Name: screening and identification of rna silencing suppressors from secreted effectors of plant pathogens
Uploaded: 2020-02-03T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Screening and Identification of RNA Silencing Suppressors from Secreted Effectors of Plant Pathogens at JoVE.com

تم دعم هذا العمل من خلال منح من "برنامج شوقوانغ" لمؤسسة تطوير التعليم في شنغهاي ولجنة التعليم لبلدية شنغهاي، والبرنامج الوطني الرئيسي للبحث والتطوير في الصين البرنامج الوطني الرئيسي للبحث والتطوير في الصين ( 2018YFD0201500)، والمؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (رقم 31571696 و 31660510)، وبرنامج الألف مواهب للمهنيين الشباب في الصين، ولجنة العلوم والتكنولوجيا في بلدية شنغهاي (18DZ2260500).

ملاحظة: يجب إجراء جميع خطوات الإجراء في درجة حرارة الغرفة (RT).
تنبيه: إيداع جميع الوسائط التي تحتوي على الميكروبات المسببة للأمراض، وكذلك النباتات والأنسجة النباتية المستخدمة في العينات، في حاويات النفايات المناسبة والأوتوكلاف قبل التخلص منها.
1. إعداد بلازمي...

<ol>
	<li>Waterfield, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Virulence+Annotation+(RVA):+identification+of+virulence+factors+using+a+bacterial+genome+library+and+multiple+invertebrate+hosts.">Rapid Virulence Annotation (RVA): identification of virulence factors using a bacterial genome library and multiple invertebrate hosts.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (41), 15967-15972 (2008).</li><li>Rovenich, H., Boshoven, J. C., Thomma, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Filamentous+pathogen+effector+functions:+of+pathogens,+hosts+and+microbiomes.">Filamentous pathogen effector functions: of pathogens, hosts and microbiomes.</a> Current Opinion in Plant Biology. 20, 96-103 (2014).</li><li>Varden, F. A., De la Concepcion, J. C., Maidment, J. H., Banfield, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Taking+the+stage:+effectors+in+the+spotlight.">Taking the stage: effectors in the spotlight.</a> Current Opinion in Plant Biology. 38, 25-33 (2017).</li><li>Lee, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+Pseudomonas+syringae+Type+III+Secreted+Effector+Function+via+a+Yeast+Genomic+Screen.">Identifying Pseudomonas syringae Type III Secreted Effector Function via a Yeast Genomic Screen.</a> G3: Genes, Genomes, Genetics. 9 (2), 535-547 (2019).</li><li>Toruno, T. Y., Stergiopoulos, I., Coaker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant-Pathogen+Effectors:+Cellular+Probes+Interfering+with+Plant+Defenses+in+Spatial+and+Temporal+Manners.">Plant-Pathogen Effectors: Cellular Probes Interfering with Plant Defenses in Spatial and Temporal Manners.</a> Annual Review of Phytopathology. 54, 419-441 (2016).</li><li>Baulcombe, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+silencing+in+plants.">RNA silencing in plants.</a> Nature. 431 (7006), 356-363 (2004).</li><li>Pumplin, N., Voinnet, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+silencing+suppression+by+plant+pathogens:+defence,+counter-defence+and+counter-counter-defence.">RNA silencing suppression by plant pathogens: defence, counter-defence and counter-counter-defence.</a> Nature Reviews Microbiology. 11 (11), 745-760 (2013).</li><li>Csorba, T., Kontra, L., Burgyan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+silencing+suppressors:+Tools+forged+to+fine-tune+host-pathogen+coexistence.">Viral silencing suppressors: Tools forged to fine-tune host-pathogen coexistence.</a> Virology. 479-480, 85-103 (2015).</li><li>Johansen, L. K., Carrington, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silencing+on+the+spot.+Induction+and+suppression+of+RNA+silencing+in+the+Agrobacterium-mediated+transient+expression+system.">Silencing on the spot. Induction and suppression of RNA silencing in the Agrobacterium-mediated transient expression system.</a> Plant Physiology. 126 (3), 930-938 (2001).</li><li>Powers, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+assay+for+the+identification+of+RNA+silencing+suppressors+based+on+complementation+of+viral+movement.">A versatile assay for the identification of RNA silencing suppressors based on complementation of viral movement.</a> Molecular Plant-Microbe Interactions. 21 (7), 879-890 (2008).