Name: screening and identification of rna silencing suppressors from secreted effectors of plant pathogens
Uploaded: 2020-02-03T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Screening and Identification of RNA Silencing Suppressors from Secreted Effectors of Plant Pathogens at JoVE.com

Este trabalho foi apoiado por subsídios do "Programa Shuguang" da Fundação de Desenvolvimento educacional de Xangai e da Comissão Municipal de Educação de Xangai, do Programa Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento da Chave Nacional da China ( 2018YFD0201500), Fundação Nacional de Ciência Natural da China (nº 31571696 e 31660510), o Programa Mil Talentos para Jovens Profissionais da China e a Comissão de Ciência e Tecnologia do Município de Xangai (18DZ2260500).

NOTA: Todas as etapas do procedimento devem ser realizadas à temperatura ambiente (TR).
ATENÇÃO: Deposite todos os meios de comunicação contendo micróbios patogênicos, bem como as plantas e tecidos vegetais utilizados no ensaio, nos recipientes de resíduos apropriados e autoclave antes de descartar.
1. Preparação de construções plasmáticas contendo efeitos putativos
<ol><li>Selecione efeitos secretos putativos que são altamente expressos durante a in...

<ol>
	<li>Waterfield, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Virulence+Annotation+(RVA):+identification+of+virulence+factors+using+a+bacterial+genome+library+and+multiple+invertebrate+hosts.">Rapid Virulence Annotation (RVA): identification of virulence factors using a bacterial genome library and multiple invertebrate hosts.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (41), 15967-15972 (2008).</li><li>Rovenich, H., Boshoven, J. C., Thomma, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Filamentous+pathogen+effector+functions:+of+pathogens,+hosts+and+microbiomes.">Filamentous pathogen effector functions: of pathogens, hosts and microbiomes.</a> Current Opinion in Plant Biology. 20, 96-103 (2014).</li><li>Varden, F. 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X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferon+antagonist+proteins+of+influenza+and+vaccinia+viruses+are+suppressors+of+RNA+silencing.">Interferon antagonist proteins of influenza and vaccinia viruses are suppressors of RNA silencing.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (5), 1350-1355 (2004).</li><li>Navarro, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+plant+miRNA+contributes+to+antibacterial+resistance+by+repressing+auxin+signaling.">A plant miRNA contributes to antibacterial resistance by repressing auxin signaling.</a> Science. 312 (5772), 436-439 (2006).</li><li>Qiao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oomycete+pathogens+encode+RNA+silencing+suppressors.">Oomycete pathogens encode RNA silencing suppressors.</a> Nature Genetics. 45 (3), 330-333 (2013).</li><li>Yin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+fungal+effector+from+Puccinia+graminis+suppressing+RNA+silencing+and+plant+defense+responses.">A novel fungal effector from Puccinia graminis suppressing RNA silencing and plant defense responses.</a> New Phytologist. 222 (3), 1561-1572 (2019).</li><li>Zhang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+WY+domain+in+the+Phytophthora+effector+PSR1+is+required+for+infection+and+RNA+silencing+suppression+activity.">The WY domain in the Phytophthora effector PSR1 is required for infection and RNA silencing suppression activity.</a> New Phytologist. 223 (2), 839-852 (2019).</li><li>Petersen, T. N., Brunak, S., von Heijne, G., Nielsen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SignalP+4.0:+discriminating+signal+peptides+from+transmembrane+regions.">SignalP 4.0: discriminating signal peptides from transmembrane regions.</a> Nature Methods. 8 (10), 785-786 (2011).</li><li>Earley, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gateway-compatible+vectors+for+plant+functional+genomics+and+proteomics.">Gateway-compatible vectors for plant functional genomics and proteomics.</a> Plant Journal. 45 (4), 616-629 (2006).</li><li>Woodman, M. E., Savage, C. R., Arnold, W. K., Stevenson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+PCR+of+Intact+Bacteria+(Colony+PCR).">Direct PCR of Intact Bacteria (Colony PCR).</a> Current Protocols in Microbiology. 42 (1), 1-7 (2016).</li><li>Cao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+an+RNA+silencing+suppressor+from+a+plant+double-stranded+RNA+virus.">Identification of an RNA silencing suppressor from a plant double-stranded RNA virus.</a> Journal of Virology. 79 (20), 13018-13027 (2005).</li><li>Burgyan, J., Havelda, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+suppressors+of+RNA+silencing.">Viral suppressors of RNA silencing.</a> Trends in Plant Science. 16 (5), 265-272 (2011).</li><li>Incarbone, M., Dunoyer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+silencing+and+its+suppression:+novel+insights+from+in+planta+analyses.">RNA silencing and its suppression: novel insights from in planta analyses.</a> Trends in Plant Science. 18 (7), 382-392 (2013).</li><li>Martinez-Priego, L., Donaire, L., Barajas, D., Llave, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silencing+suppressor+activity+of+the+Tobacco+rattle+virus-encoded+16-kDa+protein+and+interference+with+endogenous+small+RNA-guided+regulatory+pathways.">Silencing suppressor activity of the Tobacco rattle virus-encoded 16-kDa protein and interference with endogenous small RNA-guided regulatory pathways.</a> Virology. 376 (2), 346-356 (2008).</li></ol>

O silenciamento de RNA é um mecanismo de defesa chave empregado pelas plantas para combater patógenos virais, bacterianos, oomycete e fúngicos. Por sua vez, esses micróbios evoluíