Name: applying live cell imaging and cryo-electron tomography to resolve spatiotemporal features of the legionella pneumophila dot/icm secretion system
Uploaded: 2020-03-10T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Applying Live Cell Imaging and Cryo-Electron Tomography to Resolve Spatiotemporal Features of the Legionella pneumophila Dot/Icm Secretion System at JoVE.com

D.C. ve C.R.R. NIH (R37AI041699 ve R21AI130671) tarafından desteklendi. D.P., B.H., ve J.L Ulusal Sağlık Enstitüleri (R01AI087946 ve R01GM107629) tarafından desteklendi.

NOT: L. pnömofilinin büyümesi, manipülasyonu ve görüntülemesini içeren tüm prosedürler, yerel kurallara uygun olarak biyolojik güvenlik düzeyi 2 laboratuvarında yapılmalıdır.
1. Allelik Değişim ve Çift Seçim Stratejisi Kullanarak L. pnömofili Kromozomuna sfGFP takılması (Şekil 2, Şekil 3)
<ol><li>Gen replasman vektörpSR47S11 içine Klon aşağıdaki sıra: ilgi site...

<ol>
	<li>Franco, I. S., Shuman, H. A., Charpentier, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+perplexing+functions+and+surprising+origins+of+Legionella+pneumophila+type+IV+secretion+effectors.">The perplexing functions and surprising origins of Legionella pneumophila type IV secretion effectors.</a> Cellular Microbiology. 11, 1435-1443 (2009).</li><li>Burstein, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-scale+identification+of+Legionella+pneumophila+effectors+using+a+machine+learning+approach.">Genome-scale identification of Legionella pneumophila effectors using a machine learning approach.</a> PLOS Pathogens. 5, 1000508 (2009).</li><li>Ninio, S., Roy, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effector+proteins+translocated+by+Legionella+pneumophila:+strength+in+numbers.">Effector proteins translocated by Legionella pneumophila: strength in numbers.</a> Trends in Microbiology. 15, 372-380 (2007).</li><li>Vogel, J. P., Andrews, H. L., Wong, S. K., Isberg, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conjugative+transfer+by+the+virulence+system+of+Legionella+pneumophila.">Conjugative transfer by the virulence system of Legionella pneumophila.</a> Science. 279, 873-876 (1998).</li><li>Isberg, R. R., O'Connor, T. J., Heidtman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Legionella+pneumophila+replication+vacuole:+making+a+cosy+niche+inside+host+cells.">The Legionella pneumophila replication vacuole: making a cosy niche inside host cells.</a> Nature Reviews Microbiology. 7, 13-24 (2009).</li><li>Roy, C. R., Berger, K. H., Isberg, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Legionella+pneumophila+DotA+protein+is+required+for+early+phagosome+trafficking+decisions+that+occur+within+min+of+bacterial+uptake.">Legionella pneumophila DotA protein is required for early phagosome trafficking decisions that occur within min of bacterial uptake.</a> Molecular Microbiology. 28, 663-674 (1998).</li><li>Archer, K. A., Roy, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MyD88-Dependent+Responses+Involving+Toll-Like+Receptor+2+Are+Important+for+Protection+and+Clearance+of+Legionella+pneumophila+in+a+Mouse+Model+of+Legionnaires'+Disease.">MyD88-Dependent Responses Involving Toll-Like Receptor 2 Are Important for Protection and Clearance of Legionella pneumophila in a Mouse Model of Legionnaires' Disease.</a> Infection and Immunity. 74, 3325-3333 (2006).</li><li>Nagai, H., Kubori, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+IVB+Secretion+Systems+of+Legionella+and+Other+Gram-Negative+Bacteria.">Type IVB Secretion Systems of Legionella and Other Gram-Negative Bacteria.</a> Frontiers in Microbiology. 2, 136 (2011).</li><li>Kubori, T., Nagai, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Type+IVB+secretion+system:+an+enigmatic+chimera.">The Type IVB secretion system: an enigmatic chimera.</a> Current Opinion in Microbiology. 29, 22-29 (2016).</li><li>Chetrit, D., Hu, B., Christie, P. J., Roy, C. R., Liu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+unique+cytoplasmic+ATPase+complex+defines+the+Legionella+pneumophila+type+IV+secretion+channel.">A unique cytoplasmic ATPase complex defines the Legionella pneumophila type IV secretion channel.</a> Nature Microbiology. 3, 678-686 (2018).</li><li>Merriam, J. J., Mathur, R., Maxfield-Boumil, R., Isberg, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+Legionella+pneumophila+fliI+gene:+intracellular+growth+of+a+defined+mutant+defective+for+flagellum+biosynthesis.">Analysis of the Legionella pneumophila fliI gene: intracellular growth of a defined mutant defective for flagellum biosynthesis.</a> Infection and Immunity. 65, 2497-2501 (1997).