</li><li>Voinnet, O., Lederer, C., Baulcombe, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+viral+movement+protein+prevents+spread+of+the+gene+silencing+signal+in+Nicotiana+benthamiana.">A viral movement protein prevents spread of the gene silencing signal in Nicotiana benthamiana.</a> Cell. 103 (1), 157-167 (2000).</li><li>Deleris, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hierarchical+action+and+inhibition+of+plant+Dicer-like+proteins+in+antiviral+defense.">Hierarchical action and inhibition of plant Dicer-like proteins in antiviral defense.</a> Science. 313 (5783), 68-71 (2006).</li><li>Li, W. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferon+antagonist+proteins+of+influenza+and+vaccinia+viruses+are+suppressors+of+RNA+silencing.">Interferon antagonist proteins of influenza and vaccinia viruses are suppressors of RNA silencing.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (5), 1350-1355 (2004).</li><li>Navarro, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+plant+miRNA+contributes+to+antibacterial+resistance+by+repressing+auxin+signaling.">A plant miRNA contributes to antibacterial resistance by repressing auxin signaling.</a> Science. 312 (5772), 436-439 (2006).</li><li>Qiao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oomycete+pathogens+encode+RNA+silencing+suppressors.">Oomycete pathogens encode RNA silencing suppressors.</a> Nature Genetics. 45 (3), 330-333 (2013).</li><li>Yin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+fungal+effector+from+Puccinia+graminis+suppressing+RNA+silencing+and+plant+defense+responses.">A novel fungal effector from Puccinia graminis suppressing RNA silencing and plant defense responses.</a> New Phytologist. 222 (3), 1561-1572 (2019).</li><li>Zhang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+WY+domain+in+the+Phytophthora+effector+PSR1+is+required+for+infection+and+RNA+silencing+suppression+activity.">The WY domain in the Phytophthora effector PSR1 is required for infection and RNA silencing suppression activity.</a> New Phytologist. 223 (2), 839-852 (2019).</li><li>Petersen, T. N., Brunak, S., von Heijne, G., Nielsen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SignalP+4.0:+discriminating+signal+peptides+from+transmembrane+regions.">SignalP 4.0: discriminating signal peptides from transmembrane regions.</a> Nature Methods. 8 (10), 785-786 (2011).</li><li>Earley, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gateway-compatible+vectors+for+plant+functional+genomics+and+proteomics.">Gateway-compatible vectors for plant functional genomics and proteomics.</a> Plant Journal. 45 (4), 616-629 (2006).</li><li>Woodman, M. E., Savage, C. R., Arnold, W. K., Stevenson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+PCR+of+Intact+Bacteria+(Colony+PCR).">Direct PCR of Intact Bacteria (Colony PCR).</a> Current Protocols in Microbiology. 42 (1), 1-7 (2016).</li><li>Cao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+an+RNA+silencing+suppressor+from+a+plant+double-stranded+RNA+virus.">Identification of an RNA silencing suppressor from a plant double-stranded RNA virus.</a> Journal of Virology. 79 (20), 13018-13027 (2005).</li><li>Burgyan, J., Havelda, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+suppressors+of+RNA+silencing.">Viral suppressors of RNA silencing.</a> Trends in Plant Science. 16 (5), 265-272 (2011).</li><li>Incarbone, M., Dunoyer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+silencing+and+its+suppression:+novel+insights+from+in+planta+analyses.">RNA silencing and its suppression: novel insights from in planta analyses.</a> Trends in Plant Science. 18 (7), 382-392 (2013).</li><li>Martinez-Priego, L., Donaire, L., Barajas, D., Llave, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silencing+suppressor+activity+of+the+Tobacco+rattle+virus-encoded+16-kDa+protein+and+interference+with+endogenous+small+RNA-guided+regulatory+pathways.">Silencing suppressor activity of the Tobacco rattle virus-encoded 16-kDa protein and interference with endogenous small RNA-guided regulatory pathways.</a> Virology. 376 (2), 346-356 (2008).</li></ol>

الجيش الملكي النيبالي إسكات هو آلية الدفاع الرئيسية المستخدمة من قبل النباتات لمكافحة الفيروسية والبكتيرية والأوميسيت، ومسببات الأمراض الفطرية. بدورها ، تطورت هذه الميكروبات إسكات البروتينات المكثفة لمواجهة إسكات المضادة للفيروسات ، وهذه RSSs تتداخل مع خطوات مختلفة من مسار إسكات الحمض ?...

