Name: screening and identification of rna silencing suppressors from secreted effectors of plant pathogens
Uploaded: 2020-02-03T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Screening and Identification of RNA Silencing Suppressors from Secreted Effectors of Plant Pathogens at JoVE.com

Ce travail a été soutenu par des subventions du « Programme Shuguang » de la Shanghai Education Development Foundation et de la Shanghai Municipal Education Commission, le National Key Research and Development Program of China National Key R-D Program of China ( 2018YFD0201500), la National Natural Science Foundation of China (no. 31571696 et 31660510), le Programme des Mille Talents pour les Jeunes Professionnels de Chine et la Commission des sciences et de la technologie de la municipalité de Shanghai (18DZ22660500).

REMARQUE : Toutes les étapes de la procédure doivent être effectuées à température ambiante (RT).
CAUTION: Déposer tous les supports contenant des microbes pathogènes, ainsi que les plantes et les tissus végétaux utilisés dans l'analyse, dans les conteneurs de déchets appropriés et autoclave avant de jeter.
1. Préparation de constructions plasmides contenant des effecteurs putatifs
<ol><li>Sélectionnez les effecteurs sécrétés putatifs qui sont fo...

<ol>
	<li>Waterfield, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Virulence+Annotation+(RVA):+identification+of+virulence+factors+using+a+bacterial+genome+library+and+multiple+invertebrate+hosts.">Rapid Virulence Annotation (RVA): identification of virulence factors using a bacterial genome library and multiple invertebrate hosts.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (41), 15967-15972 (2008).</li><li>Rovenich, H., Boshoven, J. C., Thomma, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Filamentous+pathogen+effector+functions:+of+pathogens,+hosts+and+microbiomes.">Filamentous pathogen effector functions: of pathogens, hosts and microbiomes.</a> Current Opinion in Plant Biology. 20, 96-103 (2014).</li><li>Varden, F. A., De la Concepcion, J. C., Maidment, J. H., Banfield, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Taking+the+stage:+effectors+in+the+spotlight.">Taking the stage: effectors in the spotlight.</a> Current Opinion in Plant Biology. 38, 25-33 (2017).</li><li>Lee, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+Pseudomonas+syringae+Type+III+Secreted+Effector+Function+via+a+Yeast+Genomic+Screen.">Identifying Pseudomonas syringae Type III Secreted Effector Function via a Yeast Genomic Screen.</a> G3: Genes, Genomes, Genetics. 9 (2), 535-547 (2019).</li><li>Toruno, T. Y., Stergiopoulos, I., Coaker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant-Pathogen+Effectors:+Cellular+Probes+Interfering+with+Plant+Defenses+in+Spatial+and+Temporal+Manners.">Plant-Pathogen Effectors: Cellular Probes Interfering with Plant Defenses in Spatial and Temporal Manners.</a> Annual Review of Phytopathology. 54, 419-441 (2016).</li><li>Baulcombe, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+silencing+in+plants.">RNA silencing in plants.</a> Nature. 431 (7006), 356-363 (2004).</li><li>Pumplin, N., Voinnet, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+silencing+suppression+by+plant+pathogens:+defence,+counter-defence+and+counter-counter-defence.">RNA silencing suppression by plant pathogens: defence, counter-defence and counter-counter-defence.</a> Nature Reviews Microbiology. 11 (11), 745-760 (2013).</li><li>Csorba, T., Kontra, L., Burgyan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+silencing+suppressors:+Tools+forged+to+fine-tune+host-pathogen+coexistence.">Viral silencing suppressors: Tools forged to fine-tune host-pathogen coexistence.</a> Virology. 479-480, 85-103 (2015).</li><li>Johansen, L. K., Carrington, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silencing+on+the+spot.+Induction+and+suppression+of+RNA+silencing+in+the+Agrobacterium-mediated+transient+expression+system.">Silencing on the spot. Induction and suppression of RNA silencing in the Agrobacterium-mediated transient expression system.</a> Plant Physiology. 126 (3), 930-938 (2001).</li><li>Powers, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+assay+for+the+identification+of+RNA+silencing+suppressors+based+on+complementation+of+viral+movement.">A versatile assay for the identification of RNA silencing suppressors based on complementation of viral movement.</a> Molecular Plant-Microbe Interactions. 21 (7), 879-890 (2008).