</li><li>Feeley, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Charcoal-yeast+extract+agar:+primary+isolation+medium+for+Legionella+pneumophila.">Charcoal-yeast extract agar: primary isolation medium for Legionella pneumophila.</a> Journal of Clinical Microbiology. 10, 437-441 (1979).</li><li>Andrews, H. L., Vogel, J. P., Isberg, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+linked+Legionella+pneumophila+genes+essential+for+intracellular+growth+and+evasion+of+the+endocytic+pathway.">Identification of linked Legionella pneumophila genes essential for intracellular growth and evasion of the endocytic pathway.</a> Infection and Immunity. 66, 950-958 (1998).</li><li>Morado, D. R., Hu, B., Liu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+Tomoauto:+A+Protocol+for+High-throughput+Automated+Cryo-electron+Tomography.">Using Tomoauto: A Protocol for High-throughput Automated Cryo-electron Tomography.</a> Journal of Visualized Experiments. (107), e53608 (2016).</li><li>Hu, B., Lara-Tejero, M., Kong, Q., Galan, J. E., Liu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Situ+Molecular+Architecture+of+the+Salmonella+Type+III+Secretion+Machine.">In Situ Molecular Architecture of the Salmonella Type III Secretion Machine.</a> Cell. 168, 1065-1074 (2017).</li><li>Mastronarde, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+electron+microscope+tomography+using+robust+prediction+of+specimen+movements.">Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements.</a> Journal of Structural Biology. 152, 36-51 (2005).</li><li>Zheng, S. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MotionCor2:+anisotropic+correction+of+beam-induced+motion+for+improved+cryo-electron+microscopy.">MotionCor2: anisotropic correction of beam-induced motion for improved cryo-electron microscopy.</a> Nature Methods. 14, 331-332 (2017).</li><li>Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computer+visualization+of+three-dimensional+image+data+using+IMOD.">Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD.</a> Journal of Structural Biology. 116, 71-76 (1996).</li><li>Gilbert, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Iterative+methods+for+the+three-dimensional+reconstruction+of+an+object+from+projections.">Iterative methods for the three-dimensional reconstruction of an object from projections.</a> Journal of Theoretical Biology. 36, 105-117 (1972).</li><li>Radermacher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Weighted+Back-projection+Methods.">Weighted Back-projection Methods.</a> Electron Tomography. , 245-273 (2007).</li><li>Winkler, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tomographic+subvolume+alignment+and+subvolume+classification+applied+to+myosin+V+and+SIV+envelope+spikes.">Tomographic subvolume alignment and subvolume classification applied to myosin V and SIV envelope spikes.</a> Journal of Structural Biology. 165, 64-77 (2009).</li><li>Winkler, H., Taylor, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+marker-free+alignment+with+simultaneous+geometry+determination+and+reconstruction+of+tilt+series+in+electron+tomography.">Accurate marker-free alignment with simultaneous geometry determination and reconstruction of tilt series in electron tomography.</a> Ultramicroscopy. 106, 240-254 (2006).</li><li>Prevost, M. S., Waksman, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-ray+crystal+structures+of+the+type+IVb+secretion+system+DotB+ATPases.">X-ray crystal structures of the type IVb secretion system DotB ATPases.</a> Protein Science. 27, 1464-1475 (2018).</li><li>Miklos, G. L., Rubin, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+the+genome+project+in+determining+gene+function:+insights+from+model+organisms.">The role of the genome project in determining gene function: insights from model organisms.</a> Cell. 86, 521-529 (1996).</li><li>Reyrat, J. M., Pelicic, V., Gicquel, B., Rappuoli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Counterselectable+markers:+untapped+tools+for+bacterial+genetics+and+pathogenesis.">Counterselectable markers: untapped tools for bacterial genetics and pathogenesis.</a> Infection and Immunity. 66, 4011-4017 (1998).</li><li>Yu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Molecule+Studies+in+Live+Cells.">Single-Molecule Studies in Live Cells.</a> Annual Review of Physical Chemistry. 67, 565-585 (2016).</li><li>Stewart, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-electron+microscopy+and+cryo-electron+tomography+of+nanoparticles.">Cryo-electron microscopy and cryo-electron tomography of nanoparticles.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: Nanomedicine and Nanobiotechnology. 9, (2017).</li></ol>

