Name: applying live cell imaging and cryo-electron tomography to resolve spatiotemporal features of the legionella pneumophila dot/icm secretion system
Uploaded: 2020-03-10T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Applying Live Cell Imaging and Cryo-Electron Tomography to Resolve Spatiotemporal Features of the Legionella pneumophila Dot/Icm Secretion System at JoVE.com

D.C. och C.R.R. stöddes av NIH (R37AI041699 och R21AI130671). D.P., B.H., och J.L stöddes av National Institutes of Health (R01AI087946 och R01GM107629).

OBS: Alla förfaranden som innebär tillväxt, manipulering och avbildning av L. pneumophila bör utföras i ett biologiskt säkerhetsnivå 2-laboratorium i enlighet med lokala riktlinjer.
1. Införande av sfGFP i L. pneumophila kromosom med hjälp av allelisk utbyte och dubbel urvalsstrategi(figur 2, figur 3)
<ol><li>Klona in i genersättningsvektorn pSR47S11 följande sekvens: 1 000 bp:n u...

<ol>
	<li>Franco, I. S., Shuman, H. A., Charpentier, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+perplexing+functions+and+surprising+origins+of+Legionella+pneumophila+type+IV+secretion+effectors.">The perplexing functions and surprising origins of Legionella pneumophila type IV secretion effectors.</a> Cellular Microbiology. 11, 1435-1443 (2009).</li><li>Burstein, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-scale+identification+of+Legionella+pneumophila+effectors+using+a+machine+learning+approach.">Genome-scale identification of Legionella pneumophila effectors using a machine learning approach.</a> PLOS Pathogens. 5, 1000508 (2009).</li><li>Ninio, S., Roy, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effector+proteins+translocated+by+Legionella+pneumophila:+strength+in+numbers.">Effector proteins translocated by Legionella pneumophila: strength in numbers.</a> Trends in Microbiology. 15, 372-380 (2007).</li><li>Vogel, J. P., Andrews, H. L., Wong, S. K., Isberg, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conjugative+transfer+by+the+virulence+system+of+Legionella+pneumophila.">Conjugative transfer by the virulence system of Legionella pneumophila.</a> Science. 279, 873-876 (1998).</li><li>Isberg, R. R., O'Connor, T. J., Heidtman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Legionella+pneumophila+replication+vacuole:+making+a+cosy+niche+inside+host+cells.">The Legionella pneumophila replication vacuole: making a cosy niche inside host cells.</a> Nature Reviews Microbiology. 7, 13-24 (2009).</li><li>Roy, C. R., Berger, K. H., Isberg, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Legionella+pneumophila+DotA+protein+is+required+for+early+phagosome+trafficking+decisions+that+occur+within+min+of+bacterial+uptake.">Legionella pneumophila DotA protein is required for early phagosome trafficking decisions that occur within min of bacterial uptake.</a> Molecular Microbiology. 28, 663-674 (1998).</li><li>Archer, K. A., Roy, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MyD88-Dependent+Responses+Involving+Toll-Like+Receptor+2+Are+Important+for+Protection+and+Clearance+of+Legionella+pneumophila+in+a+Mouse+Model+of+Legionnaires'+Disease.">MyD88-Dependent Responses Involving Toll-Like Receptor 2 Are Important for Protection and Clearance of Legionella pneumophila in a Mouse Model of Legionnaires' Disease.</a> Infection and Immunity. 74, 3325-3333 (2006).</li><li>Nagai, H., Kubori, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+IVB+Secretion+Systems+of+Legionella+and+Other+Gram-Negative+Bacteria.">Type IVB Secretion Systems of Legionella and Other Gram-Negative Bacteria.</a> Frontiers in Microbiology. 2, 136 (2011).</li><li>Kubori, T., Nagai, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Type+IVB+secretion+system:+an+enigmatic+chimera.">The Type IVB secretion system: an enigmatic chimera.</a> Current Opinion in Microbiology. 29, 22-29 (2016).</li><li>Chetrit, D., Hu, B., Christie, P. J., Roy, C. R., Liu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+unique+cytoplasmic+ATPase+complex+defines+the+Legionella+pneumophila+type+IV+secretion+channel.">A unique cytoplasmic ATPase complex defines the Legionella pneumophila type IV secretion channel.</a> Nature Microbiology. 3, 678-686 (2018).</li><li>Merriam, J. J., Mathur, R., Maxfield-Boumil, R., Isberg, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+Legionella+pneumophila+fliI+gene:+intracellular+growth+of+a+defined+mutant+defective+for+flagellum+biosynthesis.">Analysis of the Legionella pneumophila fliI gene: intracellular growth of a defined mutant defective for flagellum biosynthesis.</a> Infection and Immunity. 65, 2497-2501 (1997).