Name: screening and identification of rna silencing suppressors from secreted effectors of plant pathogens
Uploaded: 2020-02-03T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Screening and Identification of RNA Silencing Suppressors from Secreted Effectors of Plant Pathogens at JoVE.com

Dit werk werd ondersteund door subsidies van het "Shuguang Program" van Shanghai Education Development Foundation en Shanghai Municipal Education Commission, het National Key Research and Development Program van China National Key R & D Program of China ( 2018YFD0201500), de National Natural Science Foundation of China (nr. 31571696 en 31660510), het Thousand Talents Program for Young Professionals of China, en de Science and Technology Commission of Shanghai Municipality (18DZ2260500).

OPMERKING: Alle stappen van de procedure moeten worden uitgevoerd bij kamertemperatuur (RT).
LET OP: Stort alle media die pathogene microben bevatten, evenals de planten en plantenweefsel die in de test worden gebruikt, in de juiste afvalcontainers en autoclave voordat ze worden weggegooid.
1. Bereiding van plasmidconstructies die putavestoffen bevatten
<ol><li>Selecteer putative gescheiden effectoren die sterk worden uitgedrukt tijdens infectie, zoals bepaald doo...

<ol>
	<li>Waterfield, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Virulence+Annotation+(RVA):+identification+of+virulence+factors+using+a+bacterial+genome+library+and+multiple+invertebrate+hosts.">Rapid Virulence Annotation (RVA): identification of virulence factors using a bacterial genome library and multiple invertebrate hosts.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (41), 15967-15972 (2008).</li><li>Rovenich, H., Boshoven, J. C., Thomma, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Filamentous+pathogen+effector+functions:+of+pathogens,+hosts+and+microbiomes.">Filamentous pathogen effector functions: of pathogens, hosts and microbiomes.</a> Current Opinion in Plant Biology. 20, 96-103 (2014).</li><li>Varden, F. A., De la Concepcion, J. C., Maidment, J. H., Banfield, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Taking+the+stage:+effectors+in+the+spotlight.">Taking the stage: effectors in the spotlight.</a> Current Opinion in Plant Biology. 38, 25-33 (2017).</li><li>Lee, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+Pseudomonas+syringae+Type+III+Secreted+Effector+Function+via+a+Yeast+Genomic+Screen.">Identifying Pseudomonas syringae Type III Secreted Effector Function via a Yeast Genomic Screen.</a> G3: Genes, Genomes, Genetics. 9 (2), 535-547 (2019).</li><li>Toruno, T. Y., Stergiopoulos, I., Coaker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant-Pathogen+Effectors:+Cellular+Probes+Interfering+with+Plant+Defenses+in+Spatial+and+Temporal+Manners.">Plant-Pathogen Effectors: Cellular Probes Interfering with Plant Defenses in Spatial and Temporal Manners.</a> Annual Review of Phytopathology. 54, 419-441 (2016).</li><li>Baulcombe, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+silencing+in+plants.">RNA silencing in plants.</a> Nature. 431 (7006), 356-363 (2004).</li><li>Pumplin, N., Voinnet, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+silencing+suppression+by+plant+pathogens:+defence,+counter-defence+and+counter-counter-defence.">RNA silencing suppression by plant pathogens: defence, counter-defence and counter-counter-defence.</a> Nature Reviews Microbiology. 11 (11), 745-760 (2013).</li><li>Csorba, T., Kontra, L., Burgyan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+silencing+suppressors:+Tools+forged+to+fine-tune+host-pathogen+coexistence.">Viral silencing suppressors: Tools forged to fine-tune host-pathogen coexistence.</a> Virology. 479-480, 85-103 (2015).</li><li>Johansen, L. K., Carrington, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silencing+on+the+spot.+Induction+and+suppression+of+RNA+silencing+in+the+Agrobacterium-mediated+transient+expression+system.">Silencing on the spot. Induction and suppression of RNA silencing in the Agrobacterium-mediated transient expression system.</a> Plant Physiology. 126 (3), 930-938 (2001).</li><li>Powers, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+assay+for+the+identification+of+RNA+silencing+suppressors+based+on+complementation+of+viral+movement.">A versatile assay for the identification of RNA silencing suppressors based on complementation of viral movement.</a> Molecular Plant-Microbe Interactions. 21 (7), 879-890 (2008).