Bakteriyel salgı sistemlerinin işlevlerinin aydınlatılması, konak-patojen etkileşimlerinin tam olarak anlaşılmasının anahtarıdır. Salgı sistemleri, etki edici proteinleri konak hücrelerine enjekte edebilen karmaşık makinelerdir ve bazı durumlarda bakteri çoğaltMaişlemini destekleyen bir hücre altı nişin kurulmasını teşvik eder. Yukarıdaki yöntem, solunum bakteriyel patojen lejyonella pnömofili Nin Dot/Icm salgı sistemini incelemek için önemli yeni araçlar sağlayarak patojeniliğ...

Legionella pnömofili (L. pnömofili),Lejyoner hastalığının etiyolojik maddesi, bakterinin suda serbest yüzme protozoası içinde enfekte ve çoğalarak yayıldığı tatlı su rezervuarlarında yaşar. L. pnömofili içme suyu kaynaklarından aerosolize bakterilerin teneffüs meydana geldiğinde insanlarda hastalık salgınları neden olur. Enfekte hücrelerde, konak yollarının bozulması L. pnömofili içinde bulunduğu vakuol endositik olgunlaşma geciktirmek ve bakteriyel replikasyon destekleyen bir hücresel kompartman biyogenezi teşvik sağlar. Bu süreç, nokta/Icm olarak bilinen özel bir bakteri tipi IVB salgı sistemi (T4BSS) ve hücresel fonksiyonların manipülasyonunu kolaylaştırmak için enfeksiyon sırasında konak sitosola aktarılan 300'den fazla "efektör" proteininrepertörü tarafından yönlendirilir1,2,3, 4,4,5. Fonksiyonel bir Nokta / Icm aparatyoksun Mutantlar konak sitosol içine efektörler imal etmek için başarısız, hücre içi çoğaltma için kusurlu, ve hastalığın hayvan modellerinde avirulent vardır6,7.
Birçok bakteri türü enfeksiyon süreçleri için gerekli olan son derece karmaşık ve dinamik çok bileşenli makineler geliştirmiştir. Dot / Icm sistemi gibi diğer T4BSS de Coxiella burnetii ve Rickettsiella grylligibi bakteriyel patojenlerin hücre içi replikasyonu için gereklidir. T4BSS evrimsel olarak DNA transferine aracılık eden ve efektör proteinlerin sınırlı bir repertoiresini sunabilen prototip tip IVA sistemleriyle ilişkili olmasına rağmen, Dot/Icm sistemi neredeyse iki kat daha fazla makine bileşenine sahiptir ve çok çeşitli efektörler sunar. Muhtemelen, bileşen sayısındaki bu genişleme Dot/Icm aparatının yeni efektörleri kolayca barındırmasını ve entegre etmesini sağlamıştır8,9.
Son zamanlarda dot/Icm cihazının yapısını yerinde çözmek için kriyo-elektron tomografisi (kriyo-ET) kullandık ve sitoplazmik komplekse bağlanan bir hücre zarfı yayılan kanal olduğunu gösterdik. Daha ileri analizler, sitosolik ATPAz DotB'nin Sitosolik ATPAz DotO ile etkileşimyoluyla L. pnömofili hücre kutbundaki Dot/Icm sistemiyle ilişkilendirdiğini ortaya koymuştur. DotB'nin çoğu bakteri hücrelerinde sitosolik bir hareket gösterdiğini keşfettik, bu ATPaz'ın dinamik bir sitosolik popülasyonda bulunduğunu ve aynı zamanda kutup nokta/Icm kompleksleriyle de ilişkilendirdiğini gösteriyor. Buna ek olarak, DotO iç membran kompleksi ile ilişkili DotO dimers bir hexameric montaj oluşturur ve bir DotB hexamer bu sitoplazmik kompleksin tabanına katılır. DotB-DotO enerji kompleksinin montajı, substratların translokasyonlarını T4SS (Şekil 1)10üzerinden yönlendiren bir sitoplazmik kanal oluşturur.
Bu son gelişmelere rağmen, Nokta/Icm sisteminin nasıl işlediği ve her proteinin aktif bircihazoluşturmak için nasıl bir araya gelerek 8. Dot/Icm T4SS'nin düzenleyici devrelerinin ortaya çıkarılması, konak-patojen etkileşimlerinin moleküler mekanizmalarını anlamak için çok önemlidir. Bu nedenle, süper klasör GFP (sfGFP) ile etiketlenmiş temel L. pnömofili Dot/Icm sistem bileşenlerini tespit etmek ve karakterize etmek için canlı hücre mikroskobu ve kriyo-ET'nin nasıl kullanılacağını tartışıyoruz. Kantitatif floresan mikroskopisi kullanılarak, DotB'nin polar lokalizasyonu vahşi tip bir arka planda veya tip IV sistemi silindiğinde tanımlanır. Nokta/Icm sitosolik ATPaslar arasındaki lokalizasyon ve dinamik farklılıkları ölçmek için hızlandırılmış mikroskopi kullanılacaktır.