على مدى العقدين الماضيين، أدى التسارع في تسلسل الجينوم من الكائنات الحية الدقيقة التي تسبب أمراض النباتات إلى فجوة معرفية متزايدة من أي وقت مضى بين المعلومات تسلسل والوظائف البيولوجية للبروتينات المشفرة1. ومن بين الجزيئات التي كشفت عنها مشاريع التسلسل جزيئات المؤثرات التي تقمع المناعة الفطرية وتيسر الاستعمار المضيف؛ تفرز هذه العوامل من قبل مسببات الأمراض النباتية المدمرة، بما في ذلك البكتيريا، والديدان الخيطية، والميكروبات الخيطية. وللاستجابة لهذه التهديدات، طورت النباتات المضيفة مستقبلات جديدة تتعرف على هذه المؤثرات، مما يتيح استعادة الاستجابة المناعية. وبالتالي ، تخضع المؤثرات لضغوط انتقائية مختلفة ، مما يؤدي إلى تنويع ذخيرة التأثير بين الأنساب المسببة للأمراض2. في السنوات الأخيرة ، ثبت أن المؤثرات المفترضة من مسببات الأمراض النباتية تعطل المناعة الفطرية النباتية عن طريق إعاقة العمليات الخلوية المضيفة لصالح الميكروبات بطرق متنوعة ، بما في ذلك خلل تنظيم مسارات الإشارات ، والنسخ ، والنقل داخل الخلايا ، واستقرار الهيكل الخلوي ، والاتجار بالحويز ، والحمض النووي الريبي إسكات3،4،5. ومع ذلك ، فإن الغالبية العظمى من مسببات الأمراض ، ولا سيما تلك من مسببات الأمراض الخيطية ، ظلت غامضة.
RNA إسكات هو جهاز تنشيط الجينات بوساطة homology التي يتم حفظها بين eukaryotes. يتم تشغيل هذه العملية من قبل الحمض النووي الريبي طويل تقطعت بهم السبل مزدوجة (dsRNA) ويستهدف الحمض النووي الريبي المتماثل واحد تقطعت بهم السبل (ssRNA) بطريقة تسلسل محددة، وأنه يتلاعب مجموعة واسعة من العمليات البيولوجية، بما في ذلك الدفاع المضادة للفيروسات6. للتغلب على الاستجابات المناعية الفطرية للمضيف ، تطورت بعض الفيروسات لتعويض إسكات الحمض النووي الريبي ، بما في ذلك القدرة على تكرار داخل المقصورات داخل الخلايا أو الهروب من الإشارة المعاد تنظيمها. ومع ذلك ، فإن الاستراتيجية الأكثر عمومية التي تحمي الفيروسات جينومها ضد فقدان الحمض النووي الريبي المعتمد على وظيفة الجينات هو ترميز بروتينات محددة تقمع RNA إسكات7،8. وقد أنشئت عدة نهج مختلفة ميكانيكيا لفحص وتوصيف المكثفات الفيروسية من إسكات الجيش الملكي النيبالي (VSRs)، بما في ذلك التسلل المشترك للثقافات كيتومالونز Agrobacterium، والنباتات المعدلة وراثيا التعبير عن القامع المفترضة، والتطعيم وثقافة الخلية9،10،11،12، 13.
كل من هذه المقالات المحددة لها مزايا وعيوب، وتحدد VSRs بالطريقة الخاصة بها. ويستند أحد النهج الأكثر شيوعا على التسلل المشترك للثقافات A. tmuefaciens الفردية التي تؤوي البروتين الفيروسي المحتمل والجينات مراسل (عادة البروتين الفلوري الأخضر [GFP]) على النباتات Nicotiana benthamiana 16c تشكل تشكيلGFP تحت سيطرة القرنبيط فسيفساء فيروس 35S المروج. في حالة عدم وجود مثبط إسكات فيروسي نشط ، يتم تحديد GFP على أنه خارجي من قبل الخلايا المضيفة ويتم إسكاته في غضون 3 أيام بعد التسلل (نقطة في البوصة). وعلى النقيض من ذلك، إذا كان البروتين الفيروسي يمتلك نشاط الكبت، فإن مستوى التعبير عن GFP يظل ثابتاً بعد 3−9 نقطة في البوصة9. هذا النسخة المشتركة من عملية التتسلل بسيطة وسريعة. ومع ذلك ، فإنه ليس مستقرا للغاية ولا حساسة. ومع ذلك ، فقد حددت في إجراء العديد من VSRs مع تسلسل البروتين المتنوعة والهياكل في العديد من فيروسات الجيش الملكي النيبالي7،8.
في الآونة الأخيرة ، تم وصف العديد من البروتينات المؤثرات التي يمكن أن تمنع نشاط إسكات الحمض النووي الريبي الخلوي من البكتيريا ، الأوميسيت ، ومسببات الأمراض النباتية الفطرية14،15،16. هذه النتائج تعني أن قمع الجيش الملكي النيبالي هو استراتيجية مشتركة لتسهيل العدوى التي تستخدمها مسببات الأمراض في معظم الممالك. من الناحية النظرية، قد العديد، إن لم يكن كل، من المؤثرات ترميز مثبطات إسكات الجيش الملكي النيبالي (RSSs)؛ غير أنه لم يتم حتى الآن تحديد سوى عدد قليل منها، ويرجع ذلك أساسا إلى نقص استراتيجية الفرز العامة الموثوقة. وعلاوة على ذلك، لم يتم التحقيق في مثبطات من إسكات الجيش الملكي النيبالي في الغالبية العظمى من مسببات الأمراض النباتية17.
في هذا التقرير، نقدم بروتوكولًا مثاليًا وعامًا لتحديد تأثيرات مسببات الأمراض النباتية التي يمكن أن تقمع إسكات الحمض النووي الريبي المحلي والنظامي باستخدام فحص التسلل الزراعي. وكان الهدف الأول من هذه الدراسة هو التأكيد على الجوانب الرئيسية للبروتوكول ووصف الخطوات بالتفصيل، وبالتالي توفير فحص للفحص يناسب تقريباً جميع تأثيرات مسببات الأمراض النباتية.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-Morpholinoethanesulfonic Acid (MES)</td>
			<td>Biofroxx</td>
			<td>1086GR500</td>
			<td>Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2xTaq Master Mix</td>
			<td>Vazyme Biotech</td>
			<td>P112-AA</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-(N-morpholino) propanesulfonic acid (MOPS)</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0264C507-1KG</td>
			<td>MOPS Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetosyringone (AS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D134406-5G</td>
			<td>Induction of Agrobacterium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A1296-1KG</td>
			<td>LB medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Biofroxx</td>
			<td>1110GR100</td>