</li><li>Voinnet, O., Lederer, C., Baulcombe, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+viral+movement+protein+prevents+spread+of+the+gene+silencing+signal+in+Nicotiana+benthamiana.">A viral movement protein prevents spread of the gene silencing signal in Nicotiana benthamiana.</a> Cell. 103 (1), 157-167 (2000).</li><li>Deleris, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hierarchical+action+and+inhibition+of+plant+Dicer-like+proteins+in+antiviral+defense.">Hierarchical action and inhibition of plant Dicer-like proteins in antiviral defense.</a> Science. 313 (5783), 68-71 (2006).</li><li>Li, W. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferon+antagonist+proteins+of+influenza+and+vaccinia+viruses+are+suppressors+of+RNA+silencing.">Interferon antagonist proteins of influenza and vaccinia viruses are suppressors of RNA silencing.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (5), 1350-1355 (2004).</li><li>Navarro, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+plant+miRNA+contributes+to+antibacterial+resistance+by+repressing+auxin+signaling.">A plant miRNA contributes to antibacterial resistance by repressing auxin signaling.</a> Science. 312 (5772), 436-439 (2006).</li><li>Qiao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oomycete+pathogens+encode+RNA+silencing+suppressors.">Oomycete pathogens encode RNA silencing suppressors.</a> Nature Genetics. 45 (3), 330-333 (2013).</li><li>Yin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+fungal+effector+from+Puccinia+graminis+suppressing+RNA+silencing+and+plant+defense+responses.">A novel fungal effector from Puccinia graminis suppressing RNA silencing and plant defense responses.</a> New Phytologist. 222 (3), 1561-1572 (2019).</li><li>Zhang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+WY+domain+in+the+Phytophthora+effector+PSR1+is+required+for+infection+and+RNA+silencing+suppression+activity.">The WY domain in the Phytophthora effector PSR1 is required for infection and RNA silencing suppression activity.</a> New Phytologist. 223 (2), 839-852 (2019).</li><li>Petersen, T. N., Brunak, S., von Heijne, G., Nielsen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SignalP+4.0:+discriminating+signal+peptides+from+transmembrane+regions.">SignalP 4.0: discriminating signal peptides from transmembrane regions.</a> Nature Methods. 8 (10), 785-786 (2011).</li><li>Earley, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gateway-compatible+vectors+for+plant+functional+genomics+and+proteomics.">Gateway-compatible vectors for plant functional genomics and proteomics.</a> Plant Journal. 45 (4), 616-629 (2006).</li><li>Woodman, M. E., Savage, C. R., Arnold, W. K., Stevenson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+PCR+of+Intact+Bacteria+(Colony+PCR).">Direct PCR of Intact Bacteria (Colony PCR).</a> Current Protocols in Microbiology. 42 (1), 1-7 (2016).</li><li>Cao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+an+RNA+silencing+suppressor+from+a+plant+double-stranded+RNA+virus.">Identification of an RNA silencing suppressor from a plant double-stranded RNA virus.</a> Journal of Virology. 79 (20), 13018-13027 (2005).</li><li>Burgyan, J., Havelda, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+suppressors+of+RNA+silencing.">Viral suppressors of RNA silencing.</a> Trends in Plant Science. 16 (5), 265-272 (2011).</li><li>Incarbone, M., Dunoyer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+silencing+and+its+suppression:+novel+insights+from+in+planta+analyses.">RNA silencing and its suppression: novel insights from in planta analyses.</a> Trends in Plant Science. 18 (7), 382-392 (2013).</li><li>Martinez-Priego, L., Donaire, L., Barajas, D., Llave, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silencing+suppressor+activity+of+the+Tobacco+rattle+virus-encoded+16-kDa+protein+and+interference+with+endogenous+small+RNA-guided+regulatory+pathways.">Silencing suppressor activity of the Tobacco rattle virus-encoded 16-kDa protein and interference with endogenous small RNA-guided regulatory pathways.</a> Virology. 376 (2), 346-356 (2008).</li></ol>

RNA-uitschakeling is een belangrijk afweermechanisme dat door planten wordt gebruikt om virale, bacteriële, oomycete- en schimmelpathogenen te bestrijden. Op hun beurt hebben deze microben ontwikkeld uitschakeling suppressor eiwitten tegen te gaan antivirale uitschakeling, en deze RSSs interfereren met verschillende stappen van de RNA silencing pad22,23. Verschillende screeningtests zijn ontwikkeld om RSSs te identificeren10.
<p class...