</li><li>Feeley, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Charcoal-yeast+extract+agar:+primary+isolation+medium+for+Legionella+pneumophila.">Charcoal-yeast extract agar: primary isolation medium for Legionella pneumophila.</a> Journal of Clinical Microbiology. 10, 437-441 (1979).</li><li>Andrews, H. L., Vogel, J. P., Isberg, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+linked+Legionella+pneumophila+genes+essential+for+intracellular+growth+and+evasion+of+the+endocytic+pathway.">Identification of linked Legionella pneumophila genes essential for intracellular growth and evasion of the endocytic pathway.</a> Infection and Immunity. 66, 950-958 (1998).</li><li>Morado, D. R., Hu, B., Liu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+Tomoauto:+A+Protocol+for+High-throughput+Automated+Cryo-electron+Tomography.">Using Tomoauto: A Protocol for High-throughput Automated Cryo-electron Tomography.</a> Journal of Visualized Experiments. (107), e53608 (2016).</li><li>Hu, B., Lara-Tejero, M., Kong, Q., Galan, J. E., Liu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Situ+Molecular+Architecture+of+the+Salmonella+Type+III+Secretion+Machine.">In Situ Molecular Architecture of the Salmonella Type III Secretion Machine.</a> Cell. 168, 1065-1074 (2017).</li><li>Mastronarde, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+electron+microscope+tomography+using+robust+prediction+of+specimen+movements.">Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements.</a> Journal of Structural Biology. 152, 36-51 (2005).</li><li>Zheng, S. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MotionCor2:+anisotropic+correction+of+beam-induced+motion+for+improved+cryo-electron+microscopy.">MotionCor2: anisotropic correction of beam-induced motion for improved cryo-electron microscopy.</a> Nature Methods. 14, 331-332 (2017).</li><li>Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computer+visualization+of+three-dimensional+image+data+using+IMOD.">Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD.</a> Journal of Structural Biology. 116, 71-76 (1996).</li><li>Gilbert, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Iterative+methods+for+the+three-dimensional+reconstruction+of+an+object+from+projections.">Iterative methods for the three-dimensional reconstruction of an object from projections.</a> Journal of Theoretical Biology. 36, 105-117 (1972).</li><li>Radermacher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Weighted+Back-projection+Methods.">Weighted Back-projection Methods.</a> Electron Tomography. , 245-273 (2007).</li><li>Winkler, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tomographic+subvolume+alignment+and+subvolume+classification+applied+to+myosin+V+and+SIV+envelope+spikes.">Tomographic subvolume alignment and subvolume classification applied to myosin V and SIV envelope spikes.</a> Journal of Structural Biology. 165, 64-77 (2009).</li><li>Winkler, H., Taylor, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+marker-free+alignment+with+simultaneous+geometry+determination+and+reconstruction+of+tilt+series+in+electron+tomography.">Accurate marker-free alignment with simultaneous geometry determination and reconstruction of tilt series in electron tomography.</a> Ultramicroscopy. 106, 240-254 (2006).</li><li>Prevost, M. S., Waksman, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-ray+crystal+structures+of+the+type+IVb+secretion+system+DotB+ATPases.">X-ray crystal structures of the type IVb secretion system DotB ATPases.</a> Protein Science. 27, 1464-1475 (2018).</li><li>Miklos, G. L., Rubin, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+the+genome+project+in+determining+gene+function:+insights+from+model+organisms.">The role of the genome project in determining gene function: insights from model organisms.</a> Cell. 86, 521-529 (1996).</li><li>Reyrat, J. M., Pelicic, V., Gicquel, B., Rappuoli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Counterselectable+markers:+untapped+tools+for+bacterial+genetics+and+pathogenesis.">Counterselectable markers: untapped tools for bacterial genetics and pathogenesis.</a> Infection and Immunity. 66, 4011-4017 (1998).</li><li>Yu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Molecule+Studies+in+Live+Cells.">Single-Molecule Studies in Live Cells.</a> Annual Review of Physical Chemistry. 67, 565-585 (2016).</li><li>Stewart, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-electron+microscopy+and+cryo-electron+tomography+of+nanoparticles.">Cryo-electron microscopy and cryo-electron tomography of nanoparticles.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: Nanomedicine and Nanobiotechnology. 9, (2017).</li></ol>