			<td>Electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amersham Hybond -N+</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>RPN303 B</td>
			<td>Nothern blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amersham Imager</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>Amersham Imager 600</td>
			<td>Image</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Tryptone</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>211705</td>
			<td>LB medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Yeast Extraction</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>212750</td>
			<td>LB medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>D5100</td>
			<td>Photography</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChemiDoc MP Imaging System</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemiluminescent detection module component of dafa kits</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>89880</td>
			<td>Luminescence detection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0230-100G</td>
			<td>Antibiotics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ClonExpress II One Step Cloning Kit</td>
			<td>Vazyme Biotech</td>
			<td>C112-01</td>
			<td>Ligation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DIG Easy Hyb</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>11603558001</td>
			<td>Hybridization buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Easypure Plasmid Miniprep kit</td>
			<td>TransGen Biotech</td>
			<td>EM101-02</td>
			<td>Plasmid Extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasyPure Quick Gel Extraction Kit</td>
			<td>TransGen Biotech</td>
			<td>EG101-02</td>
			<td>Gel Extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA disodium salt dihydrate</td>
			<td>Amresco/VWR</td>
			<td>0105-1KG</td>
			<td>MOPS Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophoresis Power Supply</td>
			<td>LiuYi</td>
			<td>DYY6D</td>
			<td>Nucleic acid electrophoresis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FastDigest EcoRV</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>FD0304</td>
			<td>Vector digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Image System</td>
			<td>Tanon</td>
			<td>Tanon3500</td>
			<td>Image</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamycin</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0304-5G</td>
			<td>Antibiotics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin Sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>K1914</td>
			<td>Antibiotics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LR Clonase II enzyme</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11791020</td>
			<td>LR reaction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulose Blotting membrane 0.45um</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>10600002</td>
			<td>Northern</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NORTH2south biotin random prime dna labeling kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17075</td>
			<td>Biotin labeling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR Thermal Cyclers</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>T100</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peat moss</td>
			<td>PINDSTRUP</td>
			<td>Dark Gold + clay</td>
			<td>Plants</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peters Water-Soluble Fertilizer</td>
			<td>ICE</td>
			<td>Peter Professional 20-20-20</td>
			<td>Fertilizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase</td>
			<td>Vazyme Biotech</td>
			<td>P505-d1</td>
			<td>Enzyme</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rifampicin</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>219549005</td>
			<td>Antibiotics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA Gel Loading Dye (2X)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R0641</td>
			<td>RNA Gel Loading Dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Acetate Hydrate</td>
			<td>Amresco/VWR</td>
			<td>0530-1KG</td>
			<td>MOPS Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0241-10KG</td>
			<td>LB medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tri-Sodium citrate</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0101-1KG</td>
			<td>SSC Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizol Reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15596018</td>
			<td>RNA isolation reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV lamp</td>
			<td>Analytik Jena</td>
			<td>UVP B-100AP</td>
			<td>Observation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UVP Hybrilinker Oven</td>
			<td>Analytik Jena</td>
			<td>OV2000</td>
			<td>Northern</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