In de afgelopen twee decennia heeft versnelling van genoomsequencing van micro-organismen die plantenziekten veroorzaken geleid tot een steeds grotere kenniskloof tussen sequentie-informatie en de biologische functies van gecodeerde eiwitten1. Onder de moleculen onthuld door sequencing projecten zijn effector moleculen die aangeboren immuniteit te onderdrukken en te vergemakkelijken gastheer kolonisatie; deze factoren worden afgescheiden door destructieve plantenpathogenen, waaronder bacteriën, aaltjes en filamenteuze microben. Om op deze bedreigingen te reageren, hebben waardplanten nieuwe receptoren ontwikkeld die deze effectoren herkennen, waardoor herstel van de immuunrespons mogelijk is. Effectoren zijn dus onderhevig aan verschillende selectieve druk, wat leidt tot diversificatie van effectorrepertoires onder pathogene lijnen2. In de afgelopen jaren is aangetoond dat putatieve effectoren van plantenpathogenen de immuniteit van planteningeboren en ontkracht door druk te maken tot cellulaire processen van de gastheer om de microben op verschillende manieren ten goede te komen, waaronder dysregulatie van signaleringstrajecten, transcriptie, intracellulair vervoer, cytoskeletstabiliteit, blaashandel en RNA-uitschakeling3,4,5. De overgrote meerderheid van de pathogene effectoren, met name die van filamenteuze ziekteverwekkers, is echter raadselachtig gebleven.
RNA-uitschakeling is een homologie-gemedieerde geninactivatiemachines die worden bewaard onder eukaryoten. Het proces wordt geactiveerd door lange dubbelstrengs RNA (dsRNA) en richt zich op het homologe single-stranded RNA (ssRNA) op een sequentiespecifieke manier, en het manipuleert een breed scala aan biologische processen, waaronder antivirale verdediging6. Om aangeboren immuunreacties van de gastheer te overwinnen, zijn sommige virussen geëvolueerd om RNA-uitschakeling te compenseren, inclusief de mogelijkheid om te repliceren in intracellulaire compartimenten of te ontsnappen aan het gereorganiseerde signaal. Niettemin is de meest algemene strategie waarmee virussen hun genoom beschermen tegen RNA-uitschakelingsafhankelijk verlies van genfunctie, het coderen van specifieke eiwitten die RNA-uitschakelingonderdrukken 7,8. Verschillende benaderingen zijn vastgesteld om virale suppressors van RNA-uitschakeling (VSRs) te screenen en te karakteriseren, waaronder de co-infiltratie van Agrobacterium tumefaciens culturen, transgene planten die putatieve suppressors, enting en celcultuur9,10,11,12,13.
Elk van deze tests heeft voor- en nadelen, en identificeert VSRs op zijn eigen verschillende manier. Een van de meest voorkomende benaderingen is gebaseerd op de co-infiltratie van individuele A. tmuefaciens culturen herbergen de potentiële virale eiwit en een reporter gen (typisch groene fluorescerende eiwit [GFP]) op de Nicotiana benthamiana 16c planten constitutief uitdrukken GFP onder de controle van de bloemkool mozaïek virus 35S promotor. Bij afwezigheid van een actieve virale uitschakelingsuppressor wordt GFP door de gastheercellen als exogene geïdentificeerd en wordt het binnen 3 dagen na infiltratie het zwijgen opgelegd (dpi). Als het virale eiwit daarentegen onderdrukkingsactiviteit bezit, blijft het expressieniveau van GFP stabiel boven 3−9 dpi9. Deze co-infiltratie test is eenvoudig en snel; het is echter niet zeer stabiel of gevoelig. Niettemin heeft de test tal van VSR's geïdentificeerd met diverse eiwitsequenties en structuren in veel RNA-virussen7,8.
Onlangs zijn verschillende effector eiwitten die de cellulaire RNA-uitschakelingsactiviteit kunnen remmen, gekenmerkt door bacteriële, oomycete- en schimmelplantenpathogenen14,15,16. Deze bevindingen impliceren dat RNA-uitschakelingsonderdrukking een gemeenschappelijke strategie is voor het vergemakkelijken van infectie die door ziekteverwekkers in de meeste koninkrijken wordt gebruikt. In theorie zouden veel, zo niet alle, van de effectoren RNA-uitschakelingsonderdrukkenden (RSS'en) kunnen coderen; tot op heden zijn er echter slechts enkele geïdentificeerd, voornamelijk als gevolg van het tekort aan de betrouwbare en algemene screeningstrategie. Bovendien zijn suppressors van RNA-uitschakeling niet onderzocht in de overgrote meerderheid van de plantenpathogenen17.
In dit rapport presenteren we een geoptimaliseerd en algemeen protocol voor het identificeren van plantenpathogene effectoren die lokale en systemische RNA-uitschakeling kunnen onderdrukken met behulp van de agro-infiltratietest. Het belangrijkste doel van deze studie was om de belangrijkste aspecten van het protocol te benadrukken en de stappen in detail te beschrijven, waardoor een screeningtest werd verstrekt die geschikt is voor bijna alle effectoren van plantenpathogenen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-Morpholinoethanesulfonic Acid (MES)</td>
			<td>Biofroxx</td>
			<td>1086GR500</td>
			<td>Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2xTaq Master Mix</td>
			<td>Vazyme Biotech</td>
			<td>P112-AA</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-(N-morpholino) propanesulfonic acid (MOPS)</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0264C507-1KG</td>