</li><li>Voinnet, O., Lederer, C., Baulcombe, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+viral+movement+protein+prevents+spread+of+the+gene+silencing+signal+in+Nicotiana+benthamiana.">A viral movement protein prevents spread of the gene silencing signal in Nicotiana benthamiana.</a> Cell. 103 (1), 157-167 (2000).</li><li>Deleris, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hierarchical+action+and+inhibition+of+plant+Dicer-like+proteins+in+antiviral+defense.">Hierarchical action and inhibition of plant Dicer-like proteins in antiviral defense.</a> Science. 313 (5783), 68-71 (2006).</li><li>Li, W. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferon+antagonist+proteins+of+influenza+and+vaccinia+viruses+are+suppressors+of+RNA+silencing.">Interferon antagonist proteins of influenza and vaccinia viruses are suppressors of RNA silencing.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (5), 1350-1355 (2004).</li><li>Navarro, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+plant+miRNA+contributes+to+antibacterial+resistance+by+repressing+auxin+signaling.">A plant miRNA contributes to antibacterial resistance by repressing auxin signaling.</a> Science. 312 (5772), 436-439 (2006).</li><li>Qiao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oomycete+pathogens+encode+RNA+silencing+suppressors.">Oomycete pathogens encode RNA silencing suppressors.</a> Nature Genetics. 45 (3), 330-333 (2013).</li><li>Yin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+fungal+effector+from+Puccinia+graminis+suppressing+RNA+silencing+and+plant+defense+responses.">A novel fungal effector from Puccinia graminis suppressing RNA silencing and plant defense responses.</a> New Phytologist. 222 (3), 1561-1572 (2019).</li><li>Zhang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+WY+domain+in+the+Phytophthora+effector+PSR1+is+required+for+infection+and+RNA+silencing+suppression+activity.">The WY domain in the Phytophthora effector PSR1 is required for infection and RNA silencing suppression activity.</a> New Phytologist. 223 (2), 839-852 (2019).</li><li>Petersen, T. N., Brunak, S., von Heijne, G., Nielsen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SignalP+4.0:+discriminating+signal+peptides+from+transmembrane+regions.">SignalP 4.0: discriminating signal peptides from transmembrane regions.</a> Nature Methods. 8 (10), 785-786 (2011).</li><li>Earley, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gateway-compatible+vectors+for+plant+functional+genomics+and+proteomics.">Gateway-compatible vectors for plant functional genomics and proteomics.</a> Plant Journal. 45 (4), 616-629 (2006).</li><li>Woodman, M. E., Savage, C. R., Arnold, W. K., Stevenson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+PCR+of+Intact+Bacteria+(Colony+PCR).">Direct PCR of Intact Bacteria (Colony PCR).</a> Current Protocols in Microbiology. 42 (1), 1-7 (2016).</li><li>Cao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+an+RNA+silencing+suppressor+from+a+plant+double-stranded+RNA+virus.">Identification of an RNA silencing suppressor from a plant double-stranded RNA virus.</a> Journal of Virology. 79 (20), 13018-13027 (2005).</li><li>Burgyan, J., Havelda, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+suppressors+of+RNA+silencing.">Viral suppressors of RNA silencing.</a> Trends in Plant Science. 16 (5), 265-272 (2011).</li><li>Incarbone, M., Dunoyer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+silencing+and+its+suppression:+novel+insights+from+in+planta+analyses.">RNA silencing and its suppression: novel insights from in planta analyses.</a> Trends in Plant Science. 18 (7), 382-392 (2013).</li><li>Martinez-Priego, L., Donaire, L., Barajas, D., Llave, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silencing+suppressor+activity+of+the+Tobacco+rattle+virus-encoded+16-kDa+protein+and+interference+with+endogenous+small+RNA-guided+regulatory+pathways.">Silencing suppressor activity of the Tobacco rattle virus-encoded 16-kDa protein and interference with endogenous small RNA-guided regulatory pathways.</a> Virology. 376 (2), 346-356 (2008).</li></ol>

Le silençage de l'ARN est un mécanisme de défense clé utilisé par les plantes pour lutter contre les agents pathogènes viraux, bactériens, oomycètes et fongiques. À leur tour, ces microbes ont évolué des protéines suppressrices de silençage pour contrecarrer le silençage antiviral, et ces RSS interfèrent avec différentes étapes de la voie de silençage de l'ARN22,23. Plusieurs tests de dépistage ont été élaborés pour identifier les RSS<sup c...

