Name: screening and identification of rna silencing suppressors from secreted effectors of plant pathogens
Uploaded: 2020-02-03T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Screening and Identification of RNA Silencing Suppressors from Secreted Effectors of Plant Pathogens at JoVE.com

Diese Arbeit wurde durch Stipendien des "Shuguang Program" der Shanghai Education Development Foundation und der Shanghai Municipal Education Commission, des National Key Research and Development Program of China National Key R&D Program of China ( 2018YFD0201500), die National Natural Science Foundation of China (Nr. 31571696 und 31660510), das Thousand Talents Program for Young Professionals of China und die Science and Technology Commission of Shanghai Municipality (18DZ2260500).

HINWEIS: Alle Schritte des Verfahrens sollten bei Raumtemperatur (RT) durchgeführt werden.
VORSICHT: Legen Sie alle Medien, die pathogene Mikroben enthalten, sowie die pflanzen- und pflanzengewebe, die im Test verwendet werden, in die entsprechenden Abfallbehälter und Autoklaven ein, bevor Sie sie entsorgen.
1. Herstellung von Plasmidkonstrukten, die vermeintliche Effektoren enthalten
<ol><li>Wählen Sie vermeintlich eftare resezernierte Effektoren, die während...

<ol>
	<li>Waterfield, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Virulence+Annotation+(RVA):+identification+of+virulence+factors+using+a+bacterial+genome+library+and+multiple+invertebrate+hosts.">Rapid Virulence Annotation (RVA): identification of virulence factors using a bacterial genome library and multiple invertebrate hosts.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (41), 15967-15972 (2008).</li><li>Rovenich, H., Boshoven, J. C., Thomma, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Filamentous+pathogen+effector+functions:+of+pathogens,+hosts+and+microbiomes.">Filamentous pathogen effector functions: of pathogens, hosts and microbiomes.</a> Current Opinion in Plant Biology. 20, 96-103 (2014).</li><li>Varden, F. A., De la Concepcion, J. C., Maidment, J. H., Banfield, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Taking+the+stage:+effectors+in+the+spotlight.">Taking the stage: effectors in the spotlight.</a> Current Opinion in Plant Biology. 38, 25-33 (2017).</li><li>Lee, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+Pseudomonas+syringae+Type+III+Secreted+Effector+Function+via+a+Yeast+Genomic+Screen.">Identifying Pseudomonas syringae Type III Secreted Effector Function via a Yeast Genomic Screen.</a> G3: Genes, Genomes, Genetics. 9 (2), 535-547 (2019).</li><li>Toruno, T. 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X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferon+antagonist+proteins+of+influenza+and+vaccinia+viruses+are+suppressors+of+RNA+silencing.">Interferon antagonist proteins of influenza and vaccinia viruses are suppressors of RNA silencing.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (5), 1350-1355 (2004).</li><li>Navarro, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+plant+miRNA+contributes+to+antibacterial+resistance+by+repressing+auxin+signaling.">A plant miRNA contributes to antibacterial resistance by repressing auxin signaling.</a> Science. 312 (5772), 436-439 (2006).</li><li>Qiao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oomycete+pathogens+encode+RNA+silencing+suppressors.">Oomycete pathogens encode RNA silencing suppressors.</a> Nature Genetics. 45 (3), 330-333 (2013).</li><li>Yin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+fungal+effector+from+Puccinia+graminis+suppressing+RNA+silencing+and+plant+defense+responses.">A novel fungal effector from Puccinia graminis suppressing RNA silencing and plant defense responses.</a> New Phytologist. 222 (3), 1561-1572 (2019).</li><li>Zhang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+WY+domain+in+the+Phytophthora+effector+PSR1+is+required+for+infection+and+RNA+silencing+suppression+activity.">The WY domain in the Phytophthora effector PSR1 is required for infection and RNA silencing suppression activity.</a> New Phytologist. 223 (2), 839-852 (2019).</li><li>Petersen, T. N., Brunak, S., von Heijne, G., Nielsen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SignalP+4.0:+discriminating+signal+peptides+from+transmembrane+regions.">SignalP 4.0: discriminating signal peptides from transmembrane regions.</a> Nature Methods. 8 (10), 785-786 (2011).</li><li>Earley, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gateway-compatible+vectors+for+plant+functional+genomics+and+proteomics.">Gateway-compatible vectors for plant functional genomics and proteomics.</a> Plant Journal. 45 (4), 616-629 (2006).</li><li>Woodman, M. E., Savage, C. R., Arnold, W. K., Stevenson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+PCR+of+Intact+Bacteria+(Colony+PCR).">Direct PCR of Intact Bacteria (Colony PCR).</a> Current Protocols in Microbiology. 42 (1), 1-7 (2016).</li><li>Cao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+an+RNA+silencing+suppressor+from+a+plant+double-stranded+RNA+virus.">Identification of an RNA silencing suppressor from a plant double-stranded RNA virus.</a> Journal of Virology. 79 (20), 13018-13027 (2005).</li><li>Burgyan, J., Havelda, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+suppressors+of+RNA+silencing.">Viral suppressors of RNA silencing.</a> Trends in Plant Science. 16 (5), 265-272 (2011).</li><li>Incarbone, M., Dunoyer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+silencing+and+its+suppression:+novel+insights+from+in+planta+analyses.">RNA silencing and its suppression: novel insights from in planta analyses.</a> Trends in Plant Science. 18 (7), 382-392 (2013).</li><li>Martinez-Priego, L., Donaire, L., Barajas, D., Llave, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silencing+suppressor+activity+of+the+Tobacco+rattle+virus-encoded+16-kDa+protein+and+interference+with+endogenous+small+RNA-guided+regulatory+pathways.">Silencing suppressor activity of the Tobacco rattle virus-encoded 16-kDa protein and interference with endogenous small RNA-guided regulatory pathways.</a> Virology. 376 (2), 346-356 (2008).</li></ol>