			<td>MOPS Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetosyringone (AS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D134406-5G</td>
			<td>Induction of Agrobacterium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A1296-1KG</td>
			<td>LB medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Biofroxx</td>
			<td>1110GR100</td>
			<td>Electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amersham Hybond -N+</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>RPN303 B</td>
			<td>Nothern blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amersham Imager</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>Amersham Imager 600</td>
			<td>Image</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Tryptone</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>211705</td>
			<td>LB medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Yeast Extraction</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>212750</td>
			<td>LB medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>D5100</td>
			<td>Photography</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChemiDoc MP Imaging System</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemiluminescent detection module component of dafa kits</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>89880</td>
			<td>Luminescence detection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0230-100G</td>
			<td>Antibiotics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ClonExpress II One Step Cloning Kit</td>
			<td>Vazyme Biotech</td>
			<td>C112-01</td>
			<td>Ligation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DIG Easy Hyb</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>11603558001</td>
			<td>Hybridization buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Easypure Plasmid Miniprep kit</td>
			<td>TransGen Biotech</td>
			<td>EM101-02</td>
			<td>Plasmid Extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasyPure Quick Gel Extraction Kit</td>
			<td>TransGen Biotech</td>
			<td>EG101-02</td>
			<td>Gel Extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA disodium salt dihydrate</td>
			<td>Amresco/VWR</td>
			<td>0105-1KG</td>
			<td>MOPS Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophoresis Power Supply</td>
			<td>LiuYi</td>
			<td>DYY6D</td>
			<td>Nucleic acid electrophoresis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FastDigest EcoRV</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>FD0304</td>
			<td>Vector digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Image System</td>
			<td>Tanon</td>
			<td>Tanon3500</td>
			<td>Image</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamycin</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0304-5G</td>
			<td>Antibiotics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin Sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>K1914</td>
			<td>Antibiotics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LR Clonase II enzyme</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11791020</td>
			<td>LR reaction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulose Blotting membrane 0.45um</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>10600002</td>
			<td>Northern</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NORTH2south biotin random prime dna labeling kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17075</td>
			<td>Biotin labeling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR Thermal Cyclers</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>T100</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peat moss</td>
			<td>PINDSTRUP</td>
			<td>Dark Gold + clay</td>
			<td>Plants</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peters Water-Soluble Fertilizer</td>
			<td>ICE</td>
			<td>Peter Professional 20-20-20</td>
			<td>Fertilizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase</td>
			<td>Vazyme Biotech</td>
			<td>P505-d1</td>
			<td>Enzyme</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rifampicin</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>219549005</td>
			<td>Antibiotics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA Gel Loading Dye (2X)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R0641</td>
			<td>RNA Gel Loading Dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Acetate Hydrate</td>
			<td>Amresco/VWR</td>
			<td>0530-1KG</td>
			<td>MOPS Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0241-10KG</td>
			<td>LB medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tri-Sodium citrate</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0101-1KG</td>
			<td>SSC Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizol Reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15596018</td>
			<td>RNA isolation reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV lamp</td>
			<td>Analytik Jena</td>
			<td>UVP B-100AP</td>
			<td>Observation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UVP Hybrilinker Oven</td>
			<td>Analytik Jena</td>
			<td>OV2000</td>
			<td>Northern</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