Au cours des deux dernières décennies, l'accélération du séquençage du génome des micro-organismes qui causent les maladies des plantes a conduit à un écart de connaissances de plus en plus important entre l'information sur la séquence et les fonctions biologiques des protéines codées1. Parmi les molécules révélées par les projets de séquençage sont des molécules effectrices qui suppriment l'immunité innée et facilitent la colonisation de l'hôte; ces facteurs sont sécrétés par des agents pathogènes végétaux destructeurs, y compris les bactéries, les nématodes et les microbes filamenteux. Pour répondre à ces menaces, les plantes hôtes ont développé de nouveaux récepteurs qui reconnaissent ces effecteurs, permettant la restauration de la réponse immunitaire. Par conséquent, les effecteurs sont soumis à diverses pressions sélectives, ce qui conduit à la diversification des répertoires effecteurs parmi les lignées pathogènes2. Ces dernières années, il a été démontré que les effecteurs putatifs des pathogènes végétaux perturbent l'immunité innée des plantes en empêchant les processus cellulaires de l'hôte de bénéficier aux microbes de diverses façons, y compris la dysrégulation des voies de signalisation, la transcription, le transport intracellulaire, la stabilité du cytosquelette, le trafic de vésicules et le silençage de l'ARN3,4,5. Cependant, la grande majorité des effecteurs pathogènes, en particulier ceux des agents pathogènes filamenteux, sont restés énigmatiques.
Le silençage de l'ARN est une machinerie d'inactivation génique médiée par l'homologie qui est conservée chez les eucaryotes. Le processus est déclenché par de longs ARN à double brin (dsRNA) et cible l'ARN homologue à brin unique (ARS) d'une manière spécifique à la séquence, et il manipule un large éventail de processus biologiques, y compris la défense antivirale6. Pour surmonter les réponses immunitaires innées de l'hôte, certains virus ont évolué pour compenser le silençage de l'ARN, y compris la capacité de se répliquer à l'intérieur des compartiments intracellulaires ou de s'échapper du signal réorganisé au silençage. Néanmoins, la stratégie la plus générale par laquelle les virus protègent leurs génomes contre la perte dépendante du silençage de l'ARN de la fonction génique est d'encoder des protéines spécifiques qui suppriment le silençage de l'ARN7,8. Plusieurs approches mécanistes différentes ont été établies pour dépister et caractériser les suppresseurs viraux du silençage de l'ARN (RsS), y compris la co-infiltration des cultures tumefaciens Agrobacterium, les plantes transgéniques exprimant les suppresseurs putatifs, la greffe et la culture cellulaire9,10,11,12,13.
Chacun de ces essais présente des avantages et des inconvénients et identifie les RsV de façon distincte. L'une des approches les plus courantes est basée sur la co-infiltration de cultures individuelles A. tmuefaciens hébergeant la protéine virale potentielle et un gène reporter (protéine fluorescente typiquement verte [GFP]) sur les plantes Nicotiana benthamiana 16c exprimant constitutivement GFP sous le contrôle du virus de la mosaïque du chou-fleur 35S promoteur. En l'absence d'un suppresseur de silençage viral actif, le GFP est identifié comme exogène par les cellules hôtes et est réduit au silence dans les 3 jours suivant l'infiltration (dpi). En revanche, si la protéine virale possède une activité de suppression, le niveau d'expression du GFP reste stable au-delà de 3 à 9 dpi9. Ce test de co-infiltration est simple et rapide; cependant, il n'est ni très stable ni sensible. Néanmoins, l'assay a identifié de nombreux RsV avec diverses séquences et structures de protéines dans de nombreux virus de l'ARN7,8.
Récemment, plusieurs protéines effectrices qui peuvent inhiber l'activité de silençage de l'ARN cellulaire ont été caractérisées par des pathogènes bactériens, oomycètes et plantes fongiques14,15,16. Ces résultats impliquent que la suppression de silençage d'ARN est une stratégie commune pour faciliter l'infection qui est employée par des agents pathogènes dans la plupart des royaumes. En théorie, beaucoup, sinon tous, des effecteurs pourraient encoder suppresseurs de silençage d'ARN (RSSs); à ce jour, cependant, seuls quelques-uns ont été identifiés, principalement en raison de la pénurie de la stratégie de dépistage fiable et générale. En outre, les suppresseurs du silençage d'ARN n'ont pas été étudiés dans la grande majorité des pathogènes végétaux17.
Dans ce rapport, nous présentons un protocole optimisé et général pour identifier les effecteurs d'agents pathogènes végétaux qui peuvent supprimer le silençage local et systémique d'ARN utilisant l'analyse d'agro-infiltration. L'objectif principal de cette étude était de mettre l'accent sur les aspects clés du protocole et de décrire les étapes en détail, fournissant ainsi un test de dépistage qui convient à presque tous les effecteurs d'agents pathogènes végétaux.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-Morpholinoethanesulfonic Acid (MES)</td>
			<td>Biofroxx</td>
			<td>1086GR500</td>
			<td>Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2xTaq Master Mix</td>
			<td>Vazyme Biotech</td>