RNA-Silencing ist ein wichtiger Abwehrmechanismus, der von Pflanzen eingesetzt wird, um virale, bakterielle, Oomycete- und Pilzkrankheitserreger zu bekämpfen. Im Gegenzug haben diese Mikroben Silencing-Suppressor-Proteine entwickelt, um antiviralen Silencing entgegenzuwirken, und diese RSS stören verschiedene Schritte des RNA-Silencing-Signalwegs22,23. Zur Identifizierung von RSSs10wurden mehrere Screening-Assays entwickelt.
<p class...

In den letzten zwei Jahrzehnten hat die Beschleunigung der Genomsequenzierung von Mikroorganismen, die Pflanzenkrankheiten verursachen, zu einer immer größeren Wissenslücke zwischen Sequenzinformationen und den biologischen Funktionen kodierter Proteinegeführt 1. Unter den Molekülen, die durch Sequenzierungsprojekte enthüllt werden, sind Effektormoleküle, die angeborene Immunität unterdrücken und die Wirtskolonisierung erleichtern; diese Faktoren werden durch zerstörerische Pflanzenpathogene, einschließlich Bakterien, Nematoden und fadenförmige Mikroben, abgesondert. Um auf diese Bedrohungen zu reagieren, haben Wirtspflanzen neuartige Rezeptoren entwickelt, die diese Effektoren erkennen und die Wiederherstellung der Immunantwort ermöglichen. Daher unterliegen Effektoren verschiedenen selektiven Drücken, was zu einer Diversifizierung des Effektorrepertoires zwischen pathogenen Linien2führt. In den letzten Jahren haben vermeintliche Effektoren von Pflanzenpathogenen gezeigt, dass sie die angeborene Pflanzenimmunität stören, indem sie die zellulären Wirtsprozesse behindern, um den Mikroben auf verschiedene Weise zu nützen, einschließlich Dysregulation von Signalwegen, Transkription, intrazellulärer Transport, Zytoskelettstabilität, Vesikelhandel und RNA-Silencing3,4,5. Die überwiegende Mehrheit der Pathogen-Effektoren, insbesondere solche von fadenförmigen Krankheitserregern, sind jedoch rätselhaft geblieben.
RNA-Silencing ist eine homologievermittelte Geninaktivierungsmaschinerie, die unter Eukaryoten konserviert wird. Der Prozess wird durch lange doppelsträngige RNA (dsRNA) ausgelöst und zielt sequenzspezifisch auf die homologe einsträngige RNA (ssRNA) ab und manipuliert eine Vielzahl biologischer Prozesse, einschließlich antiviraler Abwehr6. Um angeborene Immunantworten des Wirts zu überwinden, haben sich einige Viren entwickelt, um das RNA-Silencing auszugleichen, einschließlich der Fähigkeit, sich innerhalb intrazellulärer Kompartimente zu replizieren oder dem reorganisierten Signal des Stummschaltungs zu entkommen. Die allgemeinste Strategie, mit der Viren ihre Genome vor dem RNA-Silencing-abhängigen Verlust der Genfunktion schützen, besteht jedoch darin, bestimmte Proteine zu kodieren, die die RNA-Silencing7,8unterdrücken. Es wurden mehrere mechanistisch unterschiedliche Ansätze zur Abschirmung und Charakterisierung viraler Suppressoren von RNA-Silencing (VSRs) etabliert, einschließlich der Ko-Infiltration von Agrobacterium-Tumefaciens-Kulturen, transgenen Pflanzen, die vermeintliche Unterdrücker ausdrücken, Pfropfen und Zellkultur9,10,11,12,13.
Jeder dieser Assays hat Vor- und Nachteile und identifiziert VSRs auf seine eigene Weise. Einer der häufigsten Ansätze basiert auf der Ko-Infiltration einzelner A. tmuefaciens-Kulturen, die das potentielle virale Protein und ein Reportergen (typisch grünes fluoreszierendes Protein [GFP]) auf den Nicotiana benthamiana 16c-Pflanzen beherbergen, die GFP unter der Kontrolle des Blumenkohlmosaikvirus 35S-Promotors konstitutiv ausdrücken. In Ermangelung eines aktiven viralen Silencing Suppressors wird GFP von den Wirtszellen als exogen identifiziert und innerhalb von 3 Tagen nach der Infiltration (dpi) zum Schweigen gebracht. Im Gegensatz dazu, wenn das virale Protein Unterdrückungsaktivität besitzt, bleibt der Expressionsgrad von GFP stabil über 3-9 dpi9. Dieser Co-Infiltrationstest ist einfach und schnell; es ist jedoch weder sehr stabil noch empfindlich. Nichtsdestotrotz hat der Assay zahlreiche VSRs mit unterschiedlichen Proteinsequenzen und Strukturen in vielen RNA-Virenidentifiziert 7,8.
Kürzlich wurden mehrere Effektorproteine, die die zelluläre RNA-Silencing-Aktivität hemmen können, durch bakterielle, Oomycete und Pilzpflanzenpathogene14,15,16charakterisiert. Diese Ergebnisse implizieren, dass RNA-Silencing-Unterdrückung eine gemeinsame Strategie zur Erleichterung der Infektion ist, die von Krankheitserregern in den meisten Königreichen verwendet wird. Theoretisch könnten viele, wenn nicht alle Der Effektoren RNA-Silencing Suppressoren (RSS) kodieren; Bisher wurden jedoch nur wenige identifiziert, was vor allem auf den Mangel an zuverlässiger und allgemeiner Screening-Strategie zurückzuführen ist. Darüber hinaus wurden die Unterdrücker von RNA-Silencing bei der überwiegenden Mehrheit der Pflanzenpathogene17nicht untersucht.
In diesem Bericht stellen wir ein optimiertes und allgemeines Protokoll zur Identifizierung von Pflanzenpathogeneffektoren vor, die lokale und systemische RNA-Silencing mittels agroinfiltrations-Assay unterdrücken können. Das oberste Ziel dieser Studie war es, die wichtigsten Aspekte des Protokolls hervorzuheben und die Schritte detailliert zu beschreiben, wodurch ein Screening-Test durchgeführt wird, der für fast alle Effektoren von Pflanzenpathogenen geeignet ist.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-Morpholinoethanesulfonic Acid (MES)</td>
			<td>Biofroxx</td>
			<td>1086GR500</td>
