging and Cryo-Electron Tomography to Resolve Spatiotemporal Features of the Legionella pneumophila Dot/Icm Secretion System at JoVE.com

D.C. y C.R.R. fueron apoyados por los NIH (R37AI041699 y R21AI130671). D.P., B.H. y J.L fueron apoyados por los Institutos Nacionales de Salud (R01AI087946 y R01GM107629).

NOTA: Todos los procedimientos relacionados con el crecimiento, manipulación e imágenes de L. pneumophila deben realizarse en un laboratorio de nivel de seguridad biológica 2 de conformidad con las directrices locales.
1. Inserción de sfGFP en el cromosoma L. pneumophila utilizando el intercambio alélico y la estrategia de doble selección(Figura 2, Figura 3)
<ol><li>Clonar en el vector de reemplazo genético ...

<ol>
	<li>Franco, I. S., Shuman, H. A., Charpentier, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+perplexing+functions+and+surprising+origins+of+Legionella+pneumophila+type+IV+secretion+effectors.">The perplexing functions and surprising origins of Legionella pneumophila type IV secretion effectors.</a> Cellular Microbiology. 11, 1435-1443 (2009).</li><li>Burstein, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-scale+identification+of+Legionella+pneumophila+effectors+using+a+machine+learning+approach.">Genome-scale identification of Legionella pneumophila effectors using a machine learning approach.</a> PLOS Pathogens. 5, 1000508 (2009).</li><li>Ninio, S., Roy, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effector+proteins+translocated+by+Legionella+pneumophila:+strength+in+numbers.">Effector proteins translocated by Legionella pneumophila: strength in numbers.</a> Trends in Microbiology. 15, 372-380 (2007).</li><li>Vogel, J. P., Andrews, H. L., Wong, S. K., Isberg, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conjugative+transfer+by+the+virulence+system+of+Legionella+pneumophila.">Conjugative transfer by the virulence system of Legionella pneumophila.</a> Science. 279, 873-876 (1998).</li><li>Isberg, R. R., O'Connor, T. J., Heidtman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Legionella+pneumophila+replication+vacuole:+making+a+cosy+niche+inside+host+cells.">The Legionella pneumophila replication vacuole: making a cosy niche inside host cells.</a> Nature Reviews Microbiology. 7, 13-24 (2009).</li><li>Roy, C. R., Berger, K. H., Isberg, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Legionella+pneumophila+DotA+protein+is+required+for+early+phagosome+trafficking+decisions+that+occur+within+min+of+bacterial+uptake.">Legionella pneumophila DotA protein is required for early phagosome trafficking decisions that occur within min of bacterial uptake.</a> Molecular Microbiology. 28, 663-674 (1998).</li><li>Archer, K. A., Roy, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MyD88-Dependent+Responses+Involving+Toll-Like+Receptor+2+Are+Important+for+Protection+and+Clearance+of+Legionella+pneumophila+in+a+Mouse+Model+of+Legionnaires'+Disease.">MyD88-Dependent Responses Involving Toll-Like Receptor 2 Are Important for Protection and Clearance of Legionella pneumophila in a Mouse Model of Legionnaires' Disease.</a> Infection and Immunity. 74, 3325-3333 (2006).</li><li>Nagai, H., Kubori, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+IVB+Secretion+Systems+of+Legionella+and+Other+Gram-Negative+Bacteria.">Type IVB Secretion Systems of Legionella and Other Gram-Negative Bacteria.</a> Frontiers in Microbiology. 2, 136 (2011).</li><li>Kubori, T., Nagai, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Type+IVB+secretion+system:+an+enigmatic+chimera.">The Type IVB secretion system: an enigmatic chimera.</a> Current Opinion in Microbiology. 29, 22-29 (2016).</li><li>Chetrit, D., Hu, B., Christie, P. 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C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Charcoal-yeast+extract+agar:+primary+isolation+medium+for+Legionella+pneumophila.">Charcoal-yeast extract agar: primary isolation medium for Legionella pneumophila.</a> Journal of Clinical Microbiology. 10, 437-441 (1979).</li><li>Andrews, H. L., Vogel, J. P., Isberg, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+linked+Legionella+pneumophila+genes+essential+for+intracellular+growth+and+evasion+of+the+endocytic+pathway.">Identification of linked Legionella pneumophila genes essential for intracellular growth and evasion of the endocytic pathway.</a> Infection and Immunity. 66, 950-958 (1998).