Att klargöra funktionerna i bakteriellsekret system är nyckeln till en fullständig förståelse av värdpatogena interaktioner. Sekretsystem är komplexa maskiner som kan injicera effektorproteiner i värdceller, och i vissa fall främja inrättandet av en subcellulär nisch som stöder bakteriell replikering. Ovanstående metod ger viktiga nya verktyg för att studera Dot / Icm sekret systemet av luftvägarna bakteriell patogen Legionella pneumophila, ger ledtrådar till mekanismer för effektor flyttning so...

Legionella pneumophila (L. pneumophila), det etiologiska medlet för legionärssjuka, bebor sötvattenreservoarer, där bakterierna propagerar genom att infektera och replikera inom vattenlevande frisimning protozoer. L. pneumophila orsakar sjukdomsutbrott hos människor när inandning av aerosoliserade bakterier från dricksvattenkällor uppstår. I infekterade celler, subversion av värdvägar tillåter L. pneumophila att fördröja endocytic mognad av vacuole där den bor och att främja biogenes av ett cellulärt fack som stöder bakteriell replikering. Denna process drivs av en specialiserad bakteriell typ IVB sekret system (T4BSS) känd som Dot / Icm och dess repertoar av över 300 "effector" proteiner som transplaceras i värden cytosol under infektion för att underlätta manipulation av cellulära funktioner1,2,3,4,5. Mutanter som saknar en funktionell Dot/Icm-apparat misslyckas med att leverera effektorer till värden cytosol, är defekta för intracellulär replikering och är avirulent i djurmodeller av sjukdom6,7.
Många bakteriearter har utvecklat extremt komplexa och dynamiska multikomponentmaskiner som krävs för infektionsprocesser. Andra T4BSS som Dot / Icm systemet är också viktigt för intracellulär replikering av bakteriella patogener som Coxiella burnetii och Rickettsiella grylli. Även om T4BSS är evolutionärt relaterade till prototypiska typ IVA-system, som förmedlar DNA-överföring och kan leverera en begränsad repertoar av effektorproteiner, har Dot/Icm-systemet nästan dubbelt så många maskinkomponenter och levererar en mängd olika effektorer. Förmodligen har denna expansion i antalet komponenter gjort det möjligt för Dot / Icm apparaten att rymma och integrera nya effektorer lätt8,9.
Vi använde nyligen kryoelektrontomografi (cryo-ET) för att lösa strukturen på Dot / Icm apparaten på plats och visade att den bildar en cell kuvert-spänner kanal som ansluter till en cytoplasmatisk komplex. Ytterligare analys visade att cytosolic ATPase DotB associerar med Dot / Icm systemet vid L. pneumophila cellpolen genom interaktioner med cytosolic ATPase DotO. Vi har upptäckt att DotB visar en cyklisk rörelse i de flesta bakterieceller, vilket tyder på att denna ATPase finns i en dynamisk cyklisk population men också associerar med polardot/Icm-komplexen. Dessutom bildar DotO en hexameric montering av DotO dimers i samband med det inre membrankomplexet, och en DotB hexamer ansluter sig till basen av detta cytoplasmatiska komplex. Monteringen av DotB-DotO energikomplex skapar en cytoplasmatisk kanal som leder flyttningen av substrat genom T4SS(figur 1)10.
Trots dessa senaste framsteg, är lite känt om hur Dot / Icm systemet fungerar och hur varje protein monteras för att bilda en aktiv apparat8. Att upptäcka de regulatoriska kretsarna i Dot/Icm T4SS är grundläggande för att förstå de molekylära mekanismerna för värdpatogena interaktioner. Därför diskuterar vi hur man använder levande cellmikroskopi och cryo-ET för att upptäcka och karakterisera viktiga L. pneumophila Dot / Icm systemkomponenter som är märkta med super-mapp GFP (sfGFP). Med kvantitativ fluorescensmikroskopi definieras polarlokaliseringen av DotB i en bakgrund av vild typ eller när typ IV-systemet tas bort. Time-lapse mikroskopi kommer att användas för att kvantifiera skillnader i lokalisering och dynamik mellan Dot / Icm cykliska ATPases.
Den kombinerade tillämpningen av två kompletterande metoder såsom live imaging och cryo-ET ger en fördel jämfört med andra in vitro-system. Båda metoderna utförs i intakta celler och bevarar den naturliga miljön i T4BSS, vilket minimerar störningar i den inhemska strukturen under provberedningen. Eftersom överuttryck av proteiner kan försämra sekretapparatens stoichiometry returneras sfGFP-fusioner via allelisk utbyte till Legionellakromosomen så att varje fusion kodas i ett enda exemplar och uttrycket drivs av den endogena promotorn. Visualisering av kromosomallykodade fusioner möjliggör kvantifiering av den exakta proteinnivån som uttrycks vid en definierad tidpunkt. Cryo-ET har också många fördelar för att bestämma strukturen av sekretsystem. Den mest anmärkningsvärda fördelen är att cryo-ET prover består av frysta intakta celler som bevarar inhemska komplex i samband med bakteriell cell arkitektur. Följaktligen kan cryo-ET vara att föredra framför biokemiska reningsmetoder, som extraherar membrankomplex och kan ta bort perifera proteiner från kärnapparaten eller ändra den övergripande strukturen. Dessutom lägger märkning ett protein av intresse med ett skrymmande protein som sfGFP en massa som kan detekteras genom cryo-ET och kan hjälpa till med att kartlägga de olika underkomplex av Dot / Icm apparaten på den struktur som erhålls genom cryo-ET.
Detta tillvägagångssätt är ett kraftfullt verktyg för att avslöja strukturell information om multimolekylära komplex som monteras i bakteriecellmembranet. Tolkningen av strukturer som klarlagts med hjälp av dessa tekniker kommer att hjälpa fältet att förstå hur T4BSS-komponenter fungerar, varför så många komponenter krävs för funktion, hur komponenterna interagerar inom det större komplexet och vilka funktioner dessa underenheter utförs.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 nm colloidal gold particles</td>
			<td>Aurion</td>
			<td>25486</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100x Plan Apo objective (1.4 NA)</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Activated charcoal</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C5510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agaroze GPG/LMP, low melt</td>
			<td>American bioanalytical</td>
			<td>AB00981</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto dehydrated agar</td>
			<td>BD</td>
			<td>214010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoolSNAP EZ 20 MHz digital monochrome camera</td>
			<td>Photometrics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gene Frame, 1.7x2.8 cm, 125 &#181;L</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AB-0578</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Holey Carbon grid R 2/1 Cu 200 mesh</td>
			<td>Quantifoil</td>
			<td>Q225-CR1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iron(III) nitrate nonahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>216828</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2 Summit camera for cryo-EM</td>
			<td>GATAN</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Cysteine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C7352</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope cover slides 22x22 mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-542B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope cover slides 24x50 mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-545K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides 25x75x1 mm</td>
			<td>Globe Scientific</td>
			<td>1380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SlideBook 6.0</td>
			<td>Intelligent Imaging Innovations</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectra X light engine</td>
			<td>Lumencor</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq 2X Master Mix</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>M0270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Titan Krios</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract</td>
			<td>BD</td>
			<td>212750</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