			<td>P112-AA</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-(N-morpholino) propanesulfonic acid (MOPS)</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0264C507-1KG</td>
			<td>MOPS Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetosyringone (AS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D134406-5G</td>
			<td>Induction of Agrobacterium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A1296-1KG</td>
			<td>LB medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Biofroxx</td>
			<td>1110GR100</td>
			<td>Electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amersham Hybond -N+</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>RPN303 B</td>
			<td>Nothern blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amersham Imager</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>Amersham Imager 600</td>
			<td>Image</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Tryptone</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>211705</td>
			<td>LB medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Yeast Extraction</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>212750</td>
			<td>LB medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>D5100</td>
			<td>Photography</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChemiDoc MP Imaging System</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemiluminescent detection module component of dafa kits</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>89880</td>
			<td>Luminescence detection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0230-100G</td>
			<td>Antibiotics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ClonExpress II One Step Cloning Kit</td>
			<td>Vazyme Biotech</td>
			<td>C112-01</td>
			<td>Ligation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DIG Easy Hyb</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>11603558001</td>
			<td>Hybridization buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Easypure Plasmid Miniprep kit</td>
			<td>TransGen Biotech</td>
			<td>EM101-02</td>
			<td>Plasmid Extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasyPure Quick Gel Extraction Kit</td>
			<td>TransGen Biotech</td>
			<td>EG101-02</td>
			<td>Gel Extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA disodium salt dihydrate</td>
			<td>Amresco/VWR</td>
			<td>0105-1KG</td>
			<td>MOPS Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophoresis Power Supply</td>
			<td>LiuYi</td>
			<td>DYY6D</td>
			<td>Nucleic acid electrophoresis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FastDigest EcoRV</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>FD0304</td>
			<td>Vector digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Image System</td>
			<td>Tanon</td>
			<td>Tanon3500</td>
			<td>Image</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamycin</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0304-5G</td>
			<td>Antibiotics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin Sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>K1914</td>
			<td>Antibiotics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LR Clonase II enzyme</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11791020</td>
			<td>LR reaction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulose Blotting membrane 0.45um</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>10600002</td>
			<td>Northern</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NORTH2south biotin random prime dna labeling kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17075</td>
			<td>Biotin labeling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR Thermal Cyclers</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>T100</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peat moss</td>
			<td>PINDSTRUP</td>
			<td>Dark Gold + clay</td>
			<td>Plants</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peters Water-Soluble Fertilizer</td>
			<td>ICE</td>
			<td>Peter Professional 20-20-20</td>
			<td>Fertilizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase</td>
			<td>Vazyme Biotech</td>
			<td>P505-d1</td>
			<td>Enzyme</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rifampicin</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>219549005</td>
			<td>Antibiotics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA Gel Loading Dye (2X)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R0641</td>
			<td>RNA Gel Loading Dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Acetate Hydrate</td>
			<td>Amresco/VWR</td>
			<td>0530-1KG</td>
			<td>MOPS Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0241-10KG</td>
			<td>LB medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tri-Sodium citrate</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0101-1KG</td>
			<td>SSC Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizol Reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15596018</td>
			<td>RNA isolation reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV lamp</td>
			<td>Analytik Jena</td>
			<td>UVP B-100AP</td>
			<td>Observation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UVP Hybrilinker Oven</td>
			<td>Analytik Jena</td>
			<td>OV2000</td>
			<td>Northern</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

