Name: screening and identification of rna silencing suppressors from secreted effectors of plant pathogens
Uploaded: 2020-02-03T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Screening and Identification of RNA Silencing Suppressors from Secreted Effectors of Plant Pathogens at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af tilskud fra "Shuguang Program" af Shanghai Education Development Foundation og Shanghai Municipal Education Commission, National Key Research and Development Program i China National Key R & U Program of China ( 2018YFD0201500), National Natural Science Foundation of China (nr. 31571696 og 31660510), Thousand Talents Program for Young Professionals of China og Science and Technology Commission of Shanghai Kommune (18DZ2260500).

BEMÆRK: Alle trin i proceduren skal udføres ved stuetemperatur (RT).
FORSIGTIG: Deponere alle medier, der indeholder patogene mikrober, samt planter og plantevæv, der anvendes i analysen, i de relevante affaldsbeholdere og autoklave før udsmid.
1. Fremstilling af plasmider, der indeholder formodede virkningsmidler
<ol><li>Vælg formodede udskillede effektorer, der er stærkt udtrykt under infektion, som bestemt af RNA-sekventering (RNA-Seq), og yderligere ved ...

<ol>
	<li>Waterfield, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Virulence+Annotation+(RVA):+identification+of+virulence+factors+using+a+bacterial+genome+library+and+multiple+invertebrate+hosts.">Rapid Virulence Annotation (RVA): identification of virulence factors using a bacterial genome library and multiple invertebrate hosts.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (41), 15967-15972 (2008).</li><li>Rovenich, H., Boshoven, J. C., Thomma, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Filamentous+pathogen+effector+functions:+of+pathogens,+hosts+and+microbiomes.">Filamentous pathogen effector functions: of pathogens, hosts and microbiomes.</a> Current Opinion in Plant Biology. 20, 96-103 (2014).</li><li>Varden, F. A., De la Concepcion, J. C., Maidment, J. H., Banfield, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Taking+the+stage:+effectors+in+the+spotlight.">Taking the stage: effectors in the spotlight.</a> Current Opinion in Plant Biology. 38, 25-33 (2017).</li><li>Lee, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+Pseudomonas+syringae+Type+III+Secreted+Effector+Function+via+a+Yeast+Genomic+Screen.">Identifying Pseudomonas syringae Type III Secreted Effector Function via a Yeast Genomic Screen.</a> G3: Genes, Genomes, Genetics. 9 (2), 535-547 (2019).</li><li>Toruno, T. Y., Stergiopoulos, I., Coaker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant-Pathogen+Effectors:+Cellular+Probes+Interfering+with+Plant+Defenses+in+Spatial+and+Temporal+Manners.">Plant-Pathogen Effectors: Cellular Probes Interfering with Plant Defenses in Spatial and Temporal Manners.</a> Annual Review of Phytopathology. 54, 419-441 (2016).</li><li>Baulcombe, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+silencing+in+plants.">RNA silencing in plants.</a> Nature. 431 (7006), 356-363 (2004).</li><li>Pumplin, N., Voinnet, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+silencing+suppression+by+plant+pathogens:+defence,+counter-defence+and+counter-counter-defence.">RNA silencing suppression by plant pathogens: defence, counter-defence and counter-counter-defence.</a> Nature Reviews Microbiology. 11 (11), 745-760 (2013).</li><li>Csorba, T., Kontra, L., Burgyan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+silencing+suppressors:+Tools+forged+to+fine-tune+host-pathogen+coexistence.">Viral silencing suppressors: Tools forged to fine-tune host-pathogen coexistence.</a> Virology. 479-480, 85-103 (2015).</li><li>Johansen, L. K., Carrington, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silencing+on+the+spot.+Induction+and+suppression+of+RNA+silencing+in+the+Agrobacterium-mediated+transient+expression+system.">Silencing on the spot. Induction and suppression of RNA silencing in the Agrobacterium-mediated transient expression system.</a> Plant Physiology. 126 (3), 930-938 (2001).</li><li>Powers, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+assay+for+the+identification+of+RNA+silencing+suppressors+based+on+complementation+of+viral+movement.">A versatile assay for the identification of RNA silencing suppressors based on complementation of viral movement.