			<td>Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2xTaq Master Mix</td>
			<td>Vazyme Biotech</td>
			<td>P112-AA</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-(N-morpholino) propanesulfonic acid (MOPS)</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0264C507-1KG</td>
			<td>MOPS Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetosyringone (AS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D134406-5G</td>
			<td>Induction of Agrobacterium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A1296-1KG</td>
			<td>LB medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Biofroxx</td>
			<td>1110GR100</td>
			<td>Electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amersham Hybond -N+</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>RPN303 B</td>
			<td>Nothern blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amersham Imager</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>Amersham Imager 600</td>
			<td>Image</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Tryptone</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>211705</td>
			<td>LB medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Yeast Extraction</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>212750</td>
			<td>LB medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>D5100</td>
			<td>Photography</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChemiDoc MP Imaging System</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemiluminescent detection module component of dafa kits</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>89880</td>
			<td>Luminescence detection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0230-100G</td>
			<td>Antibiotics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ClonExpress II One Step Cloning Kit</td>
			<td>Vazyme Biotech</td>
			<td>C112-01</td>
			<td>Ligation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DIG Easy Hyb</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>11603558001</td>
			<td>Hybridization buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Easypure Plasmid Miniprep kit</td>
			<td>TransGen Biotech</td>
			<td>EM101-02</td>
			<td>Plasmid Extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasyPure Quick Gel Extraction Kit</td>
			<td>TransGen Biotech</td>
			<td>EG101-02</td>
			<td>Gel Extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA disodium salt dihydrate</td>
			<td>Amresco/VWR</td>
			<td>0105-1KG</td>
			<td>MOPS Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophoresis Power Supply</td>
			<td>LiuYi</td>
			<td>DYY6D</td>
			<td>Nucleic acid electrophoresis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FastDigest EcoRV</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>FD0304</td>
			<td>Vector digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Image System</td>
			<td>Tanon</td>
			<td>Tanon3500</td>
			<td>Image</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamycin</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0304-5G</td>
			<td>Antibiotics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin Sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>K1914</td>
			<td>Antibiotics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LR Clonase II enzyme</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11791020</td>
			<td>LR reaction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulose Blotting membrane 0.45um</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>10600002</td>
			<td>Northern</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NORTH2south biotin random prime dna labeling kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17075</td>
			<td>Biotin labeling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR Thermal Cyclers</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>T100</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peat moss</td>
			<td>PINDSTRUP</td>
			<td>Dark Gold + clay</td>
			<td>Plants</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peters Water-Soluble Fertilizer</td>
			<td>ICE</td>
			<td>Peter Professional 20-20-20</td>
			<td>Fertilizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase</td>
			<td>Vazyme Biotech</td>
			<td>P505-d1</td>
			<td>Enzyme</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rifampicin</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>219549005</td>
			<td>Antibiotics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA Gel Loading Dye (2X)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R0641</td>
			<td>RNA Gel Loading Dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Acetate Hydrate</td>
			<td>Amresco/VWR</td>
			<td>0530-1KG</td>
			<td>MOPS Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0241-10KG</td>
			<td>LB medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tri-Sodium citrate</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0101-1KG</td>
			<td>SSC Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizol Reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15596018</td>
			<td>RNA isolation reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV lamp</td>
			<td>Analytik Jena</td>
			<td>UVP B-100AP</td>
			<td>Observation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UVP Hybrilinker Oven</td>
			<td>Analytik Jena</td>
			<td>OV2000</td>
			<td>Northern</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

