Name: screening and identification of rna silencing suppressors from secreted effectors of plant pathogens
Uploaded: 2020-02-03T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Screening and Identification of RNA Silencing Suppressors from Secreted Effectors of Plant Pathogens at JoVE.com

이 사업은 상하이 교육개발재단과 상하이시 교육위원회의 "슈광 프로그램"의 보조금으로 지원되었으며, 중국 의 국가 핵심 R&D 프로그램( 2018YFD0201500), 중국 국립자연과학재단(제31571696호 및 31660510호), 중국 청년전문가를 위한 천인재 프로그램, 상하이시 과학기술위원회(18DZ2260500).

참고 : 절차의 모든 단계는 실온 (RT)에서 수행해야합니다.
주의: 병원성 미생물을 함유한 모든 배지와 분석에 사용된 식물 및 식물 조직을 폐기하기 전에 적절한 폐기물 용기 및 오토클레이브에 보관하십시오.
1. 퍼팅 이펙터를 포함하는 플라스미드 구조의 준비
<ol><li>RNA 시퀀싱(RNA-Seq)에 의해 결정된 바와 같이 감염 중에 고도로 발현되는 분비 이펙터를 ?...

<ol>
	<li>Waterfield, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Virulence+Annotation+(RVA):+identification+of+virulence+factors+using+a+bacterial+genome+library+and+multiple+invertebrate+hosts.">Rapid Virulence Annotation (RVA): identification of virulence factors using a bacterial genome library and multiple invertebrate hosts.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (41), 15967-15972 (2008).</li><li>Rovenich, H., Boshoven, J. C., Thomma, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Filamentous+pathogen+effector+functions:+of+pathogens,+hosts+and+microbiomes.">Filamentous pathogen effector functions: of pathogens, hosts and microbiomes.</a> Current Opinion in Plant Biology. 20, 96-103 (2014).</li><li>Varden, F. A., De la Concepcion, J. C., Maidment, J. H., Banfield, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Taking+the+stage:+effectors+in+the+spotlight.">Taking the stage: effectors in the spotlight.</a> Current Opinion in Plant Biology. 38, 25-33 (2017).</li><li>Lee, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+Pseudomonas+syringae+Type+III+Secreted+Effector+Function+via+a+Yeast+Genomic+Screen.">Identifying Pseudomonas syringae Type III Secreted Effector Function via a Yeast Genomic Screen.</a> G3: Genes, Genomes, Genetics. 9 (2), 535-547 (2019).</li><li>Toruno, T. Y., Stergiopoulos, I., Coaker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant-Pathogen+Effectors:+Cellular+Probes+Interfering+with+Plant+Defenses+in+Spatial+and+Temporal+Manners.">Plant-Pathogen Effectors: Cellular Probes Interfering with Plant Defenses in Spatial and Temporal Manners.</a> Annual Review of Phytopathology. 54, 419-441 (2016).</li><li>Baulcombe, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+silencing+in+plants.">RNA silencing in plants.</a> Nature. 431 (7006), 356-363 (2004).</li><li>Pumplin, N., Voinnet, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+silencing+suppression+by+plant+pathogens:+defence,+counter-defence+and+counter-counter-defence.">RNA silencing suppression by plant pathogens: defence, counter-defence and counter-counter-defence.</a> Nature Reviews Microbiology. 11 (11), 745-760 (2013).</li><li>Csorba, T., Kontra, L., Burgyan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+silencing+suppressors:+Tools+forged+to+fine-tune+host-pathogen+coexistence.">Viral silencing suppressors: Tools forged to fine-tune host-pathogen coexistence.</a> Virology. 479-480, 85-103 (2015).</li><li>Johansen, L. K., Carrington, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silencing+on+the+spot.+Induction+and+suppression+of+RNA+silencing+in+the+Agrobacterium-mediated+transient+expression+system.">Silencing on the spot. Induction and suppression of RNA silencing in the Agrobacterium-mediated transient expression system.</a> Plant Physiology. 126 (3), 930-938 (2001).</li><li>Powers, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+assay+for+the+identification+of+RNA+silencing+suppressors+based+on+complementation+of+viral+movement.">A versatile assay for the identification of RNA silencing suppressors based on complementation of viral movement.</a> Molecular Plant-Microbe Interactions. 21 (7), 879-890 (2008).</li><li>Voinnet, O., Lederer, C., Baulcombe, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+viral+movement+protein+prevents+spread+of+the+gene+silencing+signal+in+Nicotiana+benthamiana.">A viral movement protein prevents spread of the gene silencing signal in Nicotiana benthamiana.