Name: screening and identification of rna silencing suppressors from secreted effectors of plant pathogens
Uploaded: 2020-02-03T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Screening and Identification of RNA Silencing Suppressors from Secreted Effectors of Plant Pathogens at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra "Shuguang Program" av Shanghai Education Development Foundation og Shanghai Municipal Education Commission, National Key Research and Development Program of China National Key R&D Program of China ( 2018YFD0201500), National Natural Science Foundation of China (nr. 31571696 og 31660510), Thousand Talents Program for Young Professionals of China, og Science and Technology Commission of Shanghai Municipality (18DZ2260500).

MERK: Alle trinnene i prosedyren skal utføres ved romtemperatur (RT).
FORSIKTIG: Sett alle medier som inneholder patogene mikrober, samt planter og plantevev som brukes i analysen, i de riktige avfallsbeholderne og autoklaven før kassering.
1. Utarbeidelse av plasmidkonstruksjoner som inneholder antatte effektorer
<ol><li>Velg antatte utskillede effektorer som er svært uttrykt under infeksjon, som bestemt av RNA-sekvensering (RNA-Seq), og videre av kvantitativ ...

<ol>
	<li>Waterfield, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Virulence+Annotation+(RVA):+identification+of+virulence+factors+using+a+bacterial+genome+library+and+multiple+invertebrate+hosts.">Rapid Virulence Annotation (RVA): identification of virulence factors using a bacterial genome library and multiple invertebrate hosts.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (41), 15967-15972 (2008).</li><li>Rovenich, H., Boshoven, J. C., Thomma, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Filamentous+pathogen+effector+functions:+of+pathogens,+hosts+and+microbiomes.">Filamentous pathogen effector functions: of pathogens, hosts and microbiomes.</a> Current Opinion in Plant Biology. 20, 96-103 (2014).</li><li>Varden, F. A., De la Concepcion, J. C., Maidment, J. H., Banfield, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Taking+the+stage:+effectors+in+the+spotlight.">Taking the stage: effectors in the spotlight.</a> Current Opinion in Plant Biology. 38, 25-33 (2017).</li><li>Lee, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+Pseudomonas+syringae+Type+III+Secreted+Effector+Function+via+a+Yeast+Genomic+Screen.">Identifying Pseudomonas syringae Type III Secreted Effector Function via a Yeast Genomic Screen.</a> G3: Genes, Genomes, Genetics. 9 (2), 535-547 (2019).</li><li>Toruno, T. Y., Stergiopoulos, I., Coaker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant-Pathogen+Effectors:+Cellular+Probes+Interfering+with+Plant+Defenses+in+Spatial+and+Temporal+Manners.">Plant-Pathogen Effectors: Cellular Probes Interfering with Plant Defenses in Spatial and Temporal Manners.</a> Annual Review of Phytopathology. 54, 419-441 (2016).</li><li>Baulcombe, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+silencing+in+plants.">RNA silencing in plants.</a> Nature. 431 (7006), 356-363 (2004).</li><li>Pumplin, N., Voinnet, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+silencing+suppression+by+plant+pathogens:+defence,+counter-defence+and+counter-counter-defence.">RNA silencing suppression by plant pathogens: defence, counter-defence and counter-counter-defence.</a> Nature Reviews Microbiology. 11 (11), 745-760 (2013).</li><li>Csorba, T., Kontra, L., Burgyan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+silencing+suppressors:+Tools+forged+to+fine-tune+host-pathogen+coexistence.">Viral silencing suppressors: Tools forged to fine-tune host-pathogen coexistence.</a> Virology. 479-480, 85-103 (2015).</li><li>Johansen, L. K., Carrington, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silencing+on+the+spot.+Induction+and+suppression+of+RNA+silencing+in+the+Agrobacterium-mediated+transient+expression+system.">Silencing on the spot. Induction and suppression of RNA silencing in the Agrobacterium-mediated transient expression system.</a> Plant Physiology. 126 (3), 930-938 (2001).</li><li>Powers, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+assay+for+the+identification+of+RNA+silencing+suppressors+based+on+complementation+of+viral+movement.">A versatile assay for the identification of RNA silencing suppressors based on complementation of viral movement.