screening and identification of rna silencing suppressors from secreted effectors of plant pathogens

RNA إسكات هو حفظ تطوريا، آلية تنظيم الجينات تسلسل محددة في eukaryotes. وقد تطورت العديد من مسببات الأمراض النباتية البروتينات مع القدرة على تثبيط مسار إسكات الحمض النووي الريبي النبات المضيف. على عكس بروتينات تأثير الفيروسات ، أظهرت العديد من بروتينات المؤثرات المعسرة القدرة على قمع إسكات الحمض النووي الريبي في مسببات الأمراض البكتيرية والأوميسيتة والفطرية ، ولا تزال الوظائف الجزيئية لمعظم المؤثرات غير معروفة إلى حد كبير. هنا ، نصف بالتفصيل نسخة معدلة قليلا من تحليل التسلل المشترك التي يمكن أن تكون بمثابة طريقة عامة لمراقبة إسكات الحمض النووي الريبي وتوصيف البروتينات المؤثرات التي تفرزها مسببات الأمراض النباتية. الخطوات الرئيسية للنهج هي اختيار أوراق صحية ومكتملة النمو ، وضبط ثقافة البكتيريا إلى الكثافة البصرية المناسبة (OD) في 600 نانومتر ، ومراقبة البروتين الفلوري الأخضر (GFP) الفلورية في الوقت الأمثل على المتسللين يترك من أجل تجنب حذف المؤثرات مع ضعف نشاط القمع. هذا البروتوكول المحسن سيساهم في الفحص السريع والدقيق والمكثف للكتمات الإسكات الجيش الملكي النيبالي وبمثابة نقطة انطلاق ممتازة للتحقيق في الوظائف الجزيئية لهذه البروتينات.

أعلاه، نحن نصف الإجراء خطوة بخطوة لفحص فحص محسنة لتقييم نشاط RSS من تأثيرات P. sojae RxLR. وتستغرق التجربة في الإجمال 5-6 أسابيع. وفي وقت لاحق، يمكن أن تتسم RSSs التي تم تحديدها من خلال الفحص بمزيد من التفصيل من حيث الوظيفة والآلية الجزيئية. كمثال على نهجنا، استخدمنا P. sojae Rx...

Watch this Scientific Journal Video about Screening and Identification of RNA Silencing Suppressors from Secreted Effectors of Plant Pathogens at JoVE.com

Screening and Identification of RNA Silencing Suppressors from Secreted Effectors of Plant Pathogens

هنا ، نقدم طريقة فحص معدلة يمكن استخدامها على نطاق واسع لفحص مثبطات إسكات الحمض النووي الريبي بسرعة في مسببات الأمراض النباتية.

فحص وتحديد مثبطات إسكات الحمض النووي الريبي من المؤثرات المفرزة من مسببات الأمراض النباتية

RNA silencing is an evolutionarily conserved, sequence-specific gene regulation mechanism in eukaryotes. Several plant pathogens have evolved proteins ...