Canlı görüntüleme ve kriyo-ET gibi iki tamamlayıcı yaklaşımın birleştirilmiş uygulaması, diğer in vitro sistemlere göre avantaj sağlamaktadır. Her iki yöntem de bozulmamış hücrelerde gerçekleştirilir ve T4BSS'nin doğal ortamıkorunur, böylece numune hazırlama sırasında yerel yapının bozulması en aza indirilir. Proteinlerin aşırı ekspresyonu salgı cihazının stoiyometrisini bozabileceğinden, sfGFP füzyonları allelik değişim yoluyla Lejyonella kromozomuna döndürülür, böylece her füzyon tek bir kopyada kodlanır ve ifade endojen organizatör tarafından yönlendirilir. Kromozomla kodlanmış füzyonların görselleştirilmesi, tanımlanan bir zaman noktasında ifade edilen proteinin tam seviyesinin sayısallaştırılmasını sağlar. Cryo-ET de salgı sistemlerinin yapısını belirlemek için birçok avantajı vardır. En önemli avantajı kriyo-ET örnekleri bakteri hücre mimarisi bağlamında yerli kompleksleri korumak dondurulmuş bozulmamış hücrelerden oluşur olmasıdır. Sonuç olarak, kriyo-ET membran komplekslerini ayıklayan ve çekirdek aygıtından periferik proteinleri sıyırabilecek veya genel yapıyı değiştirebilen biyokimyasal arıtma yaklaşımlarına tercih edilebilir. Buna ek olarak, sfGFP gibi hantal bir protein ile ilgi bir protein etiketleme kriyo-ET tarafından tespit edilebilir bir kitle ekler ve kriyo-ET tarafından elde edilen yapı üzerine Dot / Icm aparatlarının farklı alt kompleksleri haritalama ile yardımcı olabilir.
Bu yaklaşım, bakteri hücre zarında biraraya gelen çok moleküler kompleksler hakkında yapısal bilgileri ortaya çıkarmak için güçlü bir araçtır. Bu teknikler kullanılarak açıklığa kavuşturulacak yapıların yorumlanması, alanın T4BSS bileşenlerinin nasıl çalıştığını, işlev için neden bu kadar çok bileşenin gerekli olduğunu, bileşenlerin büyük kompleks içinde nasıl etkileşime gireceğini ve bu işlevleri anlamalarına yardımcı olacaktır. alt montajlar gerçekleştirir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 nm colloidal gold particles</td>
			<td>Aurion</td>
			<td>25486</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100x Plan Apo objective (1.4 NA)</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Activated charcoal</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C5510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agaroze GPG/LMP, low melt</td>
			<td>American bioanalytical</td>
			<td>AB00981</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto dehydrated agar</td>
			<td>BD</td>
			<td>214010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoolSNAP EZ 20 MHz digital monochrome camera</td>
			<td>Photometrics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gene Frame, 1.7x2.8 cm, 125 &#181;L</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AB-0578</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Holey Carbon grid R 2/1 Cu 200 mesh</td>
			<td>Quantifoil</td>
			<td>Q225-CR1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iron(III) nitrate nonahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>216828</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2 Summit camera for cryo-EM</td>
			<td>GATAN</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Cysteine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C7352</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope cover slides 22x22 mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-542B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope cover slides 24x50 mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-545K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides 25x75x1 mm</td>
			<td>Globe Scientific</td>
			<td>1380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SlideBook 6.0</td>
			<td>Intelligent Imaging Innovations</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectra X light engine</td>
			<td>Lumencor</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq 2X Master Mix</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>M0270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Titan Krios</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract</td>
			<td>BD</td>
			<td>212750</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

applying live cell imaging and cryo-electron tomography to resolve spatiotemporal features of the legionella pneumophila dot/icm secretion system