</li><li>Morado, D. R., Hu, B., Liu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+Tomoauto:+A+Protocol+for+High-throughput+Automated+Cryo-electron+Tomography.">Using Tomoauto: A Protocol for High-throughput Automated Cryo-electron Tomography.</a> Journal of Visualized Experiments. (107), e53608 (2016).</li><li>Hu, B., Lara-Tejero, M., Kong, Q., Galan, J. E., Liu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Situ+Molecular+Architecture+of+the+Salmonella+Type+III+Secretion+Machine.">In Situ Molecular Architecture of the Salmonella Type III Secretion Machine.</a> Cell. 168, 1065-1074 (2017).</li><li>Mastronarde, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+electron+microscope+tomography+using+robust+prediction+of+specimen+movements.">Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements.</a> Journal of Structural Biology. 152, 36-51 (2005).</li><li>Zheng, S. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MotionCor2:+anisotropic+correction+of+beam-induced+motion+for+improved+cryo-electron+microscopy.">MotionCor2: anisotropic correction of beam-induced motion for improved cryo-electron microscopy.</a> Nature Methods. 14, 331-332 (2017).</li><li>Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computer+visualization+of+three-dimensional+image+data+using+IMOD.">Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD.</a> Journal of Structural Biology. 116, 71-76 (1996).</li><li>Gilbert, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Iterative+methods+for+the+three-dimensional+reconstruction+of+an+object+from+projections.">Iterative methods for the three-dimensional reconstruction of an object from projections.</a> Journal of Theoretical Biology. 36, 105-117 (1972).</li><li>Radermacher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Weighted+Back-projection+Methods.">Weighted Back-projection Methods.</a> Electron Tomography. , 245-273 (2007).</li><li>Winkler, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tomographic+subvolume+alignment+and+subvolume+classification+applied+to+myosin+V+and+SIV+envelope+spikes.">Tomographic subvolume alignment and subvolume classification applied to myosin V and SIV envelope spikes.</a> Journal of Structural Biology. 165, 64-77 (2009).</li><li>Winkler, H., Taylor, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+marker-free+alignment+with+simultaneous+geometry+determination+and+reconstruction+of+tilt+series+in+electron+tomography.">Accurate marker-free alignment with simultaneous geometry determination and reconstruction of tilt series in electron tomography.</a> Ultramicroscopy. 106, 240-254 (2006).</li><li>Prevost, M. S., Waksman, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-ray+crystal+structures+of+the+type+IVb+secretion+system+DotB+ATPases.">X-ray crystal structures of the type IVb secretion system DotB ATPases.</a> Protein Science. 27, 1464-1475 (2018).</li><li>Miklos, G. L., Rubin, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+the+genome+project+in+determining+gene+function:+insights+from+model+organisms.">The role of the genome project in determining gene function: insights from model organisms.</a> Cell. 86, 521-529 (1996).</li><li>Reyrat, J. M., Pelicic, V., Gicquel, B., Rappuoli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Counterselectable+markers:+untapped+tools+for+bacterial+genetics+and+pathogenesis.">Counterselectable markers: untapped tools for bacterial genetics and pathogenesis.</a> Infection and Immunity. 66, 4011-4017 (1998).</li><li>Yu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Molecule+Studies+in+Live+Cells.">Single-Molecule Studies in Live Cells.</a> Annual Review of Physical Chemistry. 67, 565-585 (2016).</li><li>Stewart, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-electron+microscopy+and+cryo-electron+tomography+of+nanoparticles.">Cryo-electron microscopy and cryo-electron tomography of nanoparticles.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: Nanomedicine and Nanobiotechnology. 9, (2017).</li></ol>

Elaclarar las funciones de los sistemas de secreción bacteriana es clave para una comprensión completa de las interacciones huésped-patógeno. Los sistemas de secreción son máquinas complejas que pueden inyectar proteínas efectoras en las células huésped, y en algunos casos promueven el establecimiento de un nicho subcelular que apoya la replicación bacteriana. El método anterior proporciona nuevas herramientas importantes para el estudio del sistema de secreción de puntos/mic del patógeno bacteriano respirat...