applying live cell imaging and cryo-electron tomography to resolve spatiotemporal features of the legionella pneumophila dot/icm secretion system

Dot/Icm sekretionsystem av Legionella pneumophila är en komplex typ IV sekretion system (T4SS) nanomaskin som lokaliserar vid bakteriepolen och förmedlar leverans av protein och DNA substrat för att rikta celler, en process som i allmänhet kräver direkt cell-till-cell kontakt. Vi har nyligen löst strukturen på Dot / Icm apparaten genom cryo-elektrontomografi (cryo-ET) och visade att den bildar en cell kuvert-spänner kanal som ansluter till en cytoplasmatisk komplex. Tillämpa två kompletterande metoder som bevarar den inhemska strukturen av exemplaret, fluorescerande mikroskopi i levande celler och cryo-ET, möjliggör in situ visualisering av proteiner och assimilering av stoichiometry och tidpunkten för produktionen av varje maskinkomponent i förhållande till andra Dot / Icm underenheter. För att undersöka kraven för polarpositionering och att karakterisera dynamiska funktioner i samband med T4SS maskin biogenesis, har vi smält en gen kodning supermapp grönt fluorescerande protein till Dot / Icm ATPase gener på sina inhemska positioner på kromosomen. Följande metod integrerar kvantitativ fluorescensmikroskopi av levande celler och cryo-ET för att kvantifiera polarlokalisering, dynamik och struktur av dessa proteiner i intakta bakterieceller. Tillämpa dessa metoder för att studera Legionella pneumophila T4SS är användbart för att karakterisera funktionen av Dot / Icm systemet och kan anpassas för att studera en mängd olika bakteriella patogener som använder T4SS eller andra typer av bakteriell sekretion komplex.