</a> Molecular Plant-Microbe Interactions. 21 (7), 879-890 (2008).</li><li>Voinnet, O., Lederer, C., Baulcombe, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+viral+movement+protein+prevents+spread+of+the+gene+silencing+signal+in+Nicotiana+benthamiana.">A viral movement protein prevents spread of the gene silencing signal in Nicotiana benthamiana.</a> Cell. 103 (1), 157-167 (2000).</li><li>Deleris, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hierarchical+action+and+inhibition+of+plant+Dicer-like+proteins+in+antiviral+defense.">Hierarchical action and inhibition of plant Dicer-like proteins in antiviral defense.</a> Science. 313 (5783), 68-71 (2006).</li><li>Li, W. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferon+antagonist+proteins+of+influenza+and+vaccinia+viruses+are+suppressors+of+RNA+silencing.">Interferon antagonist proteins of influenza and vaccinia viruses are suppressors of RNA silencing.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (5), 1350-1355 (2004).</li><li>Navarro, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+plant+miRNA+contributes+to+antibacterial+resistance+by+repressing+auxin+signaling.">A plant miRNA contributes to antibacterial resistance by repressing auxin signaling.</a> Science. 312 (5772), 436-439 (2006).</li><li>Qiao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oomycete+pathogens+encode+RNA+silencing+suppressors.">Oomycete pathogens encode RNA silencing suppressors.</a> Nature Genetics. 45 (3), 330-333 (2013).</li><li>Yin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+fungal+effector+from+Puccinia+graminis+suppressing+RNA+silencing+and+plant+defense+responses.">A novel fungal effector from Puccinia graminis suppressing RNA silencing and plant defense responses.</a> New Phytologist. 222 (3), 1561-1572 (2019).</li><li>Zhang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+WY+domain+in+the+Phytophthora+effector+PSR1+is+required+for+infection+and+RNA+silencing+suppression+activity.">The WY domain in the Phytophthora effector PSR1 is required for infection and RNA silencing suppression activity.</a> New Phytologist. 223 (2), 839-852 (2019).</li><li>Petersen, T. N., Brunak, S., von Heijne, G., Nielsen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SignalP+4.0:+discriminating+signal+peptides+from+transmembrane+regions.">SignalP 4.0: discriminating signal peptides from transmembrane regions.</a> Nature Methods. 8 (10), 785-786 (2011).</li><li>Earley, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gateway-compatible+vectors+for+plant+functional+genomics+and+proteomics.">Gateway-compatible vectors for plant functional genomics and proteomics.</a> Plant Journal. 45 (4), 616-629 (2006).</li><li>Woodman, M. E., Savage, C. R., Arnold, W. K., Stevenson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+PCR+of+Intact+Bacteria+(Colony+PCR).">Direct PCR of Intact Bacteria (Colony PCR).</a> Current Protocols in Microbiology. 42 (1), 1-7 (2016).</li><li>Cao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+an+RNA+silencing+suppressor+from+a+plant+double-stranded+RNA+virus.">Identification of an RNA silencing suppressor from a plant double-stranded RNA virus.</a> Journal of Virology. 79 (20), 13018-13027 (2005).</li><li>Burgyan, J., Havelda, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+suppressors+of+RNA+silencing.">Viral suppressors of RNA silencing.</a> Trends in Plant Science. 16 (5), 265-272 (2011).</li><li>Incarbone, M., Dunoyer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+silencing+and+its+suppression:+novel+insights+from+in+planta+analyses.">RNA silencing and its suppression: novel insights from in planta analyses.</a> Trends in Plant Science. 18 (7), 382-392 (2013).</li><li>Martinez-Priego, L., Donaire, L., Barajas, D., Llave, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silencing+suppressor+activity+of+the+Tobacco+rattle+virus-encoded+16-kDa+protein+and+interference+with+endogenous+small+RNA-guided+regulatory+pathways.">Silencing suppressor activity of the Tobacco rattle virus-encoded 16-kDa protein and interference with endogenous small RNA-guided regulatory pathways.</a> Virology. 376 (2), 346-356 (2008).</li></ol>

RNA-deaktivering er en viktig forsvarsmekanisme som brukes av planter for å bekjempe virale, bakterielle, oomycete og sopppatogener. I sin tur har disse mikrobene utviklet deaktivering suppressor proteiner for å motvirke antiviral deaktivering, og disse RSSs forstyrre ulike trinn av RNA deaktivering sti22,23. Flere screening analyser er utviklet for å identifisere RSSs10.
Her beskriver vi en forbedret protoko...

I løpet av de siste to tiårene har akselerasjon i genomsekvensering av mikroorganismer som forårsaker plantesykdommer ført til et stadig økende kunnskapsgap mellom sekvensinformasjon og de biologiske funksjonene til kodede proteiner1. Blant molekylene som avsløres av sekvenseringsprosjekter er effektormolekyler som undertrykker medfødt immunitet og letter vertskolonisering; Disse faktorene utskilles av destruktive plantepatogener, inkludert bakterier, nematoder og filamentous mikrober. For å svare på disse truslene har vertsplanter utviklet nye reseptorer som gjenkjenner disse effektene, noe som muliggjør restaurering av immunresponsen. Derfor er effektorer gjenstand for ulike selektive trykk, noe som fører til diversifisering av effekteller repertoarer blant patogene linjer2. I de senere årene har antatte effektorer fra plantepatogener vist seg å forstyrre plantemedfødt immunitet ved å hindre vertscellulære prosesser til fordel for mikrobene på en rekke måter, inkludert dysregulering av signalveier, transkripsjon, intracellulær transport, cytoskjelettstabilitet, vesicle trafficking og RNA silencing3,4,5. Men de aller fleste patogene effektorer, spesielt de fra filamentous patogener, har vært gåtefulle.
RNA-deaktivering er et homologimediert geninaktiveringsmaskiner som bevares blant eukaryoter. Prosessen utløses av lang dobbelt-strandet RNA (dsRNA) og retter seg mot homologen en-strandet RNA (ssRNA) på en sekvens-spesifikk måte, og det manipulerer et bredt spekter av biologiske prosesser, inkludert antiviral forsvar6. For å overgå medfødte immunresponser fra verten, har noen virus utviklet seg til å oppveie RNA-deaktivering, inkludert evnen til å replikere inne i intracellulære rom eller flykte fra det omorganiserte signalet. Likevel er den mest generelle strategien der virus beskytter sine genomer mot RNA-deaktiveringsavhengig tap av genfunksjon å kode spesifikke proteiner som undertrykker RNA-deaktivering7,8. Flere mekanistisk forskjellige tilnærminger har blitt etablert for å screene og karakterisere viralsuppressorer av RNA-deaktivering (VSRs), inkludert samtidig infiltrasjon av Agrobacterium tumefaciens kulturer, transgene planter som uttrykker putative suppressors, pode og cellekultur9,10,11,12,13.
Hver av disse analyser har fordeler og ulemper, og identifiserer VSRs på sin egen distinkte måte. En av de vanligste tilnærmingene er basert på samtidig infiltrasjon av individuelle A. tmuefaciens kulturer som skjuler det potensielle virale proteinet og et reportergen (typisk grønt fluorescerende protein [GFP]) på Nicotiana benthamiana 16c-planter som utgjør gfp under kontroll av blomkålmosaikkviruset 35S-arrangøren. I fravær av en aktiv viral deaktivering suppressor, er GFP identifisert som eksogene av vertscellene og er dempet innen 3 dager etter infiltrasjon (dpi). Derimot, hvis virusproteinet har undertrykkelsesaktivitet, forblir uttrykksnivået til GFP stabilt utover 3−9 dpi9. Denne koinfiltrasjonsanalysen er enkel og rask; Det er imidlertid verken svært stabilt eller følsomt. Likevel har analysen identifisert mange VSRs med ulike proteinsekvenser og strukturer i mange RNA-virus7,8.
Nylig har flere effektorproteiner som kan hemme den cellulære RNA-deaktiveringsaktiviteten blitt karakterisert fra bakteriell, oomycete og soppplantepatogener14,15,16. Disse funnene innebærer at RNA-deaktivering av undertrykkelse er en vanlig strategi for å legge til rette for infeksjon som brukes av patogener i de fleste riker. I teorien kan mange, om ikke alle, av effektorene kode RNA-deaktiveringssuppressorer (RSSs); Hittil har imidlertid bare noen få blitt identifisert, hovedsakelig på grunn av mangel på den pålitelige og generelle screeningstrategien. Videre har suppressors av RNA deaktivering ikke blitt undersøkt i de aller fleste plante patogener17.
I denne rapporten presenterer vi en optimalisert og generell protokoll for å identifisere plantepatogeneeffektorer som kan undertrykke lokale og systemiske RNA-deaktivering ved hjelp av agro-infiltrasjonsanalysen. Målet med denne studien var å understreke de viktigste aspektene ved protokollen og beskrive trinnene i detalj, og dermed gi en screeninganalyse som passer for nesten alle effektorer av plantepatogener.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-Morpholinoethanesulfonic Acid (MES)</td>
			<td>Biofroxx</td>
			<td>1086GR500</td>
			<td>Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2xTaq Master Mix</td>
			<td>Vazyme Biotech</td>
			<td>P112-AA</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-(N-morpholino) propanesulfonic acid (MOPS)</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0264C507-1KG</td>