</a> Molecular Plant-Microbe Interactions. 21 (7), 879-890 (2008).</li><li>Voinnet, O., Lederer, C., Baulcombe, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+viral+movement+protein+prevents+spread+of+the+gene+silencing+signal+in+Nicotiana+benthamiana.">A viral movement protein prevents spread of the gene silencing signal in Nicotiana benthamiana.</a> Cell. 103 (1), 157-167 (2000).</li><li>Deleris, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hierarchical+action+and+inhibition+of+plant+Dicer-like+proteins+in+antiviral+defense.">Hierarchical action and inhibition of plant Dicer-like proteins in antiviral defense.</a> Science. 313 (5783), 68-71 (2006).</li><li>Li, W. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferon+antagonist+proteins+of+influenza+and+vaccinia+viruses+are+suppressors+of+RNA+silencing.">Interferon antagonist proteins of influenza and vaccinia viruses are suppressors of RNA silencing.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (5), 1350-1355 (2004).</li><li>Navarro, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+plant+miRNA+contributes+to+antibacterial+resistance+by+repressing+auxin+signaling.">A plant miRNA contributes to antibacterial resistance by repressing auxin signaling.</a> Science. 312 (5772), 436-439 (2006).</li><li>Qiao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oomycete+pathogens+encode+RNA+silencing+suppressors.">Oomycete pathogens encode RNA silencing suppressors.</a> Nature Genetics. 45 (3), 330-333 (2013).</li><li>Yin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+fungal+effector+from+Puccinia+graminis+suppressing+RNA+silencing+and+plant+defense+responses.">A novel fungal effector from Puccinia graminis suppressing RNA silencing and plant defense responses.</a> New Phytologist. 222 (3), 1561-1572 (2019).</li><li>Zhang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+WY+domain+in+the+Phytophthora+effector+PSR1+is+required+for+infection+and+RNA+silencing+suppression+activity.">The WY domain in the Phytophthora effector PSR1 is required for infection and RNA silencing suppression activity.</a> New Phytologist. 223 (2), 839-852 (2019).</li><li>Petersen, T. N., Brunak, S., von Heijne, G., Nielsen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SignalP+4.0:+discriminating+signal+peptides+from+transmembrane+regions.">SignalP 4.0: discriminating signal peptides from transmembrane regions.</a> Nature Methods. 8 (10), 785-786 (2011).</li><li>Earley, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gateway-compatible+vectors+for+plant+functional+genomics+and+proteomics.">Gateway-compatible vectors for plant functional genomics and proteomics.</a> Plant Journal. 45 (4), 616-629 (2006).</li><li>Woodman, M. E., Savage, C. R., Arnold, W. K., Stevenson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+PCR+of+Intact+Bacteria+(Colony+PCR).">Direct PCR of Intact Bacteria (Colony PCR).</a> Current Protocols in Microbiology. 42 (1), 1-7 (2016).</li><li>Cao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+an+RNA+silencing+suppressor+from+a+plant+double-stranded+RNA+virus.">Identification of an RNA silencing suppressor from a plant double-stranded RNA virus.</a> Journal of Virology. 79 (20), 13018-13027 (2005).</li><li>Burgyan, J., Havelda, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+suppressors+of+RNA+silencing.">Viral suppressors of RNA silencing.</a> Trends in Plant Science. 16 (5), 265-272 (2011).</li><li>Incarbone, M., Dunoyer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+silencing+and+its+suppression:+novel+insights+from+in+planta+analyses.">RNA silencing and its suppression: novel insights from in planta analyses.</a> Trends in Plant Science. 18 (7), 382-392 (2013).</li><li>Martinez-Priego, L., Donaire, L., Barajas, D., Llave, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silencing+suppressor+activity+of+the+Tobacco+rattle+virus-encoded+16-kDa+protein+and+interference+with+endogenous+small+RNA-guided+regulatory+pathways.">Silencing suppressor activity of the Tobacco rattle virus-encoded 16-kDa protein and interference with endogenous small RNA-guided regulatory pathways.</a> Virology. 376 (2), 346-356 (2008).</li></ol>