screening and identification of rna silencing suppressors from secreted effectors of plant pathogens

RNA-uitschakeling is een evolutionair geconserveerd, sequentiespecifiek genregulatiemechanisme in eukaryoten. Verschillende plantenpathogenen hebben eiwitten ontwikkeld met de mogelijkheid om de gastheer plant RNA uitschakeling pad remmen. In tegenstelling tot virus effector eiwitten, slechts een aantal uitgescheiden effector eiwitten hebben aangetoond dat de mogelijkheid om RNA-uitschakeling te onderdrukken in bacteriële, oomycete, en schimmelpathogenen, en de moleculaire functies van de meeste effectors blijven grotendeels onbekend. Hier beschrijven we in detail een enigszins gewijzigde versie van de co-infiltratietest die kan dienen als een algemene methode voor het observeren van RNA-uitschakeling en voor het karakteriseren van effector-eiwitten die worden afgescheiden door plantaardige pathogenen. De belangrijkste stappen van de aanpak zijn het kiezen van de gezonde en volledig ontwikkelde bladeren, het aanpassen van de bacteriecultuur aan de juiste optische dichtheid (OD) op 600 nm, en het observeren van groene fluorescerende eiwitten (GFP) fluorescentie op het optimale moment op de geïnfiltreerd bladeren om te voorkomen dat effectoren met een zwakke onderdrukkingsactiviteit worden weggenomen. Dit verbeterde protocol zal bijdragen aan een snelle, nauwkeurige en uitgebreide screening van RNA-uitschakelingssuppressors en dient als een uitstekend uitgangspunt voor het onderzoeken van de moleculaire functies van deze eiwitten.

Hierboven beschrijven we de stapsgewijze procedure voor een verbeterde screening test voor het beoordelen van de RSS-activiteit van P. sojae RxLR effectors. In totaal duurt het experiment 5−6 weken. Vervolgens kunnen de RSS'en die door de test worden geïdentificeerd, verder worden gekarakteriseerd in termen van functie en moleculair mechanisme. Als voorbeeld van onze aanpak gebruikten we de P. sojae RxLR effecto Phytophthora suppressor van RNA silencing 1 (PSR1), die ...

Watch this Scientific Journal Video about Screening and Identification of RNA Silencing Suppressors from Secreted Effectors of Plant Pathogens at JoVE.com

Screening and Identification of RNA Silencing Suppressors from Secreted Effectors of Plant Pathogens

Hier presenteren we een aangepaste screeningmethode die uitgebreid kan worden gebruikt om RNA-uitschakelingssuppressors in plantenpathogenen snel te screenen.

Screening en identificatie van RNA Silencing Suppressors van secreted effectors of Plant Pathogens

RNA silencing is an evolutionarily conserved, sequence-specific gene regulation mechanism in eukaryotes. Several plant pathogens have evolved proteins ...

Deze methode kan helpen om belangrijke vragen te beantwoorden over het screenen van de RNA-onderdrukkingsonderdrukkingen die worden afgescheiden door plantenpathogenen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is het bieden van een snelle, nauwkeurige en uitgebreide screening test voor RNA silencing suppressors identificatie. Bereid potgrondmengsels voor bestaande uit 50%veenmos, 30% perliet en 20% vermiculiet en autoclave bij 120 graden Celsius gedurende 20 minuten.Week de autoclaved grond mengt met plantaardige meststof oplossing op een gram per liter en subpackage ze in kleinere potten opgeslagen in een grotere lade. Zaai een of twee zaden van Nicotiana bethamiana 16c op het bodemoppervlak van elke pot. Bedek de lade met een plastic koepel en laat de zaden ontkiemen.Plaats de lade onder licht- en temperatuurgecontroleerde groeikamers met een temperatuur van 23 tot 25 graden Celsius, 50 tot 60% relatieve vochtigheid en een lange dag fotoperiode. Na drie tot vier dagen ontkiemen de zaden. Neem de plastic koepel uit en laat de zaailingen groeien onder dezelfde omstandigheden die worden gebruikt voor de kiemstap.Om de twee tot drie dagen, voeg een passende hoeveelheid water houden van de bodem vochtig, maar niet weken. Elke 10 dagen, voeg kunstmest toe om verdere groei te bevorderen. Onderhoud Nicotiana bethamiana 16c planten onder normale omstandigheden totdat de planten ten minste vijf volledig ontwikkelde echte bladeren hebben zonder zichtbare oksel of bloemknoppen en de bladeren hebben een gezonde groene uitstraling.Gebruik 10 tot 14-dagen oude Nicotiana bethamiana 16c planten voor systemische RNA silencing assays en drie tot vier weken oude bladeren van Nicotiana bethamiana 16c voor lokale RNA silencing assays. Gebruik een tip om een positieve kolonie uit de LB-plaat te halen en inenting van de cellen in een glazen buis met vijf milliliter LB-medium aangevuld met 50 microgram per milliliter Kanamycine en 50 microgram per milliliter Rifampicin. Laat de cellen groeien op 30 graden Celsius met schudden bij 200 RPM gedurende 24 tot 48 uur.Breng 100 microliter van de cultuur over in vijf milliliter LB-medium aangevuld met dezelfde antibiotica, 10 millimolar MES bij pH 5.6 en 20 micromolar AS. Laat de bacteriën groeien op 30 graden Celsius met schudden op 200 RPM gedurende 16 tot 20 uur. Centrifugeren de cellen op 4,000 keer g gedurende 10 minuten. Gooi de supernatant weg en verleg de pellet in twee milliliter van 10 millimolar magnesiumchloridebuffer.Herhaal de was om de volledige verwijdering van antibiotica te garanderen. Bepaal de dichtheid van de Agrobacteriumcultuur door de optische dichtheid op 600 nanometer te meten. Pas de celkweek aan met een magnesiumchloridebuffer van 10 millimolar op een OD 600 van 1,5 tot 2,0.Voeg 10 millimolar MES bij pH 5.6 en 150 micromolar AS toe aan de uiteindelijke suspensiecultuur en broed de cellen bij kamertemperatuur minstens drie uur zonder te schudden. Meng gelijke volumes van een Agrobacteriumcultuur die 35S groen fluorescerend eiwit bevat met een Agrobacteriumcultuur die 35S komkommermozaïekvirusonderdrukker 2b, putative effector of lege vector bevat. Met behulp van een een milliliter naaldloze spuit, zorgvuldig en langzaam infiltreren in de gemengde Agrobacterium suspensies aan de abaxiale zijden van Nicotiana bethamiana 16c bladeren.Verwijder de resterende bacteriële suspensie van de bladeren met zachte weefseldoekjes en omcirkel de marges van de geïnfiltreerde patches met een markerpen. Drie tot vier dagen na infiltratie, gebruik maken van een lange golf ultraviolette lamp om visueel te detecteren GFP fluorescentie in de geïnfiltreerde patches van bladeren. Twee weken na infiltratie, gebruik de lamp om nieuw geteelde bladeren van de hele plant te detecteren voor systemische RNA-uitschakeling.Om het totale RNA van het bladweefsel te isoleren op vier tot zeven dagen na infiltratie, verzamel de bladweefsels van de geïnfiltreerde Nicotiana bethamiana 16c patches in een mortier. Plaats vloeibare stikstof in de mortel