screening and identification of rna silencing suppressors from secreted effectors of plant pathogens

Le silençage de l'ARN est un mécanisme de régulation génétique spécifique à la séquence conservé par évolution chez les eucaryotes. Plusieurs pathogènes végétaux ont développé des protéines avec la capacité d'inhiber la voie de silençage de l'ARN de la plante hôte. À la différence des protéines d'effecteur de virus, seulement plusieurs protéines d'effectrice sécrétées ont montré la capacité de supprimer le silençage d'ARN dans les agents pathogènes bactériens, de oomycète, et de fongique, et les fonctions moléculaires de la plupart des effecteurs restent largement inconnues. Ici, nous décrivons en détail une version légèrement modifiée de l'assay de co-infiltration qui pourrait servir de méthode générale pour observer le silençage d'ARN et pour caractériser des protéines effectorssées par des pathogènes végétaux. Les étapes clés de l'approche sont le choix des feuilles saines et entièrement développées, l'ajustement de la culture bactérienne à la densité optique appropriée (OD) à 600 nm, et l'observation de la fluorescence des protéines fluorescentes vertes (GFP) au moment optimal sur l'infiltré pour éviter d'omettre les effecteurs ayant une faible activité de suppression. Ce protocole amélioré contribuera à un dépistage rapide, précis et étendu des suppresseurs de silençage de l'ARN et servira d'excellent point de départ pour étudier les fonctions moléculaires de ces protéines.

Ci-dessus, nous décrivons la procédure étape par étape pour un test de dépistage amélioré pour évaluer l'activité RSS des effecteurs P. sojae RxLR. Au total, l'expérience dure de 5 à 6 semaines. Par la suite, les RSS identifiés par l'analyse peuvent être caractérisés en termes de fonction et de mécanisme moléculaire. Comme exemple de notre approche, nous avons utilisé le P. sojae RxLR effecto Phytophthora suppresseur du silençage 1 (PSR1), qui est séc...

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Screening and Identification of RNA Silencing Suppressors from Secreted Effectors of Plant Pathogens

Ici, nous présentons une méthode de criblage modifiée qui peut être employée intensivement pour examiner rapidement des suppresseurs de silençage d'ARN dans les agents pathogènes de plante.

Dépistage et identification des suppresseurs de silençage de l'ARN des agents d'effets sécrétés des pathogènes végétaux

RNA silencing is an evolutionarily conserved, sequence-specific gene regulation mechanism in eukaryotes. Several plant pathogens have evolved proteins ...