RNA-hæmning er en vigtig forsvarsmekanisme, der anvendes af planter til bekæmpelse af virale, bakterielle, oomycete og svampepatogener. Til gengæld har disse mikrober udviklet lyddæmpning suppressor proteiner til at modvirke antiviral hæmning, og disse RSS'er forstyrre forskellige trin i RNA lyddæmpning vej22,23. Flere screening assays er blevet udviklet til at identificere RSSs10.
Her beskriver vi en forb...

I løbet af de sidste to årtier har acceleration i genomsekventering af mikroorganismer, der forårsager plantesygdomme, ført til en stadig stigende videnkløft mellem sekvensinformation og de biologiske funktioner i kodede proteiner1. Blandt de molekyler, der afsløres ved sekventering projekter er effector molekyler, der undertrykker medfødte immunitet og lette vært kolonisering; disse faktorer udskilles af destruktive plantepatogener, herunder bakterier, nematoder og filamentousmikrober. For at reagere på disse trusler, værtsplanter har udviklet nye receptorer, der genkender disse effektorer, muliggør restaurering af immunrespons. Derfor er effektorer udsat for forskellige selektive pres, hvilket fører til diversificering af effektor repertoirer blandt patogen slægter2. I de seneste år har formodede virkningsfaktorer fra plantepatogener vist sig at forstyrre plantemedfødte immunitet ved at hindre værtscelleprocesser til gavn for mikrober på en række forskellige måder, herunder dysregulering af signalveje, transskription, intracellulær transport, cytoskeletstabilitet, vesikelhandel og RNA-lyddæmpning3,4,5. Langt de fleste patogeneffektorer, især dem fra filamentouspatogener, er dog forblevet gådefulde.
RNA-lyddæmpning er en homologimedieret geninaktiveringsmaskiner, der bevares blandt eukaryoter. Processen udløses af lange dobbeltstrengede RNA (dsRNA) og er rettet mod det homologe enstrengede RNA (ssRNA) på en sekvensspecifik måde, og den manipulerer en bred vifte af biologiske processer, herunder antiviralt forsvar6. For at overvinde værtens medfødte immunrespons har nogle vira udviklet sig til at kompensere for RNA-lyddæmpning, herunder evnen til at replikere inde i intracellulære rum eller flygte fra det dæmpende reorganiserede signal. Ikke desto mindre er den mest generelle strategi, hvorved virus beskytter deres genomer mod RNA-hæmningsafhængig tab af genfunktion, at kode specifikke proteiner, der undertrykker RNA-hæmning7,8. Flere mekanistisk forskellige tilgange er blevet etableret for at screene og karakterisere virale suppressorer af RNA-lyddæmpning (VSRs), herunder co-infiltration af Agrobacterium tumefaciens kulturer, transgene planter udtrykker formodede suppressorer, podning og cellekultur9,10,11,12,13.
Hver af disse analyser har fordele og ulemper, og identificerer VSRs på sin egen særskilte måde. En af de mest almindelige tilgange er baseret på co-infiltration af individuelle A. tmuefaciens kulturer huser den potentielle virale protein og en reporter gen (typisk grøn fluorescerende protein [GFP]) på Nicotiana benthamiana 16c planter konstituerende udtrykke GFP under kontrol af blomkål mosaik virus 35S promotor. I mangel af en aktiv viral lyddæmpningssuppressor identificeres GFP som udefrakommende af værtscellerne og lukkes inden for 3 dage efter infiltration (dpi). Hvis det virale protein derimod har undertrykkelsesaktivitet, forbliver ekspressionsniveauet for GFP stabilt ud over 3−9 dpi9. Denne co-infiltration assay er enkel og hurtig; Den er dog hverken meget stabil eller følsom. Ikke desto mindre har analysen identificeret mange VSRs med forskellige proteinsekvenser og strukturer i mange RNA-vira7,8.
For nylig, flere effektor proteiner, der kan hæmme cellulære RNA lyddæmpning aktivitet er blevet karakteriseret ved bakterielle, oomycete, og svampeplante patogener14,15,16. Disse resultater indebærer, at RNA-undertrykkelse af lyddæmpning er en fælles strategi for at lette infektion, der bruges af patogener i de fleste kongeriger. I teorien kan mange, hvis ikke alle, af effektorerne indkode RNA-lyddæmpere (RSS); til dato er kun nogle få imidlertid blevet identificeret, hovedsagelig på grund af manglen på den pålidelige og generelle screeningsstrategi. Desuden er undertrykkere af RNA-hæmning ikke blevet undersøgt i langt de fleste plantepatogener17.
I denne rapport præsenterer vi en optimeret og generel protokol til identifikation af plantepatogeneffektorer, der kan undertrykke lokale og systemiske RNA-lyddæmpning ved hjælp af agroinfiltrationsanalysen. Hovedformålet med denne undersøgelse var at understrege de centrale aspekter af protokollen og beskrive trinene i detaljer, hvorved der gives en screeningsanalyse, der er egnet til næsten alle effektorer af plantepatogener.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-Morpholinoethanesulfonic Acid (MES)</td>
			<td>Biofroxx</td>
			<td>1086GR500</td>
			<td>Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2xTaq Master Mix</td>
			<td>Vazyme Biotech</td>
			<td>P112-AA</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-(N-morpholino) propanesulfonic acid (MOPS)</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0264C507-1KG</td>