Homolog rekombination med dubbelval i två steg användes för att konstruera den definierade insättningen av sfGFP. I det första steget utfördes triparental parning, där pRK600 konjugativplasmid (en IncP plasmid) från E. coli helper stam MT616 mobiliserades till givaren E. coli stam med självmord vektor pSR47S som innehåller sfGFP genen flankerad av de två homologa regionerna, ursprunget till överföring oriT och Bacillus subtilis counterselection gensacB. Därefter assistera...

Watch this Scientific Journal Video about Applying Live Cell Imaging and Cryo-Electron Tomography to Resolve Spatiotemporal Features of the Legionella pneumophila Dot/Icm Secretion System at JoVE.com

Applying Live Cell Imaging and Cryo-Electron Tomography to Resolve Spatiotemporal Features of the Legionella pneumophila Dot/Icm Secretion System

Bildbehandling av bakterieceller är en framväxande systembiologi strategi inriktad på att definiera statiska och dynamiska processer som dikterar funktionen av stora makromolekylära maskiner. Här används integrering av kvantitativ levande cellavbildning och kryoelektrontomografi för att studera Legionella pneumophila typ IV sekretion system arkitektur och funktioner.

Tillämpa Live Cell Imaging och Cryo-Electron Tomografi för att lösa Spatiotemporal Funktioner i Legionella pneumophila Dot / Icm Sekretion System

The Dot/Icm secretion system of Legionella pneumophila is a complex type IV secretion system (T4SS) nanomachine that localizes at the bacterial pole and ...