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية حول كيفية فحص مثبطات إسكات الحمض النووي الريبي التي تفرزها مسببات الأمراض النباتية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هو توفير فحص سريع ودقيق وواسع النطاق لرنا إسكات تحديد القامع. تحضير خلطات التربة بوتينغ تتكون من 50٪ طحلب الخث، 30٪ البيرلايت، و 20٪ فيرميكوليت والأتوكلاف في 120 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.نقع يمزج التربة autoclaved مع محلول الأسمدة النباتية في غرام واحد للتر الواحد وccpackage لهم في الأواني الصغيرة المخزنة في صينية أكبر. زرع واحد أو اثنين من بذور نيكوتيانا bethamiana 16c على سطح التربة من كل وعاء. غطي الصينية بقبة بلاستيكية واسمح للبذور بانباتها.ضع الصينية تحت غرف النمو الخفيفة ودرجات الحرارة التي تسيطر عليها مع درجة حرارة 23 إلى 25 درجة مئوية، 50 إلى 60٪ الرطوبة النسبية، وphotoperiod يوم طويل. بعد ثلاثة إلى أربعة أيام، تنبت البذور. اتخاذ القبة البلاستيكية قبالة والسماح للشتلات لتنمو في ظل نفس الظروف المستخدمة في خطوة الإنبات.كل يومين إلى ثلاثة أيام، إضافة كمية مناسبة من الماء حفظ التربة رطبة ولكن لا نقع. كل 10 أيام، إضافة الأسمدة لتعزيز مزيد من النمو. الحفاظ على النباتات Nicotiana bethamiana 16c في ظل الظروف العادية حتى النباتات لديها ما لا يقل عن خمسة أوراق حقيقية متطورة بالكامل مع عدم وجود الإبط مرئية أو براعم الزهور والأوراق لها مظهر أخضر صحي.استخدام 10 إلى 14 يوما نيكوتيانا bethamiana 16c النباتات لRNA النظامية إسكات المقايسات وثلاثة إلى أربعة أسابيع من أوراق نيكوتيانا bethamiana 16c لإسكات الحمض النووي الريبي المحلية المقايسة. استخدام طرف لاختيار مستعمرة إيجابية من لوحة LB وتطعيم الخلايا في أنبوب زجاجي يحتوي على خمسة ملليلتر من LB المتوسطة تكملها 50 ميكروغرام لكل ملليلتر Kanamycin و 50 ميكروغرام لكل ملليلتر ريفامبيسين. تنمو الخلايا في 30 درجة مئوية مع اهتزاز في 200 دورة في الدقيقة لمدة 24 إلى 48 ساعة.نقل 100 ميكرولترات من الثقافة إلى خمسة ملليلتر من LB المتوسطة تكملها مع نفس المضادات الحيوية، 10 ملليمولار MES في درجة الH 5.6، و 20 ميكرومولار AS. تنمو البكتيريا في 30 درجة مئوية مع اهتزاز في 200 دورة في الدقيقة لمدة 16 إلى 20 ساعة. الطرد المركزي الخلايا في 4،000 مرات ز لمدة 10 دقائق. تجاهل السوبر و resuspend بيليه في مليلترين من 10 ميليمولار المغنيسيوم كلوريد العازلة.كرر الغسيل لضمان الإزالة الكاملة للمضادات الحيوية. تحديد كثافة ثقافة البكتيريا الزراعية من خلال قياس الكثافة البصرية عند 600 نانومتر. ضبط ثقافة الخلية مع 10 ميليمولار المغنيسيوم كلوريد العازلة إلى OD 600 من 1.5 إلى 2.0.إضافة 10 ملليمولار MES في درجة ح 5.6 و 150 micromolar AS إلى ثقافة التعليق النهائي واحتضان الخلايا في درجة حرارة الغرفة لمدة ثلاث ساعات على الأقل دون اهتزاز. مزيج وحدات التخزين متساوية من ثقافة البكتيريا الزراعية التي تحتوي على 35S البروتين الفلورسنت الأخضر مع ثقافة البكتيريا الزراعية التي تحتوي على 35S الخيار فسيفساء فيروس القامع 2b، والمفتكة المفترضة أو ناقلات فارغة. باستخدام حقنة واحدة ملليلتر بدون إبرة، تتسلل بعناية وببطء إلى التعليقات الزراعية المختلطة على الجوانب الأباكسية من أوراق Nicotiana bethamiana 16c.إزالة تعليق البكتيرية المتبقية من الأوراق مع مناديل الأنسجة الرخوة ودائرة هوامش البقع تسلل مع قلم علامة. ثلاثة إلى أربعة أيام بعد التسلل، واستخدام مصباح الموجات فوق البنفسجية طويلة للكشف بصريا الفلوري GFP في بقع تسلل الأوراق. أسبوعين بعد التسلل، واستخدام مصباح للكشف عن أوراق نمت حديثا من المصنع كله لإسكات الحمض النووي الريبي النظامية.