			<td>MOPS Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetosyringone (AS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D134406-5G</td>
			<td>Induction of Agrobacterium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A1296-1KG</td>
			<td>LB medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Biofroxx</td>
			<td>1110GR100</td>
			<td>Electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amersham Hybond -N+</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>RPN303 B</td>
			<td>Nothern blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amersham Imager</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>Amersham Imager 600</td>
			<td>Image</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Tryptone</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>211705</td>
			<td>LB medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Yeast Extraction</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>212750</td>
			<td>LB medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>D5100</td>
			<td>Photography</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChemiDoc MP Imaging System</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemiluminescent detection module component of dafa kits</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>89880</td>
			<td>Luminescence detection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0230-100G</td>
			<td>Antibiotics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ClonExpress II One Step Cloning Kit</td>
			<td>Vazyme Biotech</td>
			<td>C112-01</td>
			<td>Ligation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DIG Easy Hyb</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>11603558001</td>
			<td>Hybridization buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Easypure Plasmid Miniprep kit</td>
			<td>TransGen Biotech</td>
			<td>EM101-02</td>
			<td>Plasmid Extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasyPure Quick Gel Extraction Kit</td>
			<td>TransGen Biotech</td>
			<td>EG101-02</td>
			<td>Gel Extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA disodium salt dihydrate</td>
			<td>Amresco/VWR</td>
			<td>0105-1KG</td>
			<td>MOPS Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophoresis Power Supply</td>
			<td>LiuYi</td>
			<td>DYY6D</td>
			<td>Nucleic acid electrophoresis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FastDigest EcoRV</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>FD0304</td>
			<td>Vector digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Image System</td>
			<td>Tanon</td>
			<td>Tanon3500</td>
			<td>Image</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamycin</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0304-5G</td>
			<td>Antibiotics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin Sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>K1914</td>
			<td>Antibiotics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LR Clonase II enzyme</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11791020</td>
			<td>LR reaction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulose Blotting membrane 0.45um</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>10600002</td>
			<td>Northern</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NORTH2south biotin random prime dna labeling kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17075</td>
			<td>Biotin labeling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR Thermal Cyclers</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>T100</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peat moss</td>
			<td>PINDSTRUP</td>
			<td>Dark Gold + clay</td>
			<td>Plants</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peters Water-Soluble Fertilizer</td>
			<td>ICE</td>
			<td>Peter Professional 20-20-20</td>
			<td>Fertilizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase</td>
			<td>Vazyme Biotech</td>
			<td>P505-d1</td>
			<td>Enzyme</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rifampicin</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>219549005</td>
			<td>Antibiotics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA Gel Loading Dye (2X)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R0641</td>
			<td>RNA Gel Loading Dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Acetate Hydrate</td>
			<td>Amresco/VWR</td>
			<td>0530-1KG</td>
			<td>MOPS Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0241-10KG</td>
			<td>LB medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tri-Sodium citrate</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0101-1KG</td>
			<td>SSC Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizol Reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15596018</td>
			<td>RNA isolation reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV lamp</td>
			<td>Analytik Jena</td>
			<td>UVP B-100AP</td>
			<td>Observation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UVP Hybrilinker Oven</td>
			<td>Analytik Jena</td>
			<td>OV2000</td>
			<td>Northern</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

screening and identification of rna silencing suppressors from secreted effectors of plant pathogens

RNA-lyddæmpning er en evolutionært bevaret, sekvensspecifik genreguleringsmekanisme i eukaryoter. Flere plantepatogener har udviklet proteiner med evnen til at hæmme værtsplanten RNA-lyddæmpningsvejen. I modsætning til virus effektor proteiner, kun flere udskilles effektor proteiner har vist evnen til at undertrykke RNA lyddæmpning i bakterielle, oomycete, og svampepatogener, og de molekylære funktioner i de fleste effektorer forbliver stort set ukendt. Her beskriver vi i detaljer en let modificeret version af co-infiltration assay, der kunne tjene som en generel metode til at observere RNA lyddæmpning og til karakterisering effektor proteiner udskilles af plantepatogener. De vigtigste trin i tilgangen er at vælge de sunde og fuldt udviklede blade, justere bakteriekulturen til den relevante optiske tæthed (OD) ved 600 nm, og observere grønne fluorescerende protein (GFP) fluorescens på det optimale tidspunkt på den infiltrerede for at undgå at udelade effektorer med svag undertrykkelsesaktivitet. Denne forbedrede protokol vil bidrage til hurtig, præcis og omfattende screening af RNA-lyddæmpningsundertrykkere og tjene som et glimrende udgangspunkt for at undersøge disse proteiners molekylære funktioner.

Ovenfor beskriver vi den trinvise procedure for en forbedret screeninganalyse til vurdering af RSS-aktiviteten af P. sojae RxLR-effektorer. Alt i alt tager eksperimentet 5−6 uger. Efterfølgende kan RSS'er identificeret ved analysen yderligere karakteriseres med hensyn til funktion og molekylær mekanisme. Som et eksempel på vores tilgang, brugte vi P. sojae RxLR effecto Phytophthora suppressor af RNA lyddæmpning 1 (PSR1), som udskilles og leveres i værtsceller genn...

Watch this Scientific Journal Video about Screening and Identification of RNA Silencing Suppressors from Secreted Effectors of Plant Pathogens at JoVE.com

Screening and Identification of RNA Silencing Suppressors from Secreted Effectors of Plant Pathogens

Her præsenterer vi en modificeret screeningsmetode, der i vid udstrækning kan bruges til hurtigt at screene RNA-lyddæmpningsundertrykkere i plantepatogener.

Screening og identifikation af RNA-lyddæmpningsundertrykkere fra udskillede effektorer af plantepatogener

RNA silencing is an evolutionarily conserved, sequence-specific gene regulation mechanism in eukaryotes. Several plant pathogens have evolved proteins ...