en maal het weefsel in een fijn poeder met een slijpstaaf en breng het poeder over naar een steriele twee milliliter buis. Voeg onmiddellijk het RNA isolatiereagens toe bij het volume van één milliliter per 100 milligram weefsel aan de monsterbuis in een kap, vortex krachtig om te homogeneren en vijf minuten lang bij kamertemperatuur uit te broeden.Voeg chloroform toe bij het volume van 200 microliter per één milliliter RNA-isolatiereagens aan elke buis in de kap, schud krachtig gedurende 15 seconden en broed vijf minuten bij kamertemperatuur. Centrifugeer het homogenaat op 12.000 keer g gedurende 15 minuten bij vier graden Celsius. Breng de supernatant in een nieuwe RNase-vrije buis en gooi de pellet weg.Voeg 0,7 volume isopropanol toe aan de supernatant, draai het mengsel voorzichtig meerdere keren om en broed het mengsel 10 minuten op kamertemperatuur uit. Precipitate de RNA pellet door centrifugatie op 12,000 keer g gedurende 15 minuten bij vier graden Celsius. Gooi de supernatant weg.Was de pellet met 70% ethanol en droog de pellet in een kap. Los het RNA op in met diethyl pyrocarbonaat behandeld water door 10 tot 20 minuten in een waterbad van 65 graden Celsius uit te broeden. Om noordelijke blot-analyse van GFP messenger RNA-niveaus uit te voeren, bereidt u een 1,2% formaldehyde-denatureringsagarosegel voor in 1X MOPS-runbuffer.Meng het RNA een-op-een met RNA laden kleurstof en denatureren het RNA door incubatie op 65 graden Celsius gedurende 10 minuten. Onmiddellijk chill de gedenatureerde monsters op ijs voor een minuut. Laad met een pipet de monsters in de putten van de gel en elektroforens op 100 volt gedurende 50 minuten totdat het RNA goed gescheiden is.Spoel de gel in 20x zout natriumcitraatbuffer om de formaldehyde te verwijderen. Voer capillaire overdracht 's nachts door het opzetten van 20X zout natrium citraat buffer, een laag papieren handdoek, twee lagen natte Whatman papier, een laag gel, een laag nylon membraan, twee lagen nat Whatman papier, twee lagen droog Whatman papier, een glazen plaat, en een gewicht. In de ochtend wordt het RNA in de gel overgebracht naar het nylon membraan.Week het membraan in 2x zout natriumcitraat en bevestig het RNA aan het membraan door het natte membraan bloot te stellen aan UV-crosslinking. Ga verder volgens het manuscript. Volledig ontwikkelde bladeren van drie tot vier weken oude Nicotiana bethamiana 16c planten werden mede-geïnfiltreerd in patches met Agrobacterium mengsels die 35S GFP.Op vier dagen na infiltratie, GFP fluorescentie van het geïnfiltreerde gebied werd afgebeeld onder natuurlijk licht en lange golf UV-licht. Noordelijke vlek bleek dat GFP messenger RNA hoger geaccumuleerd in de bladeren uitdrukken 35S GFP plus 35S CMV2b of 35S GFP plus 35S PSR1 dan in de bladeren uitdrukken 35S GFP plus EV. Agroinfiltratie test werd uitgevoerd om de verspreiding van het geluiddempende signaal in de bladeren van twee weken oude Nicotiana bethamiana 16c zaailingen te evalueren. Na 14 dagen na infiltratie vertoonde meer dan 98% van de EV geen duidelijke GFP-signalering in systemische bladeren.Terwijl zowel CMV2b als PSR1 de systemische verspreiding van het geluiddemende signaal efficiënt remden. GFP fluorescentie werd waargenomen in ongeveer 80% van de co-geïnfiltreerde planten en in de resterende 20% van de geïnfiltreerde planten met slechts een paar rode aderen verscheen in nieuw opgedoken bladeren. Deze techniek maakt de weg vrij voor onderzoekers om nieuwe RNA-onderdrukkingsonderdrukkingsonderdrukkers te identificeren die door veel plantenpathogenen worden afgescheiden.De combinatie van planten en de juiste OD is het belangrijkste om te onthouden bij een poging deze procedure. Na deze procedure kan de functionele karakterisering van de RNA-onderdrukkingsonderdrukker worden gedaan om het mechanisme te onderzoeken van hoe deze suppressors op de hostRNA-uitschakeling drukken en wat de output is. Draag de veiligheidsbril wanneer u planten infiltreert en draag ook de latex handschoenen tijdens alle experimentstappen.