Detta protokoll är användbart för att karakterisera de monteringsfunktioner av bakteriell sekretion komplex och kan leda till en grundläggande förståelse av de molekylära mekanismer som krävs för värd patogen interaktioner. Denna teknik integrerar kompletterande tillvägagångssätt som bevarar den inhemska strukturen av provet och gör det möjligt och se till visualisering av proteiner komplex i intakta bakterieceller. Det ökar vår förståelse av de strukturella funktionssambanden hos bakteriesekretionssystem.Denna metod kan anpassas för att studera andra typer av utsöndringssystem eller andra cellulära komplex i en mängd olika bakteriearter. Börja med att göra agarose kuddar för levande cell imaging. Förbered ca 30 mL av 1%låg smälta agaroslösning i vatten och mikrovågor den i en glaskolv i ca 90 sekunder virvlande det ibland tills agaros är helt upplöst.Placera två 22 av 22 av 0.15mm glas diabilder på kanten av en 25 av 75 av 1,1 mm glas glida ovanpå den andra. Sedan, stapla ytterligare två av de mindre bilderna på den andra kanten. Pipett ca 1 mL av den smälta agaros in i centrum glida mellan de två övre glasglas och placera en annan stor bild på toppen av den smälta agaros se till att undvika bildandet av luftbubblor.Kyl diabilderna i fyra grader celsius i 15 minuter och använd sedan en skalpell eller ett rakblad för att försiktigt skära dynan i små rutor. Fixera en dubbelsidig självhäftande ram på en 25 gånger 75 gånger 1,1 mm glasrutschkana och placera flera dynor på bilden. Lös upp en tung plåster av Legionella Pneumophila i 1 mL dubbeldestillerat vatten.Sedan virvel och pipetter två till tre mikroliter av utspädningen på kuddar. Placera försiktigt en 58 med 24 med 0,15 mm täckslir över den självhäftande ramen. Välj celler för avbildning med hjälp av ljusstark fältbelysning.Sedan, i fångstfönstret i mikroskopets programvara, Justera ND till 180 och binning till två och två. Använd nanometerkanalen 488 för att exponera provet för 500 till 1000 millisekunder och validera fluorescensens specificitet genom att avbilda untagged Legionella Pneumophila med samma parametrar. För att kvantifiera polariteten justerar du bildkontrasten så att bakterierna syns tydligt.Sedan zooma in på den region av intresse och använda regionen verktyget för att placera en 0,25 med 1,3 mikrometer rektangel börjar vid polen och sträcker sig in i cytoplasman se till att rektangeln förblir inom bakteriegränserna. Markera minst 200 bakterier och skapa masker genom att använda regionen för att maskera knappen i analysera-menyn. Klicka på mask statistik och välj objekt under mask omfattning.Markera sedan medelintensitet och varians under funktioner och intensitet. Exportera data som en textfil och använd kalkylprogram för att beräkna polaritetspoängen för varje bakterie som förhållandet mellan variansen och medelintensiteten. För hög genomströmning program använda ansiktskontrast mikroskopi att skaffa dual channel bilder.Se till att välja synfält där bakterierna är helt åtskilda. Därefter justerar du bildens ansiktskanalkontrast till en nivå där bakterierna syns tydligt. Öppna den dubbla kanalbilden och starta fönstret skapa segmentmask.Justera lämpligt tröskelvärde, ta sedan bort de små objekten genom att klicka på knappen definiera objekt och justera minsta storlek till 100 pixlar. Under förfina mask, markera ta bort kanter objekt och separata masker av bakterier som ligger intill varandra. För att kvantifiera fusionsproteinernas dynamik öppnar du bildfångstfönstret och markerar tidsfördröjning.Ange två i rutan för antal tidspoäng. Förvärva två framgångsrika bilder av Legionella Pneumophila uttrycker fluorescerande protein av intresse. Justera bildkontrasten tills cellerna syns tydligt.Använd sedan regionverktyget för att placera en 0,25 gånger 0,25 mikrometer kvadrat i mitten av minst 400 celler. Därefter använder du knappen region för att maskera i menyn analysera för att skapa en mask av rutor av intresse. Skapa en ny tom mask och använd pixelverktyget för att markera hela cellområdet med minst 25 slumpmässiga celler.Skapa en annan mask och använd det stora penselverktyget för att markera områden mellan cellerna. Slutligen väljer du maskstatistik och ser till att objektet är markerat under maskomfattning för mask ett. Under funktioner och intensitet, välj medel intensitet.Exportera data och upprepa processen för mask 2. För mask 3 markerar du hela masken och exporterar medelintensiteten. För att förbereda elektron kryotomografi provet, växa en tung lapp av Legionella Pneumophila på CYE Agrastreptomisum plattor för 48 timmar vid 37 grader Celsius.Resuspend cellerna i vatten till en OD 600 på ca 0,7. Tillsätt sedan fem mikroliter av kolloidala guldpartiklar till 20 mikroliter av cellupphängningen. Glow ansvarsfrihet en holey kolgaller och pipetter fem mikroliter av cellblandningen på den.Låt den stå i en minut. Blot gallret med filterpapper och frysa den i flytande etan med hjälp av en gravitationsdriven kolvapparat. Efter att ha satt in supermapp GFP i Legionella Pneumophila kromosom, utfördes levande cell fluorescerande mikroskopi att jämföra fluorescerande signalen med den av föräldrarnas superfolder GFP negativ stam.Dessutom användes ljust fältmikroskopi för att undersöka andelen celler med en specifik fluorescerande signal. Endast en bråkdel av de celler som producerade DotB supermapp GFP visas polar lokalisering av fusionsproteinet. När karakterisera fördelningen av DotB fluorescerande signal, konstaterades det att intensiteten av DotB supermappen GFP vid polerna var ungefär två gånger högre än i cytosol.För att undersöka om DotB superfolder GFP polarlokalisation var beroende av en helt monterade typ fyra sekretion system, polaritet betyg av DotB superfolder GFP fastställdes för enskilda celler i en vild typ, och i en typ fyra sekretion system mutant. Faktum är att polarpositionering av DotB superfolder GFP försvann när Dot /ICM-systemet togs bort. Dynamiska mönster anges att DotB ATPase var närvarande i en dynamisk cytosolic befolkningen och rekryterades till den polariserade lokaliserade Dot/ICM typ fyra sekretion systemet i ett sent skede montering reaktion.Hög genomströmning cryo-ET användes för att visualisera intakt typ fyra sekretion system apparater i en Legionella Pneumophila stam uttrycker DotB superfolder GFP. Återuppbyggnaden av cellen avslöjade flera Dot/ICM maskiner inbäddade i cellen kuvertet. Den övergripande positionering av DotB och superfolder GFP i förhållande till intakt typ fyra sekretion systemmaskin fastställdes också.Tredimensionella ytåtergivningar indikerade att supermappen GFP är placerad under DotB-hexamer, som monteras som en skiva vid basen av det cytoplasmatiska ATPase-komplexet. När du försöker denna teknik, se till att bedöma stabiliteten i fusionsproteiner och funktionaliteten i taggen utsöndring systemet innan du fortsätter till bild förvärv. Modellering och montering kan vara effektiva sätt att analysera de dynamiska mönster och strukturella tätheter samt för utvärdering av konformationella förändringar eller lokalisering av underenheter i strukturen.Detta tillvägagångssätt kan hjälpa till att förstå hur olika typ fyra hemliga systemkomponenter fungerar, hur de interagerar inom det större komplexet och vilka funktioner olika delmontage utför.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Applying Live Cell Imaging and Cryo-Electron Tomography to Resolve Spatiotemporal Features of the Legionella pneumophila Dot/Icm Secretion System