</a> Cell. 103 (1), 157-167 (2000).</li><li>Deleris, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hierarchical+action+and+inhibition+of+plant+Dicer-like+proteins+in+antiviral+defense.">Hierarchical action and inhibition of plant Dicer-like proteins in antiviral defense.</a> Science. 313 (5783), 68-71 (2006).</li><li>Li, W. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferon+antagonist+proteins+of+influenza+and+vaccinia+viruses+are+suppressors+of+RNA+silencing.">Interferon antagonist proteins of influenza and vaccinia viruses are suppressors of RNA silencing.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (5), 1350-1355 (2004).</li><li>Navarro, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+plant+miRNA+contributes+to+antibacterial+resistance+by+repressing+auxin+signaling.">A plant miRNA contributes to antibacterial resistance by repressing auxin signaling.</a> Science. 312 (5772), 436-439 (2006).</li><li>Qiao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oomycete+pathogens+encode+RNA+silencing+suppressors.">Oomycete pathogens encode RNA silencing suppressors.</a> Nature Genetics. 45 (3), 330-333 (2013).</li><li>Yin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+fungal+effector+from+Puccinia+graminis+suppressing+RNA+silencing+and+plant+defense+responses.">A novel fungal effector from Puccinia graminis suppressing RNA silencing and plant defense responses.</a> New Phytologist. 222 (3), 1561-1572 (2019).</li><li>Zhang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+WY+domain+in+the+Phytophthora+effector+PSR1+is+required+for+infection+and+RNA+silencing+suppression+activity.">The WY domain in the Phytophthora effector PSR1 is required for infection and RNA silencing suppression activity.</a> New Phytologist. 223 (2), 839-852 (2019).</li><li>Petersen, T. N., Brunak, S., von Heijne, G., Nielsen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SignalP+4.0:+discriminating+signal+peptides+from+transmembrane+regions.">SignalP 4.0: discriminating signal peptides from transmembrane regions.</a> Nature Methods. 8 (10), 785-786 (2011).</li><li>Earley, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gateway-compatible+vectors+for+plant+functional+genomics+and+proteomics.">Gateway-compatible vectors for plant functional genomics and proteomics.</a> Plant Journal. 45 (4), 616-629 (2006).</li><li>Woodman, M. E., Savage, C. R., Arnold, W. K., Stevenson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+PCR+of+Intact+Bacteria+(Colony+PCR).">Direct PCR of Intact Bacteria (Colony PCR).</a> Current Protocols in Microbiology. 42 (1), 1-7 (2016).</li><li>Cao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+an+RNA+silencing+suppressor+from+a+plant+double-stranded+RNA+virus.">Identification of an RNA silencing suppressor from a plant double-stranded RNA virus.</a> Journal of Virology. 79 (20), 13018-13027 (2005).</li><li>Burgyan, J., Havelda, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+suppressors+of+RNA+silencing.">Viral suppressors of RNA silencing.</a> Trends in Plant Science. 16 (5), 265-272 (2011).</li><li>Incarbone, M., Dunoyer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+silencing+and+its+suppression:+novel+insights+from+in+planta+analyses.">RNA silencing and its suppression: novel insights from in planta analyses.</a> Trends in Plant Science. 18 (7), 382-392 (2013).</li><li>Martinez-Priego, L., Donaire, L., Barajas, D., Llave, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silencing+suppressor+activity+of+the+Tobacco+rattle+virus-encoded+16-kDa+protein+and+interference+with+endogenous+small+RNA-guided+regulatory+pathways.">Silencing suppressor activity of the Tobacco rattle virus-encoded 16-kDa protein and interference with endogenous small RNA-guided regulatory pathways.</a> Virology. 376 (2), 346-356 (2008).</li></ol>

RNA 침묵은 바이러스성, 세균성, 난균체 및 곰팡이 병원균에 대처하기 위해 식물에 의해 사용되는 주요 방어 메커니즘입니다. 차례로, 이들 미생물은 항바이러스 침묵을 중화하기 위해 침묵 억제 단백질을 진화시키고, 이들 RSSs는 RNA 침묵 경로22,23의상이한 단계를 방해한다. RSSS10을확인하기 위해 여러 스크리닝 검거가 개발되었습니다.<...

지난 2년간 식물 질환을 유발하는 미생물의 게놈 염기서열 분석이 가속화되면서 서열 정보와 인코딩된 단백질의 생물학적 기능 사이의 지식 격차가 계속 증가하고 있다1. 시퀀싱 프로젝트에 의해 밝혀진 분자 중에는 선천성 면역을 억제하고 숙주 식민지화를 촉진하는 이펙터 분자가 있습니다. 이 요인은 박테리아, 선충 및 필라멘트 미생물을 포함하여 파괴적인 식물 병원체에 의해 분비됩니다. 이러한 위협에 대응하기 위해 숙주 식물은 이러한 이펙터를 인식하는 새로운 수용체를 진화시켜 면역 반응을 회복시냅니다. 따라서, 이펙터는 병원체 계보 중 이펙터 레퍼토리의 다양화로 이어지는 다양한 선택적 압력의 대상이 된다2. 최근 몇 년 동안, 식물 병원균에서 putative 이펙터는 신호 경로의 dysregulation, 전사, 세포 내 수송, 세포 내 수송, 소포 인신 매매 및 RNA silencing3,4,5를포함하여 다양한 방법으로 미생물에 혜택을 호스트 세포 프로세스를 방해하여 식물 선천적 면역을 방해하는 것으로 나타났습니다. 그러나, 병원체 이펙터의 대다수, 특히 필라멘트 병원체에서 그, 수수께끼 남아 있다.
RNA 침묵은 진핵생물 사이에서 보존되는 상동성 중재한 유전자 불활성화 기계입니다. 이 과정은 긴 이중 가닥 RNA(dsRNA)에 의해 트리거되고 상동성 단일 가닥 RNA(ssRNA)를 서열특이적 방식으로 표적으로 하며, 항바이러스 방어6을포함하는 광범위한 생물학적 과정을 조작한다. 호스트의 타고난 면역 반응을 극복하기 위하여는, 몇몇 바이러스는 세포내 구획 안쪽에 복제하거나 침묵 개편된 신호에서 탈출하는 기능을 포함하여 RNA 침묵을 상쇄하기 위하여 발전했습니다. 그럼에도 불구하고, 바이러스가 유전자 기능의 RNA 침묵 의존적 손실에 대하여 그들의 게놈을 보호하는 가장 일반적인 전략은 RNA 침묵7,8을억제하는 특정 단백질을 인코딩하는 것이다. 아그로박테리움 투메파시엔스 배양, 이식 및 세포 배양 을 발현하는 형질전환 식물의 공동 침투를 포함하여 RNA 침묵(VSRs)의 바이러스 억제제를 스크리닝하고 특성화하기 위해 여러 기계적으로 다른 접근법이 확립되었다9,10,11,12,13.
이러한 각 연구는 장점과 단점을 가지고 있으며, 그 자체로 VSR을 식별합니다. 가장 일반적인 접근법 중 하나는 콜리플라워 모자이크 바이러스 35S의 통제 하에 GFP를 구성하는 니코티아나 벤타미아나 16c 식물에 잠재적인 바이러스 단백질 및 리포터 유전자(전형적으로 녹색 형광 단백질 [GFP])를 품고 있는 개별 A. tmuefaciens 배양물의 공동 침윤에 기초한다. 활성 바이러스 침묵 억제제의 부재에서, GFP는 숙주 세포에 의해 외인성으로 확인되고 침투 후 3일 이내에 침묵된다(dpi). 대조적으로, 바이러스 성 단백질이 억제 활성을 가지고 있다면, GFP의 발현 수준은 3−9 dpi9를넘어 꾸준히 유지됩니다. 이 공동 침투 분석은 간단하고 빠릅니다. 그러나 매우 안정적이지도 않고 민감하지도 않습니다. 그럼에도 불구하고, 분석은 많은 RNA 바이러스7,8에서다양한 단백질 서열 및 구조를 가진 수많은 VSR을 확인하였다.
최근에는 세포RNA 침묵 활성을 억제할 수 있는 여러 가지 이펙터 단백질이 세균, 오미세테 및 곰팡이 식물 병원균14,15,16으로특징지어지고 있다. 이 사실 인정은 RNA 침묵 억제가 대부분의 왕국에 있는 병원체에 의해 이용되는 감염을 촉진하기 위한 일반적인 전략이다는 것을 암시합니다. 이론적으로, 많은, 전부는 아니지만, 이펙터의 RNA 침묵 억제기를 인코딩 할 수있다 (RSSs); 그러나 현재까지 는 신뢰할 수 있고 일반적인 선별 전략의 부족으로 인해 소수의 사람만이 확인되었습니다. 더욱이, RNA 침묵의 억제제는 식물병원체(17)의대다수에서 조사되지 않았다.
이 보고서에서는 농업 침투 분석을 사용하여 국소 및 전신 RNA 침묵을 억제할 수 있는 식물 병원균 이펙터를 식별하기 위한 최적화되고 일반적인 프로토콜을 제시합니다. 이 연구의 가장 중요한 목적은 프로토콜의 주요 측면을 강조하고 단계를 상세히 설명함으로써 식물 병원균의 거의 모든 이펙터에 적합한 스크리닝 분석기를 제공하는 것이었습니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-Morpholinoethanesulfonic Acid (MES)</td>
			<td>Biofroxx</td>
			<td>1086GR500</td>
			<td>Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2xTaq Master Mix</td>
			<td>Vazyme Biotech</td>
			<td>P112-AA</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-(N-morpholino) propanesulfonic acid (MOPS)</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0264C507-1KG</td>
			<td>MOPS Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetosyringone (AS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D134406-5G</td>
			<td>Induction of Agrobacterium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A1296-1KG</td>
			<td>LB medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Biofroxx</td>
			<td>1110GR100</td>
			<td>Electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amersham Hybond -N+</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>RPN303 B</td>
			<td>Nothern blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amersham Imager</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>Amersham Imager 600</td>
			<td>Image</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Tryptone</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>211705</td>
			<td>LB medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Yeast Extraction</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>212750</td>
			<td>LB medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>D5100</td>
			<td>Photography</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChemiDoc MP Imaging System</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemiluminescent detection module component of dafa kits</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>89880</td>