Legionella pneumophila (L. pneumophila), el agente etiológico de la enfermedad de los legionarios, habita en los reservorios de agua dulce, donde las bacterias se propagan infectando y replicando dentro de los protozoos acuáticos de natación libre. L. pneumophila causa brotes de enfermedades en los seres humanos cuando se produce la inhalación de bacterias aerosolizadas de fuentes de agua potable. En las células infectadas, la subversión de las vías huésped permite a L. pneumophila retrasar la maduración endocítica de la vacuola en la que reside y promover la biogénesis de un compartimento celular que apoya la replicación bacteriana. Este proceso es impulsado por un sistema especializado de secreción IVB de tipo bacteriano (T4BSS) conocido como Dot/Icm y su repertorio de más de 300 proteínas "efectoras" que se trasladan al citosol huésped durante la infección para facilitar la manipulación de las funciones celulares1,2,3,4,5. Los mutantes que carecen de un aparato funcional Dedo/Cm no entregan efectores en el citosol del huésped, son defectuosos para la replicación intracelular y son avirulentes en modelos animales de enfermedad6,7.
Muchas especies bacterianas han desarrollado máquinas multicomponente extremadamente complejas y dinámicas que son necesarias para los procesos de infección. Otros T4BSS como el sistema Dot/Icm también son esenciales para la replicación intracelular de patógenos bacterianos como Coxiella burnetii y Rickettsiella grylli. Aunque el T4BSS está relacionado evolutivamente con los sistemas prototípicos de tipo IVA, que median la transferencia de ADN y pueden ofrecer un repertorio limitado de proteínas de efectores, el sistema Dot/Icm tiene casi el doble de componentes de la máquina y ofrece una amplia variedad de efectores. Presumiblemente, esta expansión en el número de componentes ha permitido que el aparato Dot/Icm acomode e integre nuevos efectores fácilmente8,9.
Recientemente usamos la tomografía crioelectrónica (crio-ET) para resolver la estructura del aparato Dot/Icm in situ y mostramos que forma un canal de expansión celular que se conecta a un complejo citoplasmático. Análisis posterior reveló que el citosólico ATPase DotB se asocia con el sistema Dot/Icm en el polo celular L. pneumophila a través de interacciones con el citosólico ATPase DotO. Hemos descubierto que DotB muestra un movimiento citosólico en la mayoría de las células bacterianas, lo que indica que este ATPase está presente en una población citosólica dinámica, pero también se asocia con los complejos de puntos polares/icm. Además, DotO forma un conjunto hexamerico de dimers DotO asociados con el complejo de membrana interna, y un hexamer DotB se une a la base de este complejo citoplasmático. El conjunto de la energía DotB-DotO crea un canal citoplasmático que dirige la translocación de sustratos a través del T4SS(Figura 1)10.
A pesar de estos avances recientes, poco se sabe sobre cómo funciona el sistema Dot/Icm y cómo cada proteína se ensambla para formar un aparato activo8. Descubrir los circuitos reguladores del Dot/Icm T4SS es fundamental para entender los mecanismos moleculares de las interacciones huésped-patógeno. Por lo tanto, analizamos cómo utilizar la microscopía de células vivas y crio-ET para detectar y caracterizar los componentes esenciales del sistema L. pneumophila Dot/Icm que están etiquetados con la supercarpeta GFP (sfGFP). Mediante la microscopía cuantitativa de fluorescencia, la localización polar de DotB se definirá en un fondo de tipo salvaje o cuando se elimine el sistema de tipo IV. La microscopía de lapso de tiempo se utilizará para cuantificar las diferencias en la localización y la dinámica entre las ATPases citosólicas Dot/Icm.
La aplicación combinada de dos enfoques complementarios como la imagen en vivo y el crio-ET proporciona una ventaja en comparación con otros sistemas in vitro. Ambos métodos se realizan en celdas intactas y preservan el entorno natural del T4BSS, minimizando así la interrupción de la estructura nativa durante la preparación de la muestra. Debido a que la sobreexpresión de proteínas puede afectar a la estequiometría del aparato de secreción, las fusiones sfGFP se devuelven a través del intercambio alélico al cromosoma Legionella para que cada fusión esté codificada en una sola copia y la expresión sea impulsada por el promotor endógeno. La visualización de fusiones codificadas cromosómicamente permite cuantificar el nivel exacto de proteína expresada en un momento dado definido. Cryo-ET también tiene muchas ventajas para determinar la estructura de los sistemas de secreción. La ventaja más notable es que las muestras crio-ET se componen de células intactas congeladas que preservan complejos nativos en el contexto de la arquitectura celular bacteriana. En consecuencia, el crio-ET puede ser preferible a los enfoques de purificación bioquímica, que extraen complejos de membrana y pueden extraer proteínas periféricas del aparato central o modificar la estructura general. Además, el etiquetado de una proteína de interés con una proteína voluminosa como el sfGFP añade una masa que es detectable por crio-ET y puede ayudar a mapear los diferentes subcomplejos del aparato Punto/Cm en la estructura obtenida por crio-ET.
Este enfoque es una poderosa herramienta para descubrir información estructural sobre complejos multimoleculares que se ensamblan en la membrana celular bacteriana. La interpretación de las estructuras dilucidadas utilizando estas técnicas ayudará al campo a entender cómo funcionan los componentes t4BSS, por qué se requieren tantos componentes para la función, cómo interactúan los componentes dentro del complejo más grande y qué funciones estos subensamblajes de ejecución.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 nm colloidal gold particles</td>
			<td>Aurion</td>
			<td>25486</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100x Plan Apo objective (1.4 NA)</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Activated charcoal</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C5510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agaroze GPG/LMP, low melt</td>
			<td>American bioanalytical</td>
			<td>AB00981</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto dehydrated agar</td>
			<td>BD</td>
			<td>214010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoolSNAP EZ 20 MHz digital monochrome camera</td>
			<td>Photometrics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gene Frame, 1.7x2.8 cm, 125 &#181;L</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AB-0578</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Holey Carbon grid R 2/1 Cu 200 mesh</td>
			<td>Quantifoil</td>
			<td>Q225-CR1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iron(III) nitrate nonahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>216828</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2 Summit camera for cryo-EM</td>
			<td>GATAN</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Cysteine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C7352</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope cover slides 22x22 mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-542B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope cover slides 24x50 mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-545K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides 25x75x1 mm</td>
			<td>Globe Scientific</td>
			<td>1380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SlideBook 6.0</td>
			<td>Intelligent Imaging Innovations</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectra X light engine</td>
			<td>Lumencor</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq 2X Master Mix</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>M0270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Titan Krios</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract</td>
			<td>BD</td>
			<td>212750</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