			<td>MOPS Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetosyringone (AS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D134406-5G</td>
			<td>Induction of Agrobacterium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A1296-1KG</td>
			<td>LB medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Biofroxx</td>
			<td>1110GR100</td>
			<td>Electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amersham Hybond -N+</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>RPN303 B</td>
			<td>Nothern blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amersham Imager</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>Amersham Imager 600</td>
			<td>Image</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Tryptone</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>211705</td>
			<td>LB medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Yeast Extraction</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>212750</td>
			<td>LB medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>D5100</td>
			<td>Photography</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChemiDoc MP Imaging System</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemiluminescent detection module component of dafa kits</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>89880</td>
			<td>Luminescence detection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0230-100G</td>
			<td>Antibiotics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ClonExpress II One Step Cloning Kit</td>
			<td>Vazyme Biotech</td>
			<td>C112-01</td>
			<td>Ligation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DIG Easy Hyb</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>11603558001</td>
			<td>Hybridization buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Easypure Plasmid Miniprep kit</td>
			<td>TransGen Biotech</td>
			<td>EM101-02</td>
			<td>Plasmid Extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasyPure Quick Gel Extraction Kit</td>
			<td>TransGen Biotech</td>
			<td>EG101-02</td>
			<td>Gel Extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA disodium salt dihydrate</td>
			<td>Amresco/VWR</td>
			<td>0105-1KG</td>
			<td>MOPS Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophoresis Power Supply</td>
			<td>LiuYi</td>
			<td>DYY6D</td>
			<td>Nucleic acid electrophoresis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FastDigest EcoRV</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>FD0304</td>
			<td>Vector digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Image System</td>
			<td>Tanon</td>
			<td>Tanon3500</td>
			<td>Image</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamycin</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0304-5G</td>
			<td>Antibiotics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin Sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>K1914</td>
			<td>Antibiotics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LR Clonase II enzyme</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11791020</td>
			<td>LR reaction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulose Blotting membrane 0.45um</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>10600002</td>
			<td>Northern</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NORTH2south biotin random prime dna labeling kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17075</td>
			<td>Biotin labeling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR Thermal Cyclers</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>T100</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peat moss</td>
			<td>PINDSTRUP</td>
			<td>Dark Gold + clay</td>
			<td>Plants</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peters Water-Soluble Fertilizer</td>
			<td>ICE</td>
			<td>Peter Professional 20-20-20</td>
			<td>Fertilizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase</td>
			<td>Vazyme Biotech</td>
			<td>P505-d1</td>
			<td>Enzyme</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rifampicin</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>219549005</td>
			<td>Antibiotics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA Gel Loading Dye (2X)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R0641</td>
			<td>RNA Gel Loading Dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Acetate Hydrate</td>
			<td>Amresco/VWR</td>
			<td>0530-1KG</td>
			<td>MOPS Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0241-10KG</td>
			<td>LB medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tri-Sodium citrate</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0101-1KG</td>
			<td>SSC Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizol Reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15596018</td>
			<td>RNA isolation reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV lamp</td>
			<td>Analytik Jena</td>
			<td>UVP B-100AP</td>
			<td>Observation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UVP Hybrilinker Oven</td>
			<td>Analytik Jena</td>
			<td>OV2000</td>
			<td>Northern</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