Legionella pnömofilinin Nokta/Icm salgı sistemi, bakteri direğinde lokalize olan ve protein ve DNA substratlarının hedef hücrelere teslimine aracılık eden karmaşık bir tip IV salgı sistemidir (T4SS) nanomachine, genellikle doğrudan hücreden hücreye temas gerektiren bir süreçtir. Son zamanlarda kriyo-elektron tomografisi (kriyo-ET) ile Dot/Icm cihazının yapısını çözdük ve sitoplazmik komplekse bağlanan bir hücre zarfı yayılan kanal olduğunu gösterdik. Canlı hücrelerde ve kriyo-ET'de floresan mikroskopi, numunenin doğal yapısını koruyan iki tamamlayıcı yaklaşım uygulayarak, proteinlerin yerinde görüntülenmesine ve her makine bileşeninin diğer Dot/Icm alt birimlerine göre stokiyometrisinin asimilasyonunu ve zamanlamasını sağlar. Polar konumlandırma nın gereklerini araştırmak ve T4SS makine biyogenezi ile ilişkili dinamik özellikleri karakterize etmek için, kromozom üzerindeki doğal konumlarında Dot/Icm ATPaz genlerine süper klasör yeşil floresan proteinini kodlayan bir gen geliştirdik. Aşağıdaki yöntem, polar lokalizasyonu, dinamiği ve bu proteinlerin yapısını sağlam bakteri hücrelerinde ölçmek için canlı hücrelerin nicel floresan mikroskobu ve kriyo-ET'yi entegre eder. Legionella pnömofili T4SS'yi incelemek için bu yaklaşımların uygulanması Dot/Icm sisteminin işlevini karakterize etmek için yararlıdır ve T4SS'i veya diğer bakteriyel salgı komplekslerini kullanan çok çeşitli bakteriyel patojenleri incelemek üzere uyarlanabilir.

SfGFP'nin tanımlanan eklemesini oluşturmak için iki adımda çift seçimli homolog rekombinasyon kullanılmıştır. İlk adımda, triparental çiftleşmesi yapıldı, burada PRK600 konjugatif plazmid (bir IncP plazmid) E. coli yardımcı suşu MT616 gelen donör E. coli suşu intihar vektörü pSR47S iki homolog bölgeler, transfer oriT ve Bacillills subselectionsubselection subt istifi ile çevrili içeren sfGFP geni ile seferber edildi . Daha sonra pSR47S türevinin pRK600 destek...

Watch this Scientific Journal Video about Applying Live Cell Imaging and Cryo-Electron Tomography to Resolve Spatiotemporal Features of the Legionella pneumophila Dot/Icm Secretion System at JoVE.com

Applying Live Cell Imaging and Cryo-Electron Tomography to Resolve Spatiotemporal Features of the Legionella pneumophila Dot/Icm Secretion System

Bakteri hücrelerinin görüntülenmesi, büyük makromoleküler makinelerin işlevini belirleyen statik ve dinamik süreçleri tanımlamaya odaklanmış yeni ortaya çıkan bir sistem biyolojisi yaklaşımıdır. Burada Lejyonella pnömophila tip IV salgı sistemi mimarisi ve fonksiyonlarını incelemek için kantitatif canlı hücre görüntüleme ve kriyo-elektron tomografisi entegrasyonu kullanılmaktadır.

Legionella pnömophila Dot/Icm Salgı Sisteminin Spatiotemporal Özelliklerini Çözmek İçin Canlı Hücre Görüntüleme ve Kriyo-Elektron Tomografisi Uygulama

The Dot/Icm secretion system of Legionella pneumophila is a complex type IV secretion system (T4SS) nanomachine that localizes at the bacterial pole and ...