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés sur la façon de filtrer les suppresseurs de silencing ARN sécrètent par des agents pathogènes végétaux. Le principal avantage de cette technique est de fournir un test de dépistage rapide, précis et étendu pour l’identification des suppresseurs de silencing ARN. Préparer des mélanges de terre en pot composés de 50 % de mousse de tourbe, de 30 % de perlite et de 20 % de vermiculite et d’autoclave à 120 degrés Celsius pendant 20 minutes.Faire tremper les mélanges de sol autoclavés avec la solution d’engrais végétal à un gramme par litre et les sous-emballage dans de plus petits pots stockés dans un plus grand plateau. Semer une ou deux graines de Nicotiana bethamiana 16c sur la surface du sol de chaque pot. Couvrir le plateau d’un dôme en plastique et laisser germer les graines.Placez le plateau sous des chambres de croissance légères et à température contrôlée avec une température de 23 à 25 degrés Celsius, une humidité relative de 50 à 60 % et une longue journée de photopériod. Après trois à quatre jours, les graines germent. Enlever le dôme en plastique et permettre aux semis de croître dans les mêmes conditions utilisées pour l’étape de germination.Tous les deux à trois jours, ajouter une quantité appropriée d’eau pour garder le sol humide, mais pas tremper. Tous les 10 jours, ajouter de l’engrais pour favoriser la croissance. Maintenir les plantes Nicotiana bethamiana 16c dans des conditions normales jusqu’à ce que les plantes aient au moins cinq vraies feuilles entièrement développées sans bourgeons axillaires ou floraux visibles et que les feuilles aient un aspect vert sain.Utilisez des plantes Nicotiana bethamiana 16c de 10 à 14 jours pour des analyses systémiques de silencing d’ARN et des feuilles de trois à quatre semaines de Nicotiana bethamiana 16c pour des analyses locales de silencing d’ARN. Utilisez une pointe pour choisir une colonie positive de la plaque LB et inoculer les cellules dans un tube de verre contenant cinq millilitres de LB moyen complété par 50 microgrammes par millilitre kanamycine et 50 microgrammes par millilitre Rifampicin. Faire croître les cellules à 30 degrés Celsius en secouant à 200 RPM pendant 24 à 48 heures.Transférer 100 microlitres de la culture en cinq millilitres de LB moyen complété par les mêmes antibiotiques, 10 millimilliles MES au pH 5,6, et 20 micromolaire AS. Faire croître la bactérie à 30 degrés Celsius en secouant à 200 RPM pendant 16 à 20 heures. Centrifuger les cellules à 4000 fois g pendant 10 minutes. Jetez le supernatant et resuspendez la pastille en deux millilitres de tampon de chlorure de magnésium de 10 millimaux.Répétez le lavage pour assurer l’élimination complète des antibiotiques. Déterminer la densité de la culture Agrobacterium en mesurant la densité optique à 600 nanomètres. Ajustez la culture cellulaire avec un tampon de chlorure de magnésium de 10 millimlaires à un OD 600 de 1,5 à 2,0.Ajouter 10 millimilliles MES au pH 5.6 et 150 micromolaires AS à la culture finale de suspension et incuber les cellules à température ambiante pendant au moins trois heures sans trembler. Mélanger des volumes égaux d’une culture Agrobacterium contenant 35S protéines fluorescentes vertes avec une culture Agrobacterium contenant 35S concombre mosaïque suppresseur de virus 2b, effecteur putatif ou vecteur vide. À l’aide d’une seringue sans aiguille d’un millilitre, infiltrez soigneusement et lentement les suspensions agrobactériennes mélangées sur les côtés abaxiaux des feuilles de Nicotiana bethamiana 16c.Retirez le reste de la suspension bactérienne des feuilles avec des lingettes de tissus mous et encerclez les marges des plaques infiltrées à l’aide d’un stylo marqueur. Trois à quatre jours après l’infiltration, utilisez une lampe ultraviolette à ondes longues pour détecter visuellement la fluorescence GFP dans les plaques infiltrées des feuilles. Deux semaines après l’infiltration, utilisez la lampe pour détecter les feuilles nouvellement cultivées de toute la plante pour le silencing systémique d’ARN.Pour isoler l’ARN total du tissu foliaire à quatre à sept jours après l’infiltration, recueillir les tissus foliaire des plaques nicotiana bethamiana 16c infiltrées dans un mortier. Placer l’azote liquide dans le mortier et moudre le tissu en poudre fine à l’aide d’une tige