screening and identification of rna silencing suppressors from secreted effectors of plant pathogens

RNA-deaktivering er en evolusjonært bevart, sekvensspesifikk genreguleringsmekanisme i eukaryoter. Flere plantepatogener har utviklet proteiner med evnen til å hemme vertsanlegget RNA-deaktiveringsveien. I motsetning til viruseffektorproteiner har bare flere utskillede effektorproteiner vist evnen til å undertrykke RNA-deaktivering i bakteriell, oomycete og sopppatogener, og de molekylære funksjonene til de fleste effektorer forblir i stor grad ukjente. Her beskriver vi i detalj en litt modifisert versjon av koinfiltrasjonsanalysen som kan tjene som en generell metode for å observere RNA-deaktivering og for karakterisering av effektorproteiner utskilt av plantepatogener. De viktigste trinnene i tilnærmingen er å velge de sunne og fullt utviklede bladene, justere bakteriekulturen til riktig optisk tetthet (OD) ved 600 nm, og observere grønt fluorescerende protein (GFP) fluorescens på optimal tid på infiltrert forlater for å unngå å utelate effektorer med svak undertrykkelse aktivitet. Denne forbedrede protokollen vil bidra til rask, nøyaktig og omfattende screening av RNA-deaktiveringssuppressorer og tjene som et utmerket utgangspunkt for å undersøke de molekylære funksjonene til disse proteinene.

Ovenfor beskriver vi trinnvis prosedyre for en forbedret screeninganalyse for å vurdere RSS-aktiviteten til P. sojae RxLR-effektorer. Til sammen tar eksperimentet 5-6 uker. Deretter kan RSSs identifisert av analysen karakteriseres ytterligere når det gjelder funksjon og molekylær mekanisme. Som et eksempel på vår tilnærming brukte vi P. sojae RxLR effecto Phytophthora suppressor av RNA-deaktivering 1 (PSR1), som utskilles og leveres til vertsceller gjennom haustori...

Watch this Scientific Journal Video about Screening and Identification of RNA Silencing Suppressors from Secreted Effectors of Plant Pathogens at JoVE.com

Screening and Identification of RNA Silencing Suppressors from Secreted Effectors of Plant Pathogens

Her presenterer vi en modifisert screeningmetode som kan brukes mye til raskt å screene RNA-deaktiveringssuppressorer i plantepatogener.

Screening og identifisering av RNA-dempende suppressorer fra utskillede effektorer av plantepatogener

RNA silencing is an evolutionarily conserved, sequence-specific gene regulation mechanism in eukaryotes. Several plant pathogens have evolved proteins ...