Bu protokol, bakteriyel salgı komplekslerinin montaj fonksiyonlarını karakterize etmek için yararlıdır ve konak patojen etkileşimleri için gerekli olan moleküler mekanizmaların temel bir şekilde anlaşılmasına yol açabilir. Bu teknik, numunenin doğal yapısını koruyan tamamlayıcı yaklaşımları entegre eder ve bozulmamış bakteri hücrelerindeki protein komplekslerinin görselleştirilmesine izin verir ve görselleştirmeyi sağlar. Bakteriyel salgı sistemlerinin yapısal fonksiyon ilişkilerini anlamamızı arttırır.Bu yöntem, bakteri türlerinin geniş bir yelpazede salgı sistemleri veya diğer hücresel kompleksleri diğer türleri incelemek için uyarlanabilir. Canlı hücre görüntüleme için agarose pedleri yaparak başlayın. Yaklaşık 30 mL% 1 düşük suda eriyen agarose çözeltisi hazırlayın ve agarose tamamen çözülene kadar zaman zaman girdap yaklaşık 90 saniye boyunca bir cam şişesinde mikrodalga.25 x 75 x 1.1mm cam kaydırağı nın bir tanesi diğerinin üzerine 25 x 75'in kenarına 22 x 22 x 22 kaydırak yerleştirin. Daha sonra, diğer kenarına küçük slaytlardan iki tane daha yığ. Pipet yaklaşık 1 mL erimiş agarose iki üst cam slayt lar arasında merkezi slayt içine ve erimiş agarose üstüne başka bir büyük slayt yerleştirin hava kabarcıkları oluşumunu önlemek için emin olun.15 dakika boyunca dört derece santigrat slaytlar serin sonra yavaşça küçük kareler halinde ped kesmek için bir neşter veya jilet kullanın. 25 x 75 x 1,1 mm'lik cam kaydıraktan çift taraflı yapışkan çerçeveyi düzeltin ve slayta birkaç ped yerleştirin. Legionella Pneumophila ağır bir yama çözmek 1 mL çift distile su.Sonra girdap ve pipet 2-3 mikrolitre seyreltme pedleri üzerine. Yapışkan çerçevenin üzerine 58 x 24 x 0,15 mm kapak yerleştirin. Parlak alan ışığını kullanarak görüntüleme için hücreleri seçin.Daha sonra, mikroskobun yazılımının yakalama penceresinde ND'yi 180'e, binning'i ikiye ikişer ayarlayın. 488 nanometre kanalını kullanarak numuneyi 500 ila 1000 milisaniye arasında teşrelemeyi yapın ve aynı parametrelere sahip etiketsiz Legionella Pneumophila'yı görüntüleyerek floresan özgüllüğünü doğrulayın. Polariteyi ölçmek için, görüntü kontrastını bakterilerin açıkça görülebilmesi için ayarlayın.Daha sonra ilgi alanını yakınlaştırın ve kutuptan başlayıp sitoplazmaya doğru uzanan 0.25'e 1.3 mikrometrelik bir dikdörtgen yerleştirmek için bölge aracını kullanın ve dikdörtgenin bakteri sınırları içinde kalmasını sağlar. Analiz menüsündeki maske düğmesini kullanmak için bölgeyi kullanarak en az 200 bakteri işaretleyin ve maske oluşturun. Maske istatistiklerini tıklatın ve maske kapsamı altında nesne seçin.Sonra özellikleri ve yoğunluğu altında yoğunluk ve varyans ortalama işareti. Verileri metin dosyası olarak dışa aktarın ve varyans ve ortalama yoğunluk arasındaki oran olarak her bakterinin polarite puanlarını hesaplamak için elektronik tablo uygulamasını kullanın. Yüksek iş elde uygulamaları için çift kanallı görüntüler elde etmek için yüz kontrastlı mikroskobu kullanın.Bakterilerin tamamen ayrıldığı görüş alanlarını seçtiğinizden emin olun. Ardından, görüntünün yüz kanalı kontrastını bakterilerin açıkça görülebileceği bir seviyeye ayarlayın. Çift kanallı görüntüyü açın ve segment maskesi penceresi oluşturun.Uygun eşiği ayarlayın, ardından nesneleri tanımla düğmesini tıklatarak ve en küçük boyutu 100 piksele ayarlayarak küçük nesneleri kaldırın. Hassas maskenin altında, kenarları kaldır nesnelerini ve birbirine bitişik bakterilerin ayrı maskelerini seçin. Füzyon proteinlerinin dinamiklerini ölçmek için görüntü yakalama penceresini açın ve zaman atlamasını işaretleyin.Zaman puanı kutusuna iki tane girin. İlgi çekici protein ifade Legionella Pneumophila iki başarılı görüntüleri edinin. Hücreler açıkça görünene kadar görüntü kontrastını