			<td>Luminescence detection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0230-100G</td>
			<td>Antibiotics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ClonExpress II One Step Cloning Kit</td>
			<td>Vazyme Biotech</td>
			<td>C112-01</td>
			<td>Ligation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DIG Easy Hyb</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>11603558001</td>
			<td>Hybridization buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Easypure Plasmid Miniprep kit</td>
			<td>TransGen Biotech</td>
			<td>EM101-02</td>
			<td>Plasmid Extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasyPure Quick Gel Extraction Kit</td>
			<td>TransGen Biotech</td>
			<td>EG101-02</td>
			<td>Gel Extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA disodium salt dihydrate</td>
			<td>Amresco/VWR</td>
			<td>0105-1KG</td>
			<td>MOPS Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophoresis Power Supply</td>
			<td>LiuYi</td>
			<td>DYY6D</td>
			<td>Nucleic acid electrophoresis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FastDigest EcoRV</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>FD0304</td>
			<td>Vector digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Image System</td>
			<td>Tanon</td>
			<td>Tanon3500</td>
			<td>Image</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamycin</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0304-5G</td>
			<td>Antibiotics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin Sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>K1914</td>
			<td>Antibiotics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LR Clonase II enzyme</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11791020</td>
			<td>LR reaction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulose Blotting membrane 0.45um</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>10600002</td>
			<td>Northern</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NORTH2south biotin random prime dna labeling kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17075</td>
			<td>Biotin labeling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR Thermal Cyclers</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>T100</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peat moss</td>
			<td>PINDSTRUP</td>
			<td>Dark Gold + clay</td>
			<td>Plants</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peters Water-Soluble Fertilizer</td>
			<td>ICE</td>
			<td>Peter Professional 20-20-20</td>
			<td>Fertilizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase</td>
			<td>Vazyme Biotech</td>
			<td>P505-d1</td>
			<td>Enzyme</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rifampicin</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>219549005</td>
			<td>Antibiotics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA Gel Loading Dye (2X)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R0641</td>
			<td>RNA Gel Loading Dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Acetate Hydrate</td>
			<td>Amresco/VWR</td>
			<td>0530-1KG</td>
			<td>MOPS Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0241-10KG</td>
			<td>LB medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tri-Sodium citrate</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0101-1KG</td>
			<td>SSC Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizol Reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15596018</td>
			<td>RNA isolation reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV lamp</td>
			<td>Analytik Jena</td>
			<td>UVP B-100AP</td>
			<td>Observation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UVP Hybrilinker Oven</td>
			<td>Analytik Jena</td>
			<td>OV2000</td>
			<td>Northern</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