Denne metoden kan bidra til å svare på viktige spørsmål om hvordan man skal screene RNA-deaktiveringssuppressorene utskilles av plantepatogener. Den største fordelen med denne teknikken er å gi en rask, nøyaktig og omfattende screening analyse for RNA deaktivering suppressors identifikasjon. Forbered pottejordblandinger bestående av 50% torvmose, 30% perlitt og 20% vermikulitt og autoklav ved 120 grader Celsius i 20 minutter.Suge autoklavet jord blandinger med plante gjødsel løsning på ett gram per liter og underpakking dem i mindre potter lagret i et større brett. Så ett eller to frø av Nicotiana bethamiana 16c på jordoverflaten av hver pott. Dekk brettet med en plastkuppel og la frøene spire.Plasser brettet under lyse og temperaturkontrollerte vekstkamre med en temperatur på 23 til 25 grader Celsius, 50 til 60% relativ fuktighet og en lang dag fotoperiode. Etter tre til fire dager spirer frøene. Ta av plastkuppelen og la plantene vokse under de samme forholdene som brukes til spiringstrinnet.Hver to til tre dager, tilsett en passende mengde vann holde jorda fuktig, men ikke soaking. Hver 10 dager, legg gjødsel for å fremme videre vekst. Opprettholde Nicotiana bethamiana 16c planter under normale forhold til plantene har minst fem fullt utviklede sanne blader uten synlig aksillær eller blomsterknopper og bladene har et sunt grønt utseende.Bruk 10 til 14-dagers gamle Nicotiana bethamiana 16c planter for systemiske RNA deaktivering analyser og tre til fire uker gamle blader av Nicotiana bethamiana 16c for lokale RNA deaktivering analyser. Bruk et tips for å plukke en positiv koloni fra LB-platen og inokulere cellene i et glassrør som inneholder fem milliliter LB medium supplert med 50 mikrogram per milliliter Kanamycin og 50 mikrogram per milliliter Rifampicin. Vokse cellene ved 30 grader Celsius med risting ved 200 RPM i 24 til 48 timer.Overfør 100 mikroliter av kulturen til fem milliliter LB medium supplert med samme antibiotika, 10 millimolar MES ved pH 5.6 og 20 micromolar AS. Vokse bakteriene på 30 grader Celsius med risting på 200 RPM i 16 til 20 timer. Sentrifuger cellene ved 4000 ganger g i 10 minutter. Kast den overnaturlige og resuspend pellet i to milliliter på 10 millimolar magnesiumkloridbuffer.Gjenta vasken for å sikre fullstendig fjerning av antibiotika. Bestem tettheten av Agrobacterium-kulturen ved å måle den optiske tettheten ved 600 nanometer. Juster cellekulturen med 10 millimolar magnesiumkloridbuffer til en OD 600 på 1,5 til 2,0.Tilsett 10 millimolar MES ved pH 5.6 og 150 micromolar AS til den endelige suspensjonskulturen og inkuber cellene ved romtemperatur i minst tre timer uten risting. Bland like volumer av en Agrobacterium kultur som inneholder 35S grønn fluorescerende protein med en Agrobacterium kultur som inneholder 35S agurk mosaikk virus suppressor 2b, putative effector eller tom vektor. Bruk en en milliliter nåleløs sprøyte, infiltrer forsiktig og sakte de blandede Agrobacterium suspensjonene på abaxial sidene av Nicotiana bethamiana 16c blader.Fjern gjenværende bakteriell suspensjon fra bladene med bløtvevsservietter og sirkel margene på de infiltrerte patchene med en markørpenn. Tre til fire dager etter infiltrasjon, bruk en lang bølge ultrafiolett lampe for å visuelt oppdage GFP fluorescens i infiltrerte flekker av blader. To uker etter infiltrasjon, bruk lampen til å oppdage nydyrkede blader av hele anlegget for systemisk RNA-deaktivering.For å isolere den totale RNA fra bladvevet på fire til syv dager etter infiltrasjon, samle bladvevet fra infiltrert Nicotiana bethamiana 16c flekker i en mørtel. Legg flytende