applying live cell imaging and cryo-electron tomography to resolve spatiotemporal features of the legionella pneumophila dot/icm secretion system

El sistema de secreción de Punto/Cm de Legionella pneumophila es una nanomáquina compleja del sistema de secreción tipo IV (T4SS) que se localiza en el polo bacteriano y media la entrega de proteínas y sustratos de ADN a las células diana, un proceso que generalmente requiere contacto directo de célula a célula. Recientemente hemos resuelto la estructura del aparato Dot/Icm mediante tomografía crioelectrónica (crio-ET) y hemos demostrado que forma un canal de expansión celular que se conecta a un complejo citoplasmático. La aplicación de dos enfoques complementarios que preservan la estructura nativa de la muestra, la microscopía fluorescente en células vivas y crio-ET, permite la visualización in situ de proteínas y la asimilación de la estequiometría y el momento de producción de cada componente de la máquina en relación con otras subunidades Dot/Icm. Para investigar los requisitos para el posicionamiento polar y caracterizar las características dinámicas asociadas con la biogénesis de la máquina T4SS, hemos fusionado un gen que codifica la proteína fluorescente verde de la supercarpeta a los genes DOT/Icm ATPase en sus posiciones nativas en el cromosoma. El siguiente método integra la microscopía cuantitativa de fluorescencia de células vivas y crio-ET para cuantificar la localización polar, la dinámica y la estructura de estas proteínas en células bacterianas intactas. La aplicación de estos enfoques para el estudio de la Legionella pneumophila T4SS es útil para caracterizar la función del sistema Punto/Icm y se puede adaptar para estudiar una amplia variedad de patógenos bacterianos que utilizan el T4SS u otros tipos de complejos de secreción bacteriana.

La recombinación homóloga con doble selección en dos pasos se utilizó para construir la inserción definida de sfGFP. En el primer paso, se realizó el acoplamiento triparental, donde el plásmido conjugado pRK600 (un plásmido IncP) de la cepa auxiliar E. coli MT616 se movilizó a la cepa del donante E. coli con el vector suicida pSR47S que contiene el flanco sfGFP geneado por las dos regiones homólogas, el origen de la orita de transferencia y el gen de la subselección Bacillus subistitulaci...