screening and identification of rna silencing suppressors from secreted effectors of plant pathogens

RNA-Silencing ist ein evolutionär konservierter, sequenzspezifischer Genregulationsmechanismus in Eukaryoten. Mehrere Pflanzenpathogene haben Proteine entwickelt, die die Fähigkeit hemmen können, den RNA-Silencing-Signalweg der Wirtspflanze zu hemmen. Im Gegensatz zu Viruseffektorproteinen haben nur mehrere abgesonderte Effektorproteine die Fähigkeit gezeigt, DAS RNA-Silencing bei bakteriellen, Oomyceten- und Pilzpathogenen zu unterdrücken, und die molekularen Funktionen der meisten Effektoren bleiben weitgehend unbekannt. Hier beschreiben wir detailliert eine leicht modifizierte Version des Co-Infiltrations-Assays, die als allgemeine Methode zur Beobachtung des RNA-Silencings und zur Charakterisierung von Effektorproteinen dienen könnte, die durch Pflanzenpathogene abgesondert werden. Die wichtigsten Schritte des Ansatzes sind die Wahl der gesunden und voll entwickelten Blätter, die Anpassung der Bakterienkultur an die entsprechende optische Dichte (OD) bei 600 nm und die Beobachtung der Fluoreszenz (Green Fluorescent Protein, GFP) zur optimalen Zeit auf der infiltrierten um das Auslassen von Effektoren mit schwacher Unterdrückungsaktivität zu vermeiden. Dieses verbesserte Protokoll wird zu einem schnellen, genauen und umfassenden Screening von RNA-Silencing-Suppressoren beitragen und als hervorragender Ausgangspunkt für die Untersuchung der molekularen Funktionen dieser Proteine dienen.

Oben beschreiben wir das Schritt-für-Schritt-Verfahren für einen verbesserten Screening-Assay zur Beurteilung der RSS-Aktivität von P. sojae RxLR-Effektoren. Insgesamt dauert das Experiment 5 bis 6 Wochen. Anschließend können die durch den Assay identifizierten RSS weiter in Funktion und molekularem Mechanismus charakterisiert werden. Als Beispiel für unseren Ansatz verwendeten wir den P. sojae RxLR effecto Phytophthora Suppressor der RNA-Silencing 1 (PSR1), der w?...

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Screening and Identification of RNA Silencing Suppressors from Secreted Effectors of Plant Pathogens

Hier stellen wir ein modifiziertes Screening-Verfahren vor, das ausgiebig eingesetzt werden kann, um RNA-Silencing-Suppressoren bei Pflanzenpathogenen schnell zu überprüfen.

Screening und Identifizierung von RNA-Silencing Suppressoren von sezernierten Effektoren von Pflanzenpathogenen

RNA silencing is an evolutionarily conserved, sequence-specific gene regulation mechanism in eukaryotes. Several plant pathogens have evolved proteins ...

Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen zu beantworten, wie man die RNA-Silencing-Suppressoren, die von Pflanzenpathogenen sezerniert werden, abschirmt. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, einen schnellen, genauen und umfangreichen Screening-Test zur Identifizierung von RNA-Silencing-Suppressoren bereitzustellen. Bereiten Sie Topfbodenmischungen vor, die aus 50% Torfmoos, 30% Perlit und 20% Vermiculit und Autoklaven bei 120 Grad Celsius für 20 Minuten bestehen.Die autoklavierten Bodenmischungen mit Pflanzendüngerlösung mit einem Gramm pro Liter einweichen und in kleinere Töpfe, die in einem größeren Tablett gelagert sind, unterpacken. Säen Sie ein oder zwei Samen von Nicotiana bethamiana 16c auf die Bodenoberfläche jedes Topfes. Bedecken Sie das Tablett mit einer Kunststoffkuppel und lassen Sie die Samen keimen.Platzieren Sie das Tablett unter licht- und temperaturgeregelten Wachstumskammern mit einer Temperatur von 23 bis 25 Grad Celsius, 50 bis 60 % relativer Luftfeuchtigkeit und einer langen Tag-Photoperiode. Nach drei bis vier Tagen keimen die Samen. Nehmen Sie die Kunststoffkuppel ab und lassen Sie die Sämlinge unter den gleichen Bedingungen wachsen, die für den Keimschritt verwendet werden.Alle zwei bis drei Tage eine angemessene Menge Wasser hinzufügen, die den Boden feucht, aber nicht einweichen. Alle 10 Tage Dünger hinzufügen, um weiteres Wachstum zu fördern. Bewahren Sie Nicotiana bethamiana 16c Pflanzen unter normalen Bedingungen, bis die Pflanzen mindestens fünf voll entwickelte echte Blätter ohne sichtbare Achsel- oder Blütenknospen haben und die Blätter ein gesundes grünes Aussehen haben.Verwenden Sie 10 bis 14 Tage alte Nicotiana bethamiana 16c Pflanzen für systemische RNA-Silencing-Assays und drei bis vier Wochen alte Blätter von Nicotiana bethamiana 16c für lokale RNA-Silencing-Assays. Verwenden Sie eine Spitze, um eine positive Kolonie aus der LB-Platte zu pflücken und die Zellen in ein Glasrohr mit fünf Millilitern LB-Medium zu impfen, ergänzt mit 50 Mikrogramm pro Milliliter Kanamycin und 50 Mikrogramm pro Milliliter Rifampicin. Wachsen Sie die Zellen bei 30 Grad Celsius mit Schütteln bei 200 RPM für 24 bis 48 Stunden.Übertragen Sie 100 Mikroliter der Kultur in fünf Milliliter LB-Medium, ergänzt mit den gleichen Antibiotika, 10 Millimolar MES bei pH 5,6 und 20 Mikromolar AS. Wachsen Sie die Bakterien bei 30 Grad Celsius mit Schütteln bei 200 RPM für 16 bis 20 Stunden. Zentrifugieren Sie die Zellen 10 Minuten lang bei 4.000 mal g. Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie das Pellet in zwei Millilitern 10 Millimolar Magnesiumchloridpuffer wieder auf.Wiederholen Sie die Wäsche, um die vollständige Entfernung von Antibiotika zu gewährleisten. Bestimmen Sie die Dichte der Agrobacterium-Kultur, indem Sie die optische Dichte bei 600 Nanometern messen. Stellen Sie die Zellkultur mit 10 Millimolaren Magnesiumchloridpuffer auf eine OD 600 von 1,5 bis 2,0 ein.Fügen Sie 10 Millimolar MES bei pH 5,6 und 150 Mikromolar AS in die endgültige Suspensionskultur ein und inkubieren Sie die Zellen bei Raumtemperatur für mindestens drei Stunden ohne Schütteln. Mischen Sie gleiche Volumina einer Agrobacterium-Kultur, die 35S grünes fluoreszierendes Protein enthält, mit einer Agrobacterium-Kultur, die 35S Gurkenmosaikvirus-Suppressor 2b, vermeintlichen Effektor oder leeren Vektor enthält. Mit einer ein Milliliter nadellosen Spritze die gemischten Agrobacterium Suspensionen an den abaxialen Seiten der Nicotiana bethamiana 16c Blätter vorsichtig und langsam infiltrieren.Entfernen Sie die verbleibende bakterielle Suspension von den Blättern mit Weichteiltüchern und kreisen Sie die Ränder der infiltrierten Pflaster mit einem Markerstift. Drei bis vier Tage nach der Infiltration, verwenden Sie eine langwellige ULTRAviolette Lampe, um die GFP-Fluoreszenz in den infiltrierten Blättern visuell zu erkennen. Zwei Wochen nach der Infiltration, verwenden Sie die Lampe, um neu gewachsene Blätter der gesamten Pflanze für systemische RNA-Silencing zu erkennen.Um die gesamte RNA nach der Infiltration vier bis sieben Tage lang aus dem Blattgewebe zu isolieren, sammeln Sie das Blattgewebe aus den infiltrierten Nicotiana bethamiana 16c-Pflastern in einen Mörtel. Flüssigstickstoff in den Mörtel geben und das Gewebe mit einer Schleifstange in ein feines Pulver schleifen und in ein steriles Zwei-Milliliter-Rohr geben. Fügen Sie das RNA-Isolationsreagenz mit einem Volumen von einem Milliliter pro 100 Milligramm Gewebe sofort in das Probenröhrchen in einer Haube ein, wirbeln Sie kräftig, um zu homogenisieren, und inkubieren Sie bei Raumtemperatur für fünf Minuten.Chloroform mit einem Volumen von 200 Mikrolitern pro Milliliter RNA-Isolationsreagenz in jedes Rohr in der Haube geben, 15 Sekunden lang kräftig schütteln und bei Raumtemperatur fünf Minuten lang inkubieren. Zentrifugieren Sie das Homogenat bei 12.000 mal g für 15 Minuten bei vier Grad Celsius. Übertragen Sie den Überstand in ein neues RNase-freies Rohr und entsorgen Sie das Pellet.0,7 Volumen Isopropanol in den Überstand geben, mehrmals sanft invertieren und die Mischung bei Raumtemperatur 10 Minuten inkubieren. Niederschlagen Sie das RNA-Pellet durch Zentrifugation bei 12.000 mal g für 15 Minuten bei vier Grad Celsius. Entsorgen Sie den Überstand.Waschen Sie das Pellet mit 70% Ethanol und trocknen Sie das Pellet in einer Haube. Lösen Sie die RNA in mit Diethylpyrocarbonat behandeltem Wasser auf, indem Sie sie 10 bis 20 Minuten in einem 65 Grad Celsius Wasserbad inkubieren. Um die Northern Blot-Analyse der GFP-Boten-RNA-Spiegel durchzuführen, bereiten Sie ein 