screening and identification of rna silencing suppressors from secreted effectors of plant pathogens

RNA 침묵은 진핵생물에 있는 진화적으로 보존된, 서열 특정 유전자 규칙 기계장치입니다. 몇몇 식물 병원체는 숙주 식물 RNA 침묵 통로를 억제하는 기능을 가진 단백질을 진화했습니다. 바이러스 이펙터 단백질과 는 달리, 단지 몇몇 분비 이펙터 단백질은 세균, 오미세테 및 곰팡이 병원체에서 RNA 침묵을 억제하는 능력을 보여주었으며, 대부분의 이펙터의 분자 기능은 크게 알려지지 않은 채로 남아 있다. 여기서, 우리는 RNA 침묵을 관찰하고 식물 병원체에 의해 분비되는 이펙터 단백질을 특성화하는 일반적인 방법으로 작용할 수 있는 병입 분석법의 약간 변형된 버전을 상세히 기술한다. 접근법의 주요 단계는 건강하고 완전히 발달된 잎을 선택하고, 박테리아 배양을 600 nm에서 적절한 광학 밀도(OD)로 조정하고, 침윤에 대한 최적의 시간에 녹색 형광 단백질(GFP) 형광을 관찰하는 것입니다. 억제 활동이 약한 이펙터를 생략하지 않도록 합니다. 이 향상된 프로토콜은 RNA 침묵 억제제의 신속하고 정확하며 광범위한 스크리닝에 기여하고 이러한 단백질의 분자 기능을 조사하기 위한 훌륭한 출발점역할을 할 것입니다.

상술한 바와 같이, P. 소재 RxLR 이펙터의 RSS 활성을 평가하기 위한 개선된 스크리닝 분석에 대한 단계별 절차를 설명한다. 전부, 실험은 5-6 주가 걸립니다. 이어서, 분석에 의해 확인된 RSSs는 기능 및 분자 메커니즘의 측면에서 더욱 특징화될 수 있다. 우리의 접근의 일보기로, 우리는 감염 도중 haustoria를 통해서 분비되고 전달되는 RNA 침묵 1 (PSR1)의 P. sojae RxLR ?...

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Screening and Identification of RNA Silencing Suppressors from Secreted Effectors of Plant Pathogens

여기서, 우리는 식물 병원체에서 RNA 침묵 억제제를 신속하게 스크리닝하는 데 광범위하게 사용될 수 있는 변형된 스크리닝 방법을 제시한다.

식물 병원균의 분비 이펙터에서 RNA 침묵 억제제의 스크리닝 및 식별

RNA silencing is an evolutionarily conserved, sequence-specific gene regulation mechanism in eukaryotes. Several plant pathogens have evolved proteins ...