ayarlayın.Daha sonra en az 400 hücrenin ortasına 0,25 ile 0,25 mikrometre kare yerleştirmek için bölge aracını kullanın. Ardından, ilgi karelerinin maskesini oluşturmak için çözümleme menüsündeki maske düğmesini kullanmak için bölgeyi kullanın. Yeni bir boş maske oluşturun ve en az 25 rasgele hücrenin tüm hücre alanını işaretlemek için piksel aracını kullanın.Başka bir maske oluşturun ve hücreler arasındaki alanları işaretlemek için büyük fırça aracını kullanın. Son olarak, maske istatistiklerini seçin ve maske nin maske kapsamı altında nesnenin seçildiğinden emin olun. Özellikleri ve yoğunluğu altında, ortalama yoğunluğu seçin.Verileri dışa aktarın ve maske 2 için işlemi tekrarlayın. Maske 3 için maskenin tamamını seçin ve ortalama yoğunluğu dışa aktarın. Elektron kriyotomografi örneğini hazırlamak için CYE Agrastreptomisum plakalarında 37 santigrat derecede 48 saat boyunca ağır bir Legionella Pneumophila parçası yetiştirin.Sudaki hücreleri 0,7'nin od 600'üne geri alın. Sonra hücre süspansiyon 20 mikrolitre kolloidal altın parçacıkları beş mikrolitre ekleyin. Glow üzerinde hücre karışımı bir delikli karbon ızgara ve pipet beş mikrolitre deşarj.Bir dakika bekletin. Izgarayı filtre kağıdıyla blotlayın ve yerçekimine dayalı bir piston cihazı kullanarak sıvı etan içinde dondurun. Legionella Pnömofili kromozomuna süper klasör GFP takıldıktan sonra floresan sinyali ebeveyn süper klasörü GFP negatif zorlanma ile karşılaştırmak için canlı hücre floresan mikroskobu yapıldı.Buna ek olarak, parlak alan mikroskobu belirli bir floresan sinyali olan hücrelerin oranını incelemek için kullanılmıştır. DotB süper klasörGFP üretilen hücrelerin sadece bir kısmı füzyon proteinpolar lokalizasyon gösterdi. DotB floresan sinyalinin dağılımını karakterize ederken, kutuplarda DotB süper klasör GFP yoğunluğu sitosol yaklaşık iki kat daha yüksek olduğu bulundu.DotB süper klasör GFP polar lokalizasyonunun tam olarak monte edilmiş tip dört salgı sistemine bağlı olup olmadığını araştırmak için, dotb süper klasör GFP polarite puanları vahşi tipteki hücreler için ve tip dört salgı sistemi mutantı için belirlendi. Nitekim, DotB süper klasör GFP polar konumlandırma Dot / ICM sistemi silindiğinde kayboldu. Dinamik desenler DotB ATPase dinamik bir sitosolik popülasyonda mevcut olduğunu ve geç evre montaj reaksiyonu kutup lokalize Dot / ICM tip dört salgı sistemine işe olduğunu gösterdi.Yüksek iş yapma kriyo-ET, DotB süper klasörgingini ifade eden Legionella Pneumophila suşundaki bozulmamış tip dört salgı sistemi aygıtını görselleştirmek için kullanıldı. Hücrenin yeniden yapılandırılmasında hücre zarfına gömülü birden fazla Nokta/ICM makinesi saptandı. Nokta Btipi ve süper klasör GFP'nin bozulmamış tip dört salgı sistemi makinesine göre genel konumlandırması da belirlendi.Üç boyutlu yüzey işlemeleri, süper klasör GFP'nin Sitoplazmik ATPase kompleksinin tabanında bir disk olarak biraraya gelen DotB hexamer'ın altına yerleştirildiğini göstermiştir. Bu tekniği denerken, görüntü edinimi devam etmeden önce füzyon proteinleri ve etiket sekresyon sisteminin işlevselliğini değerlendirmek için emin olun. Modelleme ve montaj, dinamik örüntüleri ve yapısal yoğunlukları analiz etmenin yanı sıra konformasyonel değişikliklerin değerlendirilmesi veya alt birimlerin yapıya yerelleştirilmesi için etkili yollar olabilir.Bu yaklaşım, farklı tip dört gizli sistem bileşenlerinin nasıl çalıştığını, büyük karmaşık alanda nasıl etkileşimde bulunduklarını ve farklı alt derlemelerin hangi işlevleri gerçekleştirdiğini anlamada yardımcı olabilir.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Applying Live Cell Imaging and Cryo-Electron Tomography to Resolve Spatiotemporal Features of the Legionella pneumophila Dot/Icm Secretion System