Denne metode kan hjælpe med at besvare centrale spørgsmål om, hvordan man screener RNA-hæmningsdæmpere, der udskilles af plantepatogener. Den største fordel ved denne teknik er at give en hurtig, præcis og omfattende screening analyse for RNA lyddæmpende suppressors identifikation. Forbered pottepot jord blandinger bestående af 50% tørv mos, 30% perlite, og 20% vermiculit og autoklave ved 120 grader Celsius i 20 minutter.Soak den autoklaveret jord blander sig med plantegødning løsning på et gram per liter og subpackage dem i mindre potter gemt i en større bakke. Så en eller to frø af Nicotiana bethamiana 16c på jordoverfladen af hver pot. Dæk bakken med en plastik kuppel og lad frøene spire.Placer bakken under lys og temperatur-kontrollerede vækstkamre med en temperatur på 23 til 25 grader Celsius, 50 til 60% relativ luftfugtighed, og en lang dag fotoperiode. Efter tre til fire dage spirer frøene. Tag plastkuplen af og lad planterne vokse under de samme betingelser, der anvendes til spiringstrinnet.Hver to til tre dage, tilsæt en passende mængde vand holde jorden fugtig, men ikke iblødsætning. Hver 10 dage, tilføje gødning for at fremme yderligere vækst. Opretholde Nicotiana bethamiana 16c planter under normale forhold, indtil planterne har mindst fem fuldt udviklede sande blade uden synlige aksillære eller blomsterknopper og bladene har en sund grøn udseende.Brug 10 til 14-dages gamle Nicotiana bethamiana 16c planter til systemiske RNA-lyddæmningsanalyser og tre til fire uger gamle blade af Nicotiana bethamiana 16c til lokale RNA-hæmningsanalyser. Brug en spids til at vælge en positiv koloni fra LB pladen og inokulere cellerne i et glasrør, der indeholder fem milliliter LB medium suppleret med 50 mikrogram pr. milliliter Kanamycin og 50 mikrogram pr. milliliter Rifampicin. Dyrk cellerne ved 30 grader Celsius med rystelser ved 200 omdr./min. i 24 til 48 timer.100 mikroliter af kulturen overføres til fem milliliter LB-medium suppleret med de samme antibiotika, 10 millimolar MES ved pH 5,6 og 20 micromolar AS. Dyrk bakterierne ved 30 grader Celsius med rystelser ved 200 RPM i 16 til 20 timer. Centrifuge cellerne ved 4,000 gange g i 10 minutter. Supernatanten kasseres, og pelleten skal opbruges i to milliliter 10 millimolar magnesiumchloridbuffer.Gentag vasken for at sikre fuldstændig fjernelse af antibiotika. Agrobakteriets tæthed bestemmes ved måling af den optiske massen ved 600 nanometer. Cellerekulturen justeres med 10 millimolar magnesiumchloridbuffer til en OD 600 på 1,5 til 2,0.Der tilsættes 10 millimolar MES ved pH 5.6 og 150 micromolar AS til den endelige suspensionskultur, og cellerne inkuberes ved stuetemperatur i mindst tre timer uden at ryste. Bland lige store mængder af en Agrobacterium kultur, der indeholder 35S grønt fluorescerende protein med en Agrobacterium kultur, der indeholder 35S agurk mosaik virus suppressor 2b, formodede effektor eller tom vektor. Ved hjælp af en en milliliter nåleløs sprøjte, omhyggeligt og langsomt infiltrere de blandede Agrobacterium suspensioner på abaxial sider af Nicotiana bethamiana 16c blade.Fjern den resterende bakteriel suspension fra bladene med bløddelsservietter og cirkel margenerne af de infiltrerede pletter med en markør pen. Tre til fire dage efter infiltration, bruge en lang bølge ultraviolet lampe til visuelt at opdage GFP fluorescens i de infiltrerede pletter af blade. To uger efter infiltration, bruge lampen til at opdage nyvoksnede blade af hele anlægget for systemisk RNA-lyddæmning.For at isolere det samlede RNA fra bladvævet fire til syv dage efter infiltration, indsamle blade væv fra de infiltrerede Nicotiana bethamiana 16c patches i en