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Applying Live Cell Imaging and Cryo-Electron Tomography to Resolve Spatiotemporal Features of the Legionella pneumophila Dot/Icm Secretion System

La imagen de células bacterianas es un enfoque de biología de sistemas emergentes centrado en la definición de procesos estáticos y dinámicos que dictan la función de grandes máquinas macromoleculares. Aquí, la integración de imágenes cuantitativas de células vivas y tomografía crioelectrónica se utiliza para estudiar la arquitectura y las funciones del sistema de secreción de legionela pneumophila tipo IV.

Aplicación de imágenes de células vivas y tomografía crioelectrónica para resolver las características espaciotemporales del sistema de secreción de puntos de legionela pneumofilia/Icm

The Dot/Icm secretion system of Legionella pneumophila is a complex type IV secretion system (T4SS) nanomachine that localizes at the bacterial pole and ...

Este protocolo es útil para caracterizar las funciones de montaje de las complejidades de la secreción bacteriana y puede conducir a una comprensión fundamental de los mecanismos moleculares que se requieren para las interacciones de patógenos del huésped. Esta técnica integra enfoques complementarios que preservan la estructura nativa de la muestra y permite y ve a la visualización de complejos de proteínas en células bacterianas intactas. Aumenta nuestra comprensión de las relaciones de función estructural de los sistemas de secreción bacteriana.Este método se puede adaptar para estudiar otros tipos de sistemas de secreción u otros complejos celulares en una amplia variedad de especies bacterianas. Comience por hacer almohadillas de agarosa para imágenes de células vivas. Preparar unos 30 ml de solución de agarosa de fusión 1% baja en agua y microondas en un matraz de vidrio durante unos 90 segundos arremolinando ocasionalmente hasta que la agarosa se disuelva por completo.Coloque dos diapositivas de vidrio de 22 por 22 por 0,15 mm en el borde de un deslizable de vidrio de 25 por 75 por 1,1 mm uno encima del otro. A continuación, apile dos diapositivas más más en el otro borde. Pipetear aproximadamente 1 ml de la agarosa fundida en el tobogán central entre los dos portaobjetos de vidrio superior y colocar otro gran portaobjetos en la parte superior de la agarosa fundida asegurándose de evitar la formación de burbujas de aire.Enfríe los portaobjetos a cuatro grados centígrados durante 15 minutos y luego use un bisturí o una cuchilla de afeitar para cortar suavemente la almohadilla en cuadrados pequeños. Fije un marco adhesivo de doble cara en una diapositiva de vidrio de 25 por 75 por 1,1 mm y coloque varias almohadillas en la diapositiva. Disolver un parche pesado de Legionella Pneumophila en 1 ml de agua doble destilada.A continuación, vórtice y pipeta de dos a tres microlitros de la dilución en las almohadillas. Coloque suavemente un resbalón de cubierta de 58 por 24 por 0,15 mm sobre el marco adhesivo. Seleccione celdas para imágenes utilizando iluminación de campo brillante.A continuación, en la ventana de captura del software del microscopio, ajuste el ND a 180 y el binning a dos por dos. Utilice el canal de 488 nanómetros para exponer la muestra durante 500 a 1000 milisegundos y validar la especificidad de la fluorescencia mediante la toma de imágenes de Legionella Pneumophila sin etiquetar con los mismos parámetros. Para cuantificar la polaridad, ajuste el contraste de la imagen para que las bacterias sean claramente visibles.A continuación, haga zoom en la región de interés y utilice la herramienta de región para colocar un rectángulo de 0,25 por 1,3 micrómetros comenzando en el polo y extendiéndose en el citoplasma asegurándose de que el rectángulo permanezca dentro de los bordes bacterianos. Marque al menos 200 bacterias y cree máscaras utilizando el botón región para enmascarar en el menú Analizar. Haga clic en las estadísticas de la máscara y elija el objeto bajo el alcance de la máscara.A continuación, marque la intensidad media y la varianza en características e intensidad. Exporte los datos como un archivo de texto y utilice la aplicación de hoja de cálculo para calcular las puntuaciones de polaridad de cada bacteria como la relación entre la varianza y la intensidad media. Para aplicaciones de alto rendimiento, utilice la microscopía de contraste facial para adquirir imágenes de doble canal.Asegúrese de elegir los campos de vista donde las bacterias están completamente separadas. A continuación, ajuste el contraste del canal facial de la imagen a un nivel en el que las bacterias sean claramente visibles. Abra la imagen de doble canal e inicie la ventana crear máscara de segmento.Ajuste el umbral adecuado y, a continuación, elimine los objetos pequeños haciendo