Determination of Molecular Structures of HIV Envelope Glycoproteins using Cryo-Electron Tomography and Automated Sub-tomogram Averaging

Cryo-Elektron Tomografi ve Otomatik Sub-tomogram Ortalaması kullanarak HIV Zarf Glikoproteinler Moleküler Yapılarının Belirlenmesi

Since its discovery nearly 30 years ago, more than 60 million people have been infected with the human immunodeficiency virus (HIV) (www.usaid.gov). The ...

Use of an Optical Trap for Study of Host-Pathogen Interactions for Dynamic Live Cell Imaging

Dinamik Canlı Hücre Görüntüleme Konukçu-Patojen Etkileşimleri Çalışma Optik Tuzak

Dynamic live cell imaging allows direct visualization of real-time interactions between cells of the immune system1, 2; however, the lack of spatial and ...

Real-time Live Imaging of T-cell Signaling Complex Formation

T hücre gerçek zamanlı Canlı Görüntüleme Kompleks Oluşum Sinyal

Protection against infectious diseases is mediated by the immune system 1,2. T lymphocytes are the master coordinators of the immune system, regulating ...

Live Cell Imaging of Alphaherpes Virus Anterograde Transport and Spread

Alphaherpes Virüs İleriye Taşıma ve Değişken Canlı Hücre Görüntüleme

Advances in live cell fluorescence microscopy  techniques, as well as the construction of recombinant viral strains that  express fluorescent fusion ...

Use of Galleria mellonella as a Model Organism to Study Legionella pneumophila Infection

Use of Galleria mellonella as a Model Organism to Study Legionella pneumophila Infection

Kullanımı<em&gt; Galleria mellonella</em&gt; Bir Model Organizma olarak Eğitim için<em&gt; Legionella pneumophila</em&gt; Enfeksiyon

Legionella pneumophila, the causative agent of a severe pneumonia named Legionnaires&#39; disease, is an important human pathogen that infects and ...

Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes

Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes

Bakteriyel Patojen Hücresel Enfeksiyon Soruşturma inlc salgılanmasına Görüntüleme<em&gt; Listeria monocytogenes</em

Bacterial intracellular  pathogens can be conceived as molecular tools to dissect cellular signaling  cascades due to their capacity to exquisitely ...

Applying an Inducible Expression System to Study Interference of Bacterial Virulence Factors with Intracellular Signaling

Bir uyarılabilir İfade Sistemi uygulamak Hücre içi Sinyali ile Bakteriyel Virulans Faktörler Girişim Eğitim için

The technique presented here allows one to analyze at which step a target protein, or alternatively a small molecule, interacts with the components of a ...

Legionella pneumophila Outer Membrane Vesicles: Isolation and Analysis of Their Pro-inflammatory Potential on Macrophages

Legionella pneumophila Outer Membrane Vesicles: Isolation and Analysis of Their Pro-inflammatory Potential on Macrophages

Legionella pneumophila Dış Zar veziküller: İzolasyon ve Makrofajlar Onların Pro-inflamatuar Potansiyeli Analizi

Bacteria are able to secrete a variety of molecules via various secretory systems. Besides the secretion of molecules into the extracellular space or ...

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

Roman besleyici-Alerjik sistemi fare doğal katil hücreler Vitro seri üretim için

Natural killer (NK) cells belong to the innate immune system and are a first-line anti-cancer immune defense; however, they are suppressed in the tumor ...

Isolation, Fixation, and Immunofluorescence Imaging of Mouse Adrenal Glands

Yalıtım, fiksasyon ve fare böbreküstü bezlerinin ayirt görüntüleme

Immunofluorescence is a well-established technique for detection of antigens in tissues with the employment of fluorochrome-conjugated antibodies and has ...