1,2%formaldehyd-denaturierendes Agarose-Gel in 1X MOPS Laufpuffer vor.Mischen Sie die RNA eins zu eins mit RNA-Ladefarbstoff und denaturieren Sie die RNA durch Inkubation bei 65 Grad Celsius für 10 Minuten. Die denaturierten Proben sofort eine Minute auf Eis abkühlen lassen. Mit einer Pipette die Proben 50 Minuten lang in die Brunnen des Gels und der Elektrophorese laden, bis die RNA gut getrennt ist.Spülen Sie das Gel in 20X Saline-Natriumcitratpuffer, um das Formaldehyd zu entfernen. Führen Sie kapillare Übertragung über Nacht durch Die Einrichtung 20X Kochsamen-Natrium-Citrat-Puffer, eine Schicht Papiertuch, zwei Schichten nassen Whatman-Papier, eine Schicht Gel, eine Schicht Nylon-Membran, zwei Schichten nassen Whatman-Papier, zwei Schichten trockenes Whatman-Papier, eine Glasplatte und ein Gewicht. Am Morgen wird die RNA im Gel auf die Nylonmembran übertragen.Die Membran in 2X-Saline-Natriumcitrat einweichen und die RNA an der Membran fixieren, indem Sie die nasse Membran UV-Vernetzung aussetzen. Gehen Sie nach dem Manuskript. Voll entwickelte Blätter von drei bis vier Wochen alten Nicotiana bethamiana 16c Pflanzen wurden in Pflastern mit Agrobacterium-Mischungen mit 35S GFP mitinfiltriert.Vier Tage nach der Infiltration wurde die GFP-Fluoreszenz des infiltrierten Bereichs unter natürlichem Licht und langwelligem UV-Licht abgebildet. Northern Blot zeigte, dass GFP-Boten-RNA sich höher in den Blättern angesammelt emittierte, die 35S GFP plus 35S CMV2b oder 35S GFP plus 35S PSR1 ausdrückten, als in den Blättern, die 35S GFP plus EV exdrückten. Agroinfiltrationstest wurde durchgeführt, um die Ausbreitung des Schalldämpfersignals in den Blättern der zwei Wochen alten Nicotiana bethamiana 16c Sämlinge zu bewerten. Nach 14 Tagen nach der Infiltration zeigten mehr als 98% des EV keine offensichtliche GFP-Signalisierung in systemischen Blättern.Während sowohl CMV2b als auch PSR1 die systemische Ausbreitung des Silencing-Signals effizient verhinderten. Die GFP-Fluoreszenz wurde bei etwa 80 % der mitinfiltrierten Pflanzen beobachtet und in den verbleibenden 20 % der infiltrierten Pflanzen mit nur wenigen roten Adern in neu entstehenden Blättern. Diese Technik ebnet den Weg für Forscher, neuartige RNA-Silencing-Suppressoren zu identifizieren, die von vielen Pflanzenpathogenen sezerniert werden.Die Kombination von Pflanzen und der richtigen OD ist das Wichtigste, was man sich beim Versuch dieses Verfahrens merken sollte. Nach diesem Verfahren kann die funktionelle Charakterisierung des RNA-Silencing-Suppressors durchgeführt werden, um den Mechanismus zu untersuchen, wie diese Unterdrücker die Wirts-RNA-Silencing drücken und was der Output ist. Bitte tragen Sie die Schutzbrille, wenn Sie Pflanzen infiltrieren und tragen Sie auch die Latexhandschuhe während aller Experimentierschritte.