이 방법은 식물 병원체에 의해 분비된 RNA 침묵 억제제를 검열하는 방법에 대한 중요한 질문에 대답하는 것을 도울 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 RNA 침묵 억제제 식별에 대한 신속하고 정확하며 광범위한 스크리닝 분석법을 제공하는 것입니다. 20분 동안 120도에서 50%의 토탄 이끼, 30%의 펄라이트, 20%의 버미쿨라이트 및 오토클레이브로 구성된 포팅 토양 믹스를 준비합니다.오토클레이브 토양 믹스를 식물 비료 용액과 리터당 1그램에 담그고 더 큰 트레이에 저장된 작은 냄비에 서브패키지로 넣습니다. 니코티아나 베타미안나 16c의 한두 씨앗을 각 냄비의 토양 표면에 뿌리세요. 트레이를 플라스틱 돔으로 덮고 씨앗이 발아하도록 합니다.트레이를 23~25도, 상대 습도 50~60%, 장시간 광등도의 온도 조절된 성장 챔버 아래에 놓습니다. 3~4일 후에 씨앗이 발아됩니다. 플라스틱 돔을 벗고 발아 단계에 사용되는 것과 동일한 조건에서 모종이 성장할 수 있도록 하십시오.2~3일마다 적당량을 추가하여 토양을 촉촉하게 유지하지만 담그지 않도록 합니다. 10일마다 비료를 추가하여 추가 성장을 촉진합니다. 니코티아나 베타미안아나 16c 식물을 정상적인 조건에서 유지하면 식물이 눈에 보이는 축또는 꽃봉오리가없는 적어도 5 개의 완전한 진정한 잎을 가지고 잎은 건강한 녹색 모양을 가지고 있습니다.전신 RNA 침묵 분석에 10-14일 된 니코티아나 벳타미안16c 식물을 사용하고 현지 RNA 침묵 분석에 니코티아나 벳하미안나 16c의 3~4주 된 잎을 사용하십시오. 팁을 사용하여 LB 플레이트에서 양성 식민지를 선택하고 셀을 LB 배지 5밀리리터를 포함하는 유리 튜브에 밀리리터 카나마이신 당 50 마이크로그램과 밀리리터 리팜피신 당 50 마이크로그램을 함유한 유리 튜브로 접종하십시오. 24 ~48 시간 동안 200 RPM에서 흔들어 30섭씨에서 세포를 성장시다.배양금 100마이크로리터를 동일한 항생제로 보충한 LB 배지 5밀리리터, pH 5.6의 밀리모어 MES 10개, 마이크로몰라 AS 20개소로 이송한다. 16~20시간 동안 200RPM에서 30도에서 박테리아를 성장시다. 세포를 4, 000배에서 10분 동안 원심분리합니다. 상체를 버리고 10 밀리머 마그네슘 염화물 완충제의 두 밀리리터에 펠릿을 다시 놓습니다.항생제의 완전한 제거를 보장하기 위해 세척을 반복합니다. 600 나노미터에서 광학 밀도를 측정하여 아그로박테리움 배양의 밀도를 결정한다. 10 밀리머마그네슘 염화물 완충제로 세포 배양을 1.5 ~2.0의 OD 600으로 조정한다.최종 현탁액 배양에 pH 5.6 및 150 마이크로몰러 AS에 10 밀리모어 MES를 추가하고 흔들림없이 적어도 3 시간 동안 실온에서 세포를 배양합니다. 35S 녹색 형광 단백질을 함유한 Agrobacterium 배양의 동일한 볼륨을 35S 오이 모자이크 바이러스 억제기 2b, 퍼티티 이펙터 또는 빈 벡터를 함유한 Agrobacterium 배양과 혼합합니다. 1 밀리리터 바늘없는 주사기를 사용하여 니코티아나 벳타미안 16c 잎의 축축 측면에 혼합 된 Agrobacterium 현탁액에 신중하고 천천히 침투합니다.연조직 물티슈로 잎에서 남은 세균 현탁액을 제거하고 마커 펜으로 침투패치의 여백을 동그라미로 만듭니다. 3~4일 후, 긴 파 자외선 램프를 사용하여 잎의 침투 패치에서 GFP 형광을 시각적으로 감지합니다. 2 주 후 침투, 전신 RNA 침묵에 대 한 전체 식물의 새로 성장 된 잎을 감지 하는 램프를 사용 하 여.4~7일 후 잎 조직에서 총 RNA를 분리하려면 침투한 니코티아나 베타미안나 16c 패치로부터 잎 조직을 박격포로 수집한다. 