لعزل الجيش الملكي النيبالي الكلي من الأنسجة ورقة في أربعة إلى سبعة أيام بعد التسلل، وجمع أنسجة ورقة من تسلل Nicotiana bethamiana بقع 16c في هاون. ضع النيتروجين السائل في الهاون وطحن الأنسجة في مسحوق ناعم مع قضيب طحن ونقل المسحوق إلى أنبوب معقمة مليلتر. على الفور إضافة كاشف العزلة RNA في حجم ملليلتر واحد لكل 100 ملليغرام من الأنسجة إلى أنبوب عينة في غطاء محرك السيارة، دوامة بقوة لتجانس، واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق.إضافة الكلوروفورم في حجم 200 ميكرولتر لكل ملليلتر واحد من كاشف العزلة RNA إلى كل أنبوب في غطاء محرك السيارة، ويهز بقوة لمدة 15 ثانية، واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. أجهزة الطرد المركزي المتجانسة في 12،000 مرات ز لمدة 15 دقيقة في أربع درجات مئوية. نقل فائقة إلى أنبوب جديد RNase خالية والتخلص من بيليه.إضافة 0.7 حجم من الايزوبروبانول إلى فائقة، عكس بلطف عدة مرات، واحتضان الخليط في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق. عجل بيليه RNA عن طريق الطرد المركزي في 12، 000 مرات ز لمدة 15 دقيقة في أربع درجات مئوية. تجاهل المُندفع.غسل بيليه مع 70٪ الإيثانول والهواء الجاف بيليه في غطاء محرك السيارة. حل الجيش الملكي النيبالي في الماء المعالج diethyl pyrocarbonate عن طريق احتضان في حمام الماء 65 درجة مئوية لمدة 10 إلى 20 دقيقة. لأداء تحليل البقعة الشمالية من مستويات RNA رسول GFP، وإعداد 1.2٪ الفورمالديهايد denaturing هلام agarose في 1X MOPS تشغيل العازلة.اخلط الحمض النووي الريبي واحد إلى واحد مع صبغة تحميل الحمض النووي الريبي وتحريف الحمض النووي الريبي عن طريق الحضانة عند 65 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. على الفور البرد العينات المشوهة على الجليد لمدة دقيقة واحدة. مع ماصة، تحميل العينات في آبار الجل والكهرباء في 100 فولت لمدة 50 دقيقة حتى يتم فصل جيدا RNA.شطف هلام في 20X محلول ملحي سيترات الصوديوم العازلة لإزالة الفورمالديهايد. تنفيذ عملية نقل الشعيرات الدموية بين عشية وضحاها عن طريق إعداد 20X محلول صوديوم ملحي سيترات، طبقة واحدة من منشفة ورقية، طبقتين من ورق Whatman الرطب، طبقة واحدة من الجل، طبقة واحدة من غشاء النايلون، طبقتين من ورق Whatman الرطب، طبقتين من ورق Whatman الجاف، لوحة زجاجية واحدة، ووزن. في الصباح، يتم نقل الحمض النووي الريبي في الجل إلى غشاء النايلون.نقع الغشاء في 2X ملحي الصوديوم سيترات وإصلاح الجيش الملكي النيبالي للغشاء عن طريق تعريض الغشاء الرطب للأشعة فوق البنفسجية crosslinking. المضي قدما وفقا للمخطوطة. وقد تم اختراق الأوراق المطورة بالكامل من ثلاثة إلى أربعة أسابيع نيكوتيانا bethamiana 16c النباتات المشتركة في بقع مع خليط البكتيريا الزراعية تحمل 35S GFP.وفي غضون أربعة أيام بعد التسلل، تم تصوير الفلوريس من المنطقة المخترقة من GFP تحت الضوء الطبيعي والضوء طويل الموجات فوق البنفسجية. كشفت البقعة الشمالية أن GFP رسول الجيش الملكي النيبالي تراكمت أعلى في الأوراق التعبير عن 35S GFP بالإضافة إلى 35S CMV2b أو 35S GFP بالإضافة إلى 35S PSR1 مما كانت عليه في الأوراق التي تعبر عن 35S GFP بالإضافة إلى EV. تم إجراء فحص Agroinfiltration لتقييم انتشار إشارة إسكات في أوراق نيكوتيانا بيثاميانا 16c شتلات عمرها أسبوعان. في 14 يوما بعد التسلل، أكثر من 98٪ من EV لم تظهر إشارة واضحة GFP في الأوراق النظامية.في حين أن كلا CMV2b و PSR1 منعت بكفاءة انتشار النظامية لإشارة إسكات. لوحظت الفلورية GFP في حوالي 80٪ من النباتات المشتركة تسللت وفي 20٪ المتبقية من النباتات المتسللة مع وجود سوى عدد قليل من الأوردة الحمراء ظهرت في الأوراق ظهرت حديثا. هذه التقنية تمهد الطريق للباحثين لتحديد رواية RNA إسكات القامع يفرزها العديد من مسببات الأمراض النباتية.مزيج من النباتات و OD السليم هو أهم شيء أن نتذكر عند محاولة هذا الإجراء. بعد هذا الإجراء، يمكن القيام التوصيف الوظيفي من RNA إسكات القامع لاستكشاف آلية كيفية هذه القامعين اضغط على إسكات RNA المضيف وما هو الإخراج. يرجى ارتداء نظارات السلامة عند التسلل النباتات وأيضا ارتداء قفازات اللاتكس خلال جميع خطوات التجربة.