Determination of Molecular Structures of HIV Envelope Glycoproteins using Cryo-Electron Tomography and Automated Sub-tomogram Averaging

Fastställande av molekylära strukturer av HIV Envelope Glycoproteins med Cryo-elektrontomografi och automatisk Sub-tomogram Snittar

Since its discovery nearly 30 years ago, more than 60 million people have been infected with the human immunodeficiency virus (HIV) (www.usaid.gov). The ...

Use of an Optical Trap for Study of Host-Pathogen Interactions for Dynamic Live Cell Imaging

Användning av en optisk fälla för studier av Host-patogen interaktioner för Dynamic levande cell imaging

Dynamic live cell imaging allows direct visualization of real-time interactions between cells of the immune system1, 2; however, the lack of spatial and ...

Real-time Live Imaging of T-cell Signaling Complex Formation

Real-time Live avbildning av T-cellsignalering Complex Formation

Protection against infectious diseases is mediated by the immune system 1,2. T lymphocytes are the master coordinators of the immune system, regulating ...

Live Cell Imaging of Alphaherpes Virus Anterograde Transport and Spread

Levande cell imaging av Alphaherpes Virus Anterograd Transport och Spread

Advances in live cell fluorescence microscopy  techniques, as well as the construction of recombinant viral strains that  express fluorescent fusion ...

Use of Galleria mellonella as a Model Organism to Study Legionella pneumophila Infection

Use of Galleria mellonella as a Model Organism to Study Legionella pneumophila Infection

Användning av<em&gt; Galleria mellon</em&gt; Som modellorganism för att studera<em&gt; Legionella pneumophila</em&gt; Infektion

Legionella pneumophila, the causative agent of a severe pneumonia named Legionnaires&#39; disease, is an important human pathogen that infects and ...

Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes

Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes

Imaging INLC Sekre att undersöka Cellular Infektion av bakteriell patogen<em&gt; Listeria monocytogenes</em

Bacterial intracellular  pathogens can be conceived as molecular tools to dissect cellular signaling  cascades due to their capacity to exquisitely ...

Applying an Inducible Expression System to Study Interference of Bacterial Virulence Factors with Intracellular Signaling

Tillämpa ett inducerbart uttryck system att studera Störningar av bakteriell Virulensfaktorer med intracellulära signal

The technique presented here allows one to analyze at which step a target protein, or alternatively a small molecule, interacts with the components of a ...

Legionella pneumophila Outer Membrane Vesicles: Isolation and Analysis of Their Pro-inflammatory Potential on Macrophages

Legionella pneumophila Outer Membrane Vesicles: Isolation and Analysis of Their Pro-inflammatory Potential on Macrophages

Legionella pneumophila yttre membranvesiklar: Isolering och analys av deras pro-inflammatoriska Potential på makrofager

Bacteria are able to secrete a variety of molecules via various secretory systems. Besides the secretion of molecules into the extracellular space or ...

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

En roman Feeder-fria System för massproduktion av murina naturliga mördarceller In Vitro

Natural killer (NK) cells belong to the innate immune system and are a first-line anti-cancer immune defense; however, they are suppressed in the tumor ...

Isolation, Fixation, and Immunofluorescence Imaging of Mouse Adrenal Glands

Isolering, fixering och immunofluorescens avbildning av mus binjurarna

Immunofluorescence is a well-established technique for detection of antigens in tissues with the employment of fluorochrome-conjugated antibodies and has ...