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetic Manipulation of the Plant Pathogen Ustilago maydis to Study Fungal Biology and Plant Microbe Interactions

Genetic Manipulation of the Plant Pathogen Ustilago maydis to Study Fungal Biology and Plant Microbe Interactions

Genetische Manipulation der Pflanze Pathogen<em&gt; Ustilago maydis</em&gt; Zu Pilzbiologie und Pflanzen Mikroben-Interaktionen Studie

Gene deletion plays an important role in the analysis of gene function. One of the most efficient methods to disrupt genes in a targeted manner is the ...

Forschung

Genetik

Mapping RNA-RNA Interactions Globally Using Biotinylated Psoralen

Zuordnung von RNA-RNA-Wechselwirkungen unter Verwendung von biotinyliertem Psoralen

Knowing how RNAs interact with themselves and with others is key to understanding RNA based gene regulation in the cell. While examples of RNA-RNA ...

Assessment of DNA Contamination in RNA Samples Based on Ribosomal DNA

Bewertung der Kontamination der DNA in RNA-Proben anhand der ribosomalen DNA

One method extensively used for the quantification of gene expression changes and transcript abundances is reverse-transcription quantitative real-time ...

Purification of High Molecular Weight Genomic DNA from Powdery Mildew for Long-Read Sequencing

Reinigung von High Molecular Weight genomischer DNA aus Echten Mehltaus für Long-Read-Sequenzierung

The powdery mildew fungi are a group of economically important fungal plant pathogens. Relatively little is known about the molecular biology and genetics ...

RNA Pull-down Procedure to Identify RNA Targets of a Long Non-coding RNA

RNA-Pulldown-Verfahren, RNA-Ziele eine lange nicht-kodierende RNA zu identifizieren

Long non-coding RNA (lncRNA), which are sequences of more than 200 nucleotides without a defined reading frame, belong to the regulatory non-coding ...

Exploring the Root Microbiome: Extracting Bacterial Community Data from the Soil, Rhizosphere, and Root Endosphere

Die Wurzel Mikrobiom zu erkunden: Extrahieren von Bakteriengemeinschaft Daten aus dem Boden, die Rhizosphäre und die Wurzel Endosphere

The intimate interaction between plant host and associated microorganisms is crucial in determining plant fitness, and can foster improved tolerance to ...

Generation of Cancer Cell Clones to Visualize Telomeric Repeat-containing RNA TERRA Expressed from a Single Telomere in Living Cells

Generation von Krebs Zellklonen Telomeric Repeat-haltigen RNA TERRA von einem einzigen Telomere in lebenden Zellen ausgedrückt zu visualisieren

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Identification of Footprints of RNA:Protein Complexes via RNA Immunoprecipitation in Tandem Followed by Sequencing (RIPiT-Seq)

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Identifizierung von Fußabdrücken von RNA:Protein-Komplexe über RNA-Immunpräzipitation im Tandem gefolgt von Sequenzierung (RIPiT-Seq)

RNA immunoprecipitation in tandem (RIPiT) is a method for enriching RNA footprints of a pair of proteins within an RNA:protein (RNP) complex. RIPiT ...

Identification of Circular RNAs using RNA Sequencing

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A FACS-based Protocol to Isolate RNA from the Secondary Cells of Drosophila Male Accessory Glands

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Ein FACS-basiertes Protokoll zur Isolierung von RNA aus den Sekundärzellen der Drosophila Male Accessory Dlands

To understand the function of an organ, it is often useful to understand the role of its constituent cell populations. Unfortunately, the rarity of ...