nitrogen i mørtelen og slip vevet til et fint pulver med en slipestang og overfør pulveret til et sterilt to milliliter rør. Tilsett umiddelbart RNA-isolasjonsreagensen ved volumet på en milliliter per 100 milligram vev til prøverøret i en hette, virvel kraftig for å homogenere og inkubere ved romtemperatur i fem minutter.Tilsett kloroform ved volumet på 200 mikroliter per en milliliter RNA-isolasjonsreagens til hvert rør i hetten, rist kraftig i 15 sekunder og inkuber ved romtemperatur i fem minutter. Sentrifuge homogenatet på 12 000 ganger g i 15 minutter ved fire grader Celsius. Overfør supernatanten til et nytt RNase-fritt rør og kast pelleten.Tilsett 0,7 volum isopropanol til det overnaturlige, forsiktig inverter flere ganger, og inkuber blandingen ved romtemperatur i 10 minutter. Utfell RNA pellet ved sentrifugering på 12,000 ganger g i 15 minutter ved fire grader Celsius. Kast det overnaturlige.Vask pelleten med 70% etanol og luft tørke pellet i en hette. Oppløs RNA i dietylpyokarbonatbehandlet vann ved å inkubere i et 65 grader Celsius vannbad i 10 til 20 minutter. For å utføre Northern blot analyse av GFP messenger RNA nivåer, forberede en 1,2% formaldehyd denaturing agarose gel i 1X MOPS kjører buffer.Bland RNA en-til-en med RNA lasting fargestoff og denature RNA ved inkubasjon ved 65 grader Celsius i 10 minutter. Avkjøl umiddelbart de denaturerte prøvene på is i ett minutt. Med en pipette laster du prøvene inn i brønnene på gelen og elektroforesen ved 100 volt i 50 minutter til RNA er godt separert.Skyll gelen i 20X saltvannsnatriumsitratbuffer for å fjerne formaldehydet. Utfør kapillæroverføring over natten ved å sette opp 20X saltvannsnatriumsitratbuffer, ett lag med papirhåndkle, to lag vått Whatman-papir, ett lag gel, ett lag nylonmembran, to lag vått Whatman-papir, to lag tørt Whatman-papir, en glassplate og en vekt. Om morgenen overføres RNA i gelen til nylonmembranen.Bløtlegg membranen i 2X saltvannsnatriumsitrat og fest RNA til membranen ved å utsette den våte membranen for UV-krysskobling. Fortsett i henhold til manuskriptet. Fullt utviklede blader av tre til fire uker gamle Nicotiana bethamiana 16c planter ble co-infiltrert i patcher med Agrobacterium blandinger bærer 35S GFP.Ved fire dager etter infiltrasjon ble GFP-fluorescensen til det infiltrerte området avbildet under naturlig lys og langbølge UV-lys. Northern blot avslørte at GFP messenger RNA akkumulert høyere i bladene uttrykker 35S GFP pluss 35S CMV2b eller 35S GFP pluss 35S PSR1 enn i bladene uttrykker 35S GFP pluss EV. Agroinfiltrasjonsanalyse ble utført for å evaluere spredningen av deaktiveringssignalet i bladene på to uker gamle Nicotiana bethamiana 16c frøplanter. Ved 14 dager etter infiltrasjon viste mer enn 98% av EV ingen åpenbar GFP-signalering i systemiske blader.Mens både CMV2b og PSR1 effektivt hemmet den systemiske spredningen av deaktiveringssignalet. GFP fluorescens ble observert hos ca 80% av co-infiltrerte planter og i de resterende 20% av infiltrerte planter med bare noen få røde årer dukket opp i nyoppståtte blader. Denne teknikken baner vei for forskere å identifisere nye RNA deaktivering suppressors utskilles av mange plantepatogener.Kombinasjonen av planter og riktig OD er det viktigste å huske når du prøver denne prosedyren. Etter denne fremgangsmåten kan den funksjonelle karakteriseringen av RNA-deaktiveringssuppressoren gjøres for å utforske mekanismen for hvordan disse suppressorene trykker på vertens RNA-deaktivering og hva som er utdataene. Bruk vernebrillene når du infiltrerer planter og også bruker latekshansker under alle eksperimenttrinnene.