액체 질소를 박격포에 넣고 조직을 연삭 막대로 미세 한 분말로 갈아서 분말을 멸균 2 밀리리터 튜브로 옮기십시오. 즉시 RNA 격리 시약을 100 밀리리터 당 1밀리리터의 부피에 후드의 샘플 튜브에 추가하고, 소용돌이를 적극적으로 균일하게 하고, 실온에서 5분 동안 배양한다.RNA 격리 시약 1밀리리터당 200 마이크로리터의 부피에 클로로폼을 후드의 각 튜브에 넣고 15초 동안 격렬하게 흔들고 실온에서 5분간 배양합니다. 원심 분리는 섭씨 4도에서 15 분 동안 12, 000 배 g에서 동종. 상체를 새로운 RNase 가 없는 튜브로 옮기고 펠릿을 폐기합니다.상체에 0.7부분량의 이소프로판올을 넣고 여러 번 부드럽게 반전시키고 실온에서 10분 동안 혼합물을 배양합니다. RNA 펠릿을 12, 000배 g에서 섭씨 4도에서 15분간 경전적으로 침전시합니다. 상부체를 폐기합니다.펠릿을 70% 에탄올로 씻고 후드에 펠릿을 건조시키십시오. RNA를 다이틸 파이로카보네이트처리수에 10~20분 동안 섭씨 65도의 수조로 배양하여 용해하십시오. GFP 메신저 RNA 수준의 북부 블롯 분석을 수행하기 위해 1X MOPS 실행 버퍼에서 1.2%포름알데히드 분해 식 아가로즈 젤을 준비한다.RNA를 RNA 로딩 염료와 1대 1로 혼합하고 10분 동안 65도에서 잠복하여 RNA를 변성시한다. 즉시 1 분 동안 얼음에 변성 샘플을 냉각. 파이펫을 사용하면 RNA가 잘 분리될 때까지 100볼트에서 젤 및 감전의 우물에 샘플을 50분 간 적재합니다.포름알데히드를 제거하기 위해 20배 식염수 나트륨 완충제로 젤을 헹구는다. 20배 식염수 나트륨 구연산 버퍼, 종이 타월 1층, 젖은 Whatman 종이 2층, 젤 1층, 나일론 막 1층, 젖은 Whatman 종이 2층, 마른 Whatman 종이 2층, 유리 판 1개 및 무게를 설정하여 하룻밤 사이에 모세관 이송을 수행합니다. 아침에, 젤내의 RNA는 나일론 막으로 옮겨집니다.구연산 나트륨 2X에 멤브레인을 담그고 젖은 멤브레인을 UV 교차 링크에 노출시킴으로써 RNA를 막에 고정시킵니다. 원고에 따라 진행합니다. 3~4주 된 니코티아나 베타미안나 16c 식물의 완전히 발달된 잎은 35S GFP를 운반하는 아그로바테리움 혼합물로 패치에 공동 침투했습니다.4일 후 침투후, 침투된 부위의 GFP 형광은 자연광과 긴 파도 자외선 아래에서 이미지화되었다. 북부 블롯은 GFP 메신저 RNA가 35S GFP 플러스 35S GFP 플러스 EV를 표현하는 잎보다 35S GFP 플러스 35S GFP 플러스 35S PSR1을 표현하는 잎에서 더 높은 축적된 것으로 나타났다. 아그로인침 분석은 2주 된 니코티아나 베타미안나 16c 묘목의 잎에 침묵 신호의 확산을 평가하기 위해 수행되었다. 14일 만에 침투 후 EV의 98% 이상이 전신 잎에 명백한 GFP 신호를 보이지 않았습니다.CMV2b와 PSR1 모두 침묵 신호의 전신 확산을 효율적으로 억제하는 반면. GFP 형광은 공동 침투 식물의 약 80 %에서 관찰되었으며, 새로 나타난 잎에 몇 개의 붉은 정맥만있는 침투 식물의 나머지 20 %에서 관찰되었습니다. 이 기술은 많은 식물 병원체에 의해 분비된 새로운 RNA 침묵 억제제를 확인하는 연구원을 위한 도로를 포장합니다.식물과 적절한 OD의 조합은이 절차를 시도 할 때 기억해야 할 가장 중요한 것입니다. 이 절차에 따라, RNA 침묵 억제제의 기능적 특성화는 이러한 억제제가 숙주 RNA 침묵을 누르는 방법과 출력의 메커니즘을 탐구하기 위해 수행 될 수있다. 식물에 침투할 때 안전 고글을 착용하고 모든 실험 단계에서 라텍스 장갑을 착용하십시오.