de broyage et transférer la poudre dans un tube stérile de deux millilitres. Ajouter immédiatement le réageni d’isolement de l’ARN au volume d’un millilitre par 100 milligrammes de tissu au tube de l’échantillon dans une hotte, vortex vigoureusement pour homogénéiser, et incuber à température ambiante pendant cinq minutes.Ajouter du chloroforme au volume de 200 microlitres par millilitre de réaccente d’isolement arn à chaque tube du capot, agiter vigoureusement pendant 15 secondes et incuber à température ambiante pendant cinq minutes. Centrifugeuse l’homogénéisation à 12 000 fois g pendant 15 minutes à 4 degrés Celsius. Transférer le supernatant dans un nouveau tube sans RNase et jeter la pastille.Ajouter 0,7 volume d’isopropanol au supernatant, inverser délicatement plusieurs fois et incuber le mélange à température ambiante pendant 10 minutes. Précipitez la pastille d’ARN par centrifugation à 12 000 fois g pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius. Jeter le surnatant.Laver la pastille avec 70% d’éthanol et sécher à l’air le granulé dans une hotte. Dissoudre l’ARN dans de l’eau traitée au pyrocarbonate de désyle en couveant dans un bain d’eau de 65 degrés Celsius pendant 10 à 20 minutes. Pour effectuer l’analyse de tache nordique des niveaux d’ARN messager de GFP, préparez un gel d’agarose de denarose de denaturing de formaldéhyde de 1X MOPS exécutant le tampon.Mélanger l’ARN en un à un avec le colorant de chargement de l’ARN et dénoaturer l’ARN par incubation à 65 degrés Celsius pendant 10 minutes. Réfrigérer immédiatement les échantillons dénaturés sur la glace pendant une minute. À l’aide d’une pipette, charger les échantillons dans les puits du gel et de l’électrophorese à 100 volts pendant 50 minutes jusqu’à ce que l’ARN soit bien séparé.Rincer le gel en tampon de citrate de sodium salin 20X pour enlever le formaldéhyde. Effectuez le transfert capillaire pendant la nuit en installant 20X tampon de citrate de sodium salin, une couche de papier essuie-tout, deux couches de papier Whatman humide, une couche de gel, une couche de membrane de nylon, deux couches de papier Whatman humide, deux couches de papier Whatman sec, une plaque de verre et un poids. Le matin, l’ARN dans le gel est transféré à la membrane de nylon.Tremper la membrane dans le citrate de sodium salin 2X et fixer l’ARN à la membrane en exposant la membrane humide à la liaison croisée UV. Procéder selon le manuscrit. Les feuilles entièrement développées des plantes nicotiana bethamiana 16c de trois à quatre semaines ont été co-infiltrées dans des parcelles avec des mélanges Agrobacterium transportant 35S GFP.À quatre jours après l’infiltration, la fluorescence GFP de la zone infiltrée a été photographiée sous la lumière naturelle et la lumière UV à ondes longues. La tache nordique a indiqué que l’ARN messager de GFP s’est accumulé plus haut dans les feuilles exprimant 35S GFP plus 35S CMV2b ou 35S GFP plus 35S PSR1 que dans les feuilles exprimant 35S GFP plus EV. L’analyse d’agroinfiltration a été effectuée pour évaluer la propagation du signal de silence dans les feuilles des semis nicotiana bethamiana 16c de deux semaines. À 14 jours après infiltration, plus de 98% de l’EV n’a montré aucune signalisation évidente de GFP dans les feuilles systémiques.Considérant que cmv2b et PSR1 ont efficacement inhibé la propagation systémique du signal de silence. La fluorescence du GFP a été observée dans environ 80 % des plantes co-infiltrées et dans les 20 % restants des plantes infiltrées avec seulement quelques veines rouges apparues dans les feuilles nouvellement émergées. Cette technique ouvre la voie aux chercheurs pour identifier de nouveaux suppresseurs de silencing d’ARN sécrés par beaucoup d’agents pathogènes végétaux.La combinaison des plantes et de l’OD approprié est la chose la plus importante à retenir lors de la tentative de cette procédure. Après cette procédure, la caractérisation fonctionnelle du suppresseur de silence ARN peut être faite pour explorer le mécanisme de la façon dont ces suppresseurs appuient sur le silence de l’ARN hôte et quelle est la sortie. S’il vous plaît porter les lunettes de sécurité lorsque vous infiltrez les plantes et aussi porter les gants de latex pendant toutes les étapes de l’expérience.

Research

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