clic en el botón Definir objetos y ajustando el tamaño mínimo a 100 píxeles. En Máscara de refinamiento, seleccione Eliminar objetos de bordes y máscaras separadas de bacterias adyacentes entre sí. Para cuantificar la dinámica de las proteínas de fusión, abra la ventana de captura de imágenes y marque el lapso de tiempo.Introduzca dos en el cuadro Número de puntos de tiempo. Adquiera dos imágenes exitosas de Legionella Pneumophila expresando la proteína fluorescente de interés. Ajuste el contraste de la imagen hasta que las celdas sean claramente visibles.A continuación, utilice la herramienta de región para colocar un cuadrado de 0,25 por 0,25 micrómetros en el medio de al menos 400 celdas. A continuación, utilice el botón región para enmascarar en el menú Analizar para crear una máscara de los cuadrados de interés. Crea una nueva máscara vacía y usa la herramienta de píxeles para marcar toda el área de celda de al menos 25 celdas aleatorias.Cree otra máscara y utilice la herramienta de pincel grande para marcar áreas entre las celdas. Por último, seleccione las estadísticas de máscara y asegúrese de que el objeto está seleccionado en el ámbito de máscara para la máscara uno. En Características e intensidad, elija la intensidad media.Exporte los datos y repita el proceso para la máscara 2. Para la máscara 3, seleccione toda la máscara y exporte la intensidad media. Para preparar la muestra de criotomografía de electrones, haga crecer un parche pesado de Legionella Pneumophila en placas CYE Agrastreptomisum durante 48 horas a 37 grados centígrados.Resuspender las células en agua a un OD 600 de aproximadamente 0.7. A continuación, agregue cinco microlitros de partículas de oro coloidal a 20 microlitros de la suspensión celular. Glow descarga una rejilla de carbono holey y pipeta cinco microlitros de la mezcla celular en ella.Déjalo reposar un minuto. Borre la rejilla con papel de filtro y congénelo en etano líquido utilizando un aparato de émbolo accionado por gravedad. Después de insertar la supercarpeta GFP en el cromosoma Legionella Pneumophila, se realizó una microscopía fluorescente de células vivas para comparar la señal fluorescente con la de la cepa negativa GFP supercarpeta parental.Además, se utilizó una microscopía de campo brillante para examinar la proporción de células con una señal fluorescente específica. Sólo una fracción de las células que produjeron dotB superfolder GFP mostró la localización polar de la proteína de fusión. Al caracterizar la distribución de la señal fluorescente DotB, se encontró que la intensidad de la supercarpeta DotB GFP en los polos era aproximadamente dos veces mayor que en el citosol.Para investigar si la localización polar GFP de la supercarpeta DotB dependía de un sistema de secreción de tipo cuatro completamente ensamblado, se determinaron las puntuaciones de polaridad de la supercarpeta DotB GFP para células individuales en un tipo salvaje, y en un sistema de secreción tipo cuatro mutante. De hecho, el posicionamiento polar de la supercarpeta DotB GFP desapareció cuando se eliminó el sistema Dot/ICM. Los patrones dinámicos indicaban que el DotB ATPase estaba presente en una población citosólica dinámica y fue reclutado para el sistema de secreción de tipo cuatro Punto/ICM localizado polar en una reacción de ensamblaje en etapa tardía.Crio-ET de alto rendimiento se utilizó para visualizar el aparato del sistema de secreción de tipo cuatro intacto en una cepa de Legionella Pneumophila que expresa la supercarpeta DotB GFP. La reconstrucción de la célula reveló varias máquinas Dot/ICM incrustadas en el sobre de la celda. También se determinó el posicionamiento general de DotB y superfolder GFP en relación con la máquina del sistema de secreción de tipo cuatro intacta.Las representaciones superficiales tridimensionales indicaron que la supercarpeta GFP se coloca debajo del hexámero DotB, que se ensambla como un disco en la base del complejo ATPase citoplasmático. Al intentar esta técnica, asegúrese de evaluar la estabilidad de las proteínas de fusión y la funcionalidad del sistema de secreción de etiquetas antes de proceder a la adquisición de imágenes. El modelado y el ajuste pueden ser formas eficaces de analizar los patrones dinámicos y las densidades estructurales, así como para la evaluación de los cambios de conformacionalización o la localización de subunidades en la estructura.Este enfoque puede ayudar a comprender cómo funcionan los distintos componentes secretos del sistema, cómo interactúan dentro del complejo mayor y qué funciones realizan los distintos subensamblajes.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Applying Live Cell Imaging and Cryo-Electron Tomography to Resolve Spatiotemporal Features of the Legionella pneumophila Dot/Icm Secretion System