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetic Manipulation of the Plant Pathogen Ustilago maydis to Study Fungal Biology and Plant Microbe Interactions

Genetic Manipulation of the Plant Pathogen Ustilago maydis to Study Fungal Biology and Plant Microbe Interactions

التلاعب الجيني للمسببات الأمراض النباتية<em&gt; السوادية الذروية</em&gt; لدراسة علم الأحياء الفطرية النباتية وميكروب التفاعلات

Gene deletion plays an important role in the analysis of gene function. One of the most efficient methods to disrupt genes in a targeted manner is the ...

Mapping RNA-RNA Interactions Globally Using Biotinylated Psoralen

رسم الخرائط التفاعلات رنا-رنا على الصعيد العالمي باستخدام السورالين البيروكسيديز

Knowing how RNAs interact with themselves and with others is key to understanding RNA based gene regulation in the cell. While examples of RNA-RNA ...

Assessment of DNA Contamination in RNA Samples Based on Ribosomal DNA

تقييم التلوث الحمض النووي في عينات الحمض النووي الريبي استناداً إلى ريبوسومال الحمض النووي

One method extensively used for the quantification of gene expression changes and transcript abundances is reverse-transcription quantitative real-time ...

Purification of High Molecular Weight Genomic DNA from Powdery Mildew for Long-Read Sequencing

تنقية عالية الوزن الجزيئي الحمض النووي الجينوم من البياض الدقيقي لونغ-مقروءة التسلسل

The powdery mildew fungi are a group of economically important fungal plant pathogens. Relatively little is known about the molecular biology and genetics ...

RNA Pull-down Procedure to Identify RNA Targets of a Long Non-coding RNA

الجيش الملكي النيبالي المنسدلة الإجراء لتحديد أهداف الجيش الملكي النيبالي للجيش الملكي النيبالي منذ فترة طويلة غير الترميز

Long non-coding RNA (lncRNA), which are sequences of more than 200 nucleotides without a defined reading frame, belong to the regulatory non-coding ...

Exploring the Root Microbiome: Extracting Bacterial Community Data from the Soil, Rhizosphere, and Root Endosphere

استكشاف ميكروبيومي الجذر: استخراج البيانات المجتمع البكتيرية من التربة، ورهيزوسفيري، واندوسفيري الجذر

The intimate interaction between plant host and associated microorganisms is crucial in determining plant fitness, and can foster improved tolerance to ...

Generation of Cancer Cell Clones to Visualize Telomeric Repeat-containing RNA TERRA Expressed from a Single Telomere in Living Cells

جيل من سرطان الخلية استنساخ لتصور تيلوميريك التي تحتوي على تكرار الحمض النووي الريبي تيرا أعرب من Telomere واحدة في الخلايا الحية

Telomeres are transcribed, giving rise to telomeric repeat-containing long noncoding RNAs (TERRA), which have been proposed to play important roles in ...

Identification of Footprints of RNA:Protein Complexes via RNA Immunoprecipitation in Tandem Followed by Sequencing (RIPiT-Seq)

Identification of Footprints of RNA:Protein Complexes via RNA Immunoprecipitation in Tandem Followed by Sequencing RIPiT-Seq

تحديد آثار أقدام RNA: مجمعات البروتين عن طريق الحمض النووي الريبي المناعيفية جنبا إلى جنب تليها التسلسل (RIPiT-Seq)

RNA immunoprecipitation in tandem (RIPiT) is a method for enriching RNA footprints of a pair of proteins within an RNA:protein (RNP) complex. RIPiT ...

Identification of Circular RNAs using RNA Sequencing

تحديد RNAs الدائري باستخدام تسلسل RNA

Circular RNAs (circRNAs) are a class of non-coding RNAs involved in functions including micro-RNA (miRNA) regulation, mediation of protein-protein ...

A FACS-based Protocol to Isolate RNA from the Secondary Cells of Drosophila Male Accessory Glands

A FACS-based Protocol to Isolate RNA from the Secondary Cells of Drosophila Male Accessory Glands

بروتوكول يستند إلى FACS لعزل الحمض النووي الريبي من الخلايا الثانوية للغدد التبعي الذكور Drosophila

To understand the function of an organ, it is often useful to understand the role of its constituent cell populations. Unfortunately, the rarity of ...