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetic Manipulation of the Plant Pathogen Ustilago maydis to Study Fungal Biology and Plant Microbe Interactions

Genetic Manipulation of the Plant Pathogen Ustilago maydis to Study Fungal Biology and Plant Microbe Interactions

Genetisk manipulering av Plant Patogen<em&gt; Ustilago maydis</em&gt; Å studere Fungal Biology and Plant mikrobe interaksjoner

Gene deletion plays an important role in the analysis of gene function. One of the most efficient methods to disrupt genes in a targeted manner is the ...

Mapping RNA-RNA Interactions Globally Using Biotinylated Psoralen

Kartlegging av RNA-RNA-interaksjoner globalt ved bruk av biotinylert psoralen

Knowing how RNAs interact with themselves and with others is key to understanding RNA based gene regulation in the cell. While examples of RNA-RNA ...

Assessment of DNA Contamination in RNA Samples Based on Ribosomal DNA

Vurdering av DNA forurensning i RNA eksempler basert på Ribosomal DNA

One method extensively used for the quantification of gene expression changes and transcript abundances is reverse-transcription quantitative real-time ...

Purification of High Molecular Weight Genomic DNA from Powdery Mildew for Long-Read Sequencing

Rensing av High Molecular Weight Genomisk DNA fra meldugg for Long-Les Sekvense

The powdery mildew fungi are a group of economically important fungal plant pathogens. Relatively little is known about the molecular biology and genetics ...

RNA Pull-down Procedure to Identify RNA Targets of a Long Non-coding RNA

RNA rullegardinmenyen prosedyre å identifisere RNA mål av en lenge ikke-koding

Long non-coding RNA (lncRNA), which are sequences of more than 200 nucleotides without a defined reading frame, belong to the regulatory non-coding ...

Exploring the Root Microbiome: Extracting Bacterial Community Data from the Soil, Rhizosphere, and Root Endosphere

Utforske rot Microbiome: utpakking bakterielle samfunnet Data fra jord, Rhizosphere og rot Endosphere

The intimate interaction between plant host and associated microorganisms is crucial in determining plant fitness, and can foster improved tolerance to ...

Generation of Cancer Cell Clones to Visualize Telomeric Repeat-containing RNA TERRA Expressed from a Single Telomere in Living Cells

Generering av kreft cellen kloner å visualisere Telomeric gjenta inneholder RNA TERRA uttrykt fra en enkelt Telomere i levende celler

Telomeres are transcribed, giving rise to telomeric repeat-containing long noncoding RNAs (TERRA), which have been proposed to play important roles in ...

Identification of Footprints of RNA:Protein Complexes via RNA Immunoprecipitation in Tandem Followed by Sequencing (RIPiT-Seq)

Identification of Footprints of RNA:Protein Complexes via RNA Immunoprecipitation in Tandem Followed by Sequencing RIPiT-Seq

Identifisering av fotavtrykk av RNA: protein komplekser via RNA-Immunutfelling i tandem etterfulgt av sekvensering (RIPiT-SEQ)

RNA immunoprecipitation in tandem (RIPiT) is a method for enriching RNA footprints of a pair of proteins within an RNA:protein (RNP) complex. RIPiT ...

Identification of Circular RNAs using RNA Sequencing

Identifikasjon av sirkulær RNAs ved hjelp av RNA-sekvensering

Circular RNAs (circRNAs) are a class of non-coding RNAs involved in functions including micro-RNA (miRNA) regulation, mediation of protein-protein ...

A FACS-based Protocol to Isolate RNA from the Secondary Cells of Drosophila Male Accessory Glands

A FACS-based Protocol to Isolate RNA from the Secondary Cells of Drosophila Male Accessory Glands

En FACS-basert protokoll for å isolere RNA fra sekundære celler av Drosophila mannlig tilbehør kjertler

To understand the function of an organ, it is often useful to understand the role of its constituent cell populations. Unfortunately, the rarity of ...