Determination of Molecular Structures of HIV Envelope Glycoproteins using Cryo-Electron Tomography and Automated Sub-tomogram Averaging

Determinación de estructuras moleculares de glicoproteínas de la envoltura del VIH con Cryo-tomografía electrónica y automatizada promedio Sub-tomografía

Since its discovery nearly 30 years ago, more than 60 million people have been infected with the human immunodeficiency virus (HIV) (www.usaid.gov). The ...

Investigación

Inmunología e Infección

Use of an Optical Trap for Study of Host-Pathogen Interactions for Dynamic Live Cell Imaging

El uso de una trampa óptica para el estudio de interacciones huésped-patógeno de imágenes dinámicas de células vivas

Dynamic live cell imaging allows direct visualization of real-time interactions between cells of the immune system1, 2; however, the lack of spatial and ...

Real-time Live Imaging of T-cell Signaling Complex Formation

En tiempo real de imágenes en vivo de las células T de señalización Formación de complejos

Protection against infectious diseases is mediated by the immune system 1,2. T lymphocytes are the master coordinators of the immune system, regulating ...

Live Cell Imaging of Alphaherpes Virus Anterograde Transport and Spread

Móvil en vivo de imágenes de Alphaherpes Virus Transporte anterógrada y Propagación

Advances in live cell fluorescence microscopy  techniques, as well as the construction of recombinant viral strains that  express fluorescent fusion ...

Use of Galleria mellonella as a Model Organism to Study Legionella pneumophila Infection

Use of Galleria mellonella as a Model Organism to Study Legionella pneumophila Infection

El uso de<em&gt; Galleria mellonella</em&gt; Como organismo modelo para estudiar<em&gt; Legionella pneumophila</em&gt; Infección

Legionella pneumophila, the causative agent of a severe pneumonia named Legionnaires&#39; disease, is an important human pathogen that infects and ...

Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes

Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes

Imaging InlC secreción de investigar la infección celular por el patógeno bacteriano<em&gt; Listeria monocytogenes</em

Bacterial intracellular  pathogens can be conceived as molecular tools to dissect cellular signaling  cascades due to their capacity to exquisitely ...

Applying an Inducible Expression System to Study Interference of Bacterial Virulence Factors with Intracellular Signaling

La aplicación de un sistema de expresión inducible para el Estudio de la interferencia de los factores de virulencia bacteriana con Señalización Intracelular

The technique presented here allows one to analyze at which step a target protein, or alternatively a small molecule, interacts with the components of a ...

Legionella pneumophila Outer Membrane Vesicles: Isolation and Analysis of Their Pro-inflammatory Potential on Macrophages

Legionella pneumophila Outer Membrane Vesicles: Isolation and Analysis of Their Pro-inflammatory Potential on Macrophages

Legionella pneumophila exterior vesículas de membrana: Aislamiento y análisis de su potencial pro-inflamatoria en los macrófagos

Bacteria are able to secrete a variety of molecules via various secretory systems. Besides the secretion of molecules into the extracellular space or ...

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

Un novedoso sistema de alimentador-libre para la producción masiva de células de asesino naturales murinos In Vitro

Natural killer (NK) cells belong to the innate immune system and are a first-line anti-cancer immune defense; however, they are suppressed in the tumor ...

Isolation, Fixation, and Immunofluorescence Imaging of Mouse Adrenal Glands

Aislamiento, fijación y proyección de imagen de inmunofluorescencia de las glándulas suprarrenales de ratón

Immunofluorescence is a well-established technique for detection of antigens in tissues with the employment of fluorochrome-conjugated antibodies and has ...