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetic Manipulation of the Plant Pathogen Ustilago maydis to Study Fungal Biology and Plant Microbe Interactions

Genetic Manipulation of the Plant Pathogen Ustilago maydis to Study Fungal Biology and Plant Microbe Interactions

플랜트 병원체의 유전자 조작<em&gt; Ustilago maydis</em&gt; 곰팡이 생물과 식물 미생물 상호 작용을 연구하는

Gene deletion plays an important role in the analysis of gene function. One of the most efficient methods to disrupt genes in a targeted manner is the ...

연구

유전학

Mapping RNA-RNA Interactions Globally Using Biotinylated Psoralen

Biotinylated Psoralen을 사용하여 RNA-RNA 상호 작용을 세계적으로 매핑

Knowing how RNAs interact with themselves and with others is key to understanding RNA based gene regulation in the cell. While examples of RNA-RNA ...

Assessment of DNA Contamination in RNA Samples Based on Ribosomal DNA

Ribosomal DNA에 따라 RNA 샘플에서 DNA 오염 평가

One method extensively used for the quantification of gene expression changes and transcript abundances is reverse-transcription quantitative real-time ...

Purification of High Molecular Weight Genomic DNA from Powdery Mildew for Long-Read Sequencing

긴 읽기 시퀀싱에 대한 흰가루병에서 높은 분자량의 게놈의 DNA의 정제

The powdery mildew fungi are a group of economically important fungal plant pathogens. Relatively little is known about the molecular biology and genetics ...

RNA Pull-down Procedure to Identify RNA Targets of a Long Non-coding RNA

오래 비 코딩 RNA의 RNA 표적 식별에 RNA 풀 다운 절차

Long non-coding RNA (lncRNA), which are sequences of more than 200 nucleotides without a defined reading frame, belong to the regulatory non-coding ...

Exploring the Root Microbiome: Extracting Bacterial Community Data from the Soil, Rhizosphere, and Root Endosphere

루트 미생물 탐색: 토양, Rhizosphere, 및 루트 Endosphere에서 세균성 지역 사회 데이터 추출

The intimate interaction between plant host and associated microorganisms is crucial in determining plant fitness, and can foster improved tolerance to ...

Generation of Cancer Cell Clones to Visualize Telomeric Repeat-containing RNA TERRA Expressed from a Single Telomere in Living Cells

Telomeric 반복 포함 된 RNA 테라에서 살아있는 세포에서 단일 Telomere 표현 시각화 하 암 세포 클론의 세대

Telomeres are transcribed, giving rise to telomeric repeat-containing long noncoding RNAs (TERRA), which have been proposed to play important roles in ...

Identification of Footprints of RNA:Protein Complexes via RNA Immunoprecipitation in Tandem Followed by Sequencing (RIPiT-Seq)

Identification of Footprints of RNA:Protein Complexes via RNA Immunoprecipitation in Tandem Followed by Sequencing RIPiT-Seq

RNA의 발자국 의 식별:연속RNA 면역 침전을 통한 단백질 복합체 시퀀싱 (RIPiT-Seq)

RNA immunoprecipitation in tandem (RIPiT) is a method for enriching RNA footprints of a pair of proteins within an RNA:protein (RNP) complex. RIPiT ...

Identification of Circular RNAs using RNA Sequencing

RNA 시퀀싱을 사용하는 원형 RNA 식별

Circular RNAs (circRNAs) are a class of non-coding RNAs involved in functions including micro-RNA (miRNA) regulation, mediation of protein-protein ...

A FACS-based Protocol to Isolate RNA from the Secondary Cells of Drosophila Male Accessory Glands

A FACS-based Protocol to Isolate RNA from the Secondary Cells of Drosophila Male Accessory Glands

체미애 남성 액세서리 땀샘의 이차 세포에서 RNA를 분리하는 FACS 기반 프로토콜

To understand the function of an organ, it is often useful to understand the role of its constituent cell populations. Unfortunately, the rarity of ...