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetic Manipulation of the Plant Pathogen Ustilago maydis to Study Fungal Biology and Plant Microbe Interactions

Genetic Manipulation of the Plant Pathogen Ustilago maydis to Study Fungal Biology and Plant Microbe Interactions

Genetische Manipulatie van de Plant Pathogeen<em&gt; Ustilago maydis</em&gt; Om Fungal Biology and Plant Microbe Interactions Studie

Gene deletion plays an important role in the analysis of gene function. One of the most efficient methods to disrupt genes in a targeted manner is the ...

Mapping RNA-RNA Interactions Globally Using Biotinylated Psoralen

Knowing how RNAs interact with themselves and with others is key to understanding RNA based gene regulation in the cell. While examples of RNA-RNA ...

Assessment of DNA Contamination in RNA Samples Based on Ribosomal DNA

Beoordeling van DNA besmetting in RNA Samples gebaseerd op Ribosomal DNA

One method extensively used for the quantification of gene expression changes and transcript abundances is reverse-transcription quantitative real-time ...

Purification of High Molecular Weight Genomic DNA from Powdery Mildew for Long-Read Sequencing

Zuivering van hoog molecuulgewicht Genomic DNA van echte meeldauw voor Long-Read Sequencing

The powdery mildew fungi are a group of economically important fungal plant pathogens. Relatively little is known about the molecular biology and genetics ...

RNA Pull-down Procedure to Identify RNA Targets of a Long Non-coding RNA

RNA Pull-down te identificeren van RNA doelen van een lang niet-coderende RNA Procedure

Long non-coding RNA (lncRNA), which are sequences of more than 200 nucleotides without a defined reading frame, belong to the regulatory non-coding ...

Exploring the Root Microbiome: Extracting Bacterial Community Data from the Soil, Rhizosphere, and Root Endosphere

Verkennen van de wortel Microbiome: extraheren van gegevens van de bacteriële Gemeenschap uit de bodem, de rhizosfeer, en de wortel Endosphere

The intimate interaction between plant host and associated microorganisms is crucial in determining plant fitness, and can foster improved tolerance to ...

Generation of Cancer Cell Clones to Visualize Telomeric Repeat-containing RNA TERRA Expressed from a Single Telomere in Living Cells

Generatie van kanker cel klonen te visualiseren Telomere Repeat-bevattende RNA TERRA uitgedrukt uit een enkele Telomere in levende cellen

Telomeres are transcribed, giving rise to telomeric repeat-containing long noncoding RNAs (TERRA), which have been proposed to play important roles in ...

Identification of Footprints of RNA:Protein Complexes via RNA Immunoprecipitation in Tandem Followed by Sequencing (RIPiT-Seq)

Identification of Footprints of RNA:Protein Complexes via RNA Immunoprecipitation in Tandem Followed by Sequencing RIPiT-Seq

Identificatie van voetafdrukken van RNA: eiwitcomplexen via RNA-immunoprecipitatie in tandem gevolgd door sequencing (RIPiT-SEQ)

RNA immunoprecipitation in tandem (RIPiT) is a method for enriching RNA footprints of a pair of proteins within an RNA:protein (RNP) complex. RIPiT ...

Identification of Circular RNAs using RNA Sequencing

Identificatie van circulaire Rna's met RNA-sequencing

Circular RNAs (circRNAs) are a class of non-coding RNAs involved in functions including micro-RNA (miRNA) regulation, mediation of protein-protein ...

A FACS-based Protocol to Isolate RNA from the Secondary Cells of Drosophila Male Accessory Glands

A FACS-based Protocol to Isolate RNA from the Secondary Cells of Drosophila Male Accessory Glands

Een op FACS gebaseerd protocol om RNA te isoleren van de secundaire cellen van de mannelijke Accessoireklieren van Drosophila

To understand the function of an organ, it is often useful to understand the role of its constituent cell populations. Unfortunately, the rarity of ...