morter. Placer flydende nitrogen i mørtel og male vævet i et fint pulver med en slibestang og overføre pulveret til en steril to milliliter rør. Tilsæt straks RNA isolation reagens ved volumen af en milliliter pr 100 milligram væv til prøverøret i en hætte, vortex kraftigt at homogenisere, og inkubere ved stuetemperatur i fem minutter.Der tilsættes chloroform ved volumen af 200 mikroliter pr. en milliliter reagens af RNA-isolationsreage til hvert rør i emhætten, ryst kraftigt i 15 sekunder og inkuberes ved stuetemperatur i fem minutter. Centrifuge homogenate ved 12, 000 gange g i 15 minutter ved fire grader Celsius. Overfør supernatanten til et nyt RNase-frit rør, og kassér pelletsen.Tilsæt 0,7 volumen isopropanol til supernatant, forsigtigt invertere flere gange, og inkubere blandingen ved stuetemperatur i 10 minutter. Udfælde RNA-pellet ved centrifugering ved 12.000 gange g i 15 minutter ved fire grader Celsius. Kassér supernatanten.Vask pellet med 70% ethanol og lufttørre pellet i en hætte. RNA opløses i diethylpyocarbonatbehandlet vand ved at inkubere i et 65 grader Celsius-vandbad i 10 til 20 minutter. For at udføre Northern blot analyse af GFP messenger RNA niveauer, forberede en 1,2% formaldehyd denaturering agarose gel i 1X MOPS kører buffer.Bland RNA en-til-en med RNA loading farvestof og protese RNA ved inkubation ved 65 grader Celsius i 10 minutter. Chill straks de denaturerede prøver på is i et minut. Med en pipette skal prøverne indlæses i gelens og elektrofossens brønde ved 100 volt i 50 minutter, indtil RNA'et er godt adskilt.Skyl gelen i 20X saltvandsnatriumcitratbuffer for at fjerne formaldehyd. Udfør kapillær overførsel natten over ved at oprette 20X saltvandsnatriumcitrat buffer, et lag køkkenrulle, to lag våd Whatman papir, et lag gel, et lag nylon membran, to lag våd Whatman papir, to lag tørt Whatman papir, en glasplade, og en vægt. Om morgenen overføres RNA'et i gelen til nylonmembranen.Læg membranen i blød i 2X saltvandsnatriumcitrat og fastgør RNA'et til membranen ved at udsætte den våde membran for UV-krydslinking. Fortsæt i henhold til manuskriptet. Fuldt udviklede blade af tre til fire uger gamle Nicotiana bethamiana 16c planter blev co-infiltreret i patches med Agrobacterium blandinger transporterer 35S GFP.På fire dage efter infiltration, GFP fluorescens af det infiltrerede område blev afbildet under naturligt lys og lang bølge UV-lys. Northern blot afslørede, at GFP messenger RNA akkumuleret højere i bladene udtrykke 35S GFP plus 35S CMV2b eller 35S GFP plus 35S PSR1 end i bladene udtrykker 35S GFP plus EV. Agroinfiltration assay blev udført for at vurdere spredningen af lyddæmning signal i bladene af to uger gamle Nicotiana bethamiana 16c planter. På 14 dage efter infiltration, mere end 98% af EV udstillet ingen indlysende GFP signalering i systemiske blade.Der henviser til, at både CMV2b og PSR1 effektivt hæmmede den systemiske spredning af lyddæmningssignalet. GFP fluorescens blev observeret i omkring 80% af co-infiltreret planter og i de resterende 20% af infiltrerede planter med kun et par røde vener dukkede op i nyligt opstået blade. Denne teknik baner vejen for forskere til at identificere nye RNA tavshed undertrykkere udskilles af mange plantepatogener.Kombinationen af planter og den rette OD er det vigtigste at huske, når du forsøger denne procedure. Efter denne procedure kan den funktionelle karakterisering af RNA-lyddæmperen gøres for at undersøge mekanismen for, hvordan disse suppressorer presser værts-RNA-lyddæmpning, og hvad er outputtet. Bær venligst sikkerhedsbrillerne, når du infiltrerer planterne, og brug også latexhandskerne under alle forsøgstrinnene.

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetic Manipulation of the Plant Pathogen Ustilago maydis to Study Fungal Biology and Plant Microbe Interactions

Genetic Manipulation of the Plant Pathogen Ustilago maydis to Study Fungal Biology and Plant Microbe Interactions

Genetisk Manipulation af afgroedesygdomme<em&gt; Ustilago maydis</em&gt; At studere Fungal Biology og Plant Microbe Interactions

Gene deletion plays an important role in the analysis of gene function. One of the most efficient methods to disrupt genes in a targeted manner is the ...

Mapping RNA-RNA Interactions Globally Using Biotinylated Psoralen

Kortlægning af RNA-RNA-interaktioner globalt ved anvendelse af biotinyleret psoralen

Knowing how RNAs interact with themselves and with others is key to understanding RNA based gene regulation in the cell. While examples of RNA-RNA ...

Assessment of DNA Contamination in RNA Samples Based on Ribosomal DNA

Vurdering af DNA forurening i RNA prøver baseret på ribosomale DNA

One method extensively used for the quantification of gene expression changes and transcript abundances is reverse-transcription quantitative real-time ...

Purification of High Molecular Weight Genomic DNA from Powdery Mildew for Long-Read Sequencing

Rensning af High Molecular Weight Genomisk DNA fra meldug for lang Læs sekventering

The powdery mildew fungi are a group of economically important fungal plant pathogens. Relatively little is known about the molecular biology and genetics ...

RNA Pull-down Procedure to Identify RNA Targets of a Long Non-coding RNA

RNA Pull-down Procedure til identifikation af en længe ikke-kodende RNA RNA mål

Long non-coding RNA (lncRNA), which are sequences of more than 200 nucleotides without a defined reading frame, belong to the regulatory non-coding ...

Exploring the Root Microbiome: Extracting Bacterial Community Data from the Soil, Rhizosphere, and Root Endosphere

At udforske Root Microbiome: udtrække bakteriel Fællesskabets Data fra jord, rhizosfære og rod Endosphere

The intimate interaction between plant host and associated microorganisms is crucial in determining plant fitness, and can foster improved tolerance to ...

Generation of Cancer Cell Clones to Visualize Telomeric Repeat-containing RNA TERRA Expressed from a Single Telomere in Living Cells

Generation af kræft celle kloner til at visualisere Telomeric Repeat-holdige RNA TERRA udtrykt fra en enkelt Telomer i levende celler

Telomeres are transcribed, giving rise to telomeric repeat-containing long noncoding RNAs (TERRA), which have been proposed to play important roles in ...

Identification of Footprints of RNA:Protein Complexes via RNA Immunoprecipitation in Tandem Followed by Sequencing (RIPiT-Seq)

Identification of Footprints of RNA:Protein Complexes via RNA Immunoprecipitation in Tandem Followed by Sequencing RIPiT-Seq

Identifikation af fodspor af RNA: protein komplekser via RNA Immunopræcipitation i tandem efterfulgt af sekventering (RIPiT-SEQ)

RNA immunoprecipitation in tandem (RIPiT) is a method for enriching RNA footprints of a pair of proteins within an RNA:protein (RNP) complex. RIPiT ...

Identification of Circular RNAs using RNA Sequencing

Identifikation af cirkulære RNAs ved hjælp af RNA-sekvensering

Circular RNAs (circRNAs) are a class of non-coding RNAs involved in functions including micro-RNA (miRNA) regulation, mediation of protein-protein ...

A FACS-based Protocol to Isolate RNA from the Secondary Cells of Drosophila Male Accessory Glands

A FACS-based Protocol to Isolate RNA from the Secondary Cells of Drosophila Male Accessory Glands

En FACS-baseret protokol til at isolere RNA fra de sekundære celler af Drosophila mandlige tilbehørs kirtler

To understand the function of an organ, it is often useful to understand the role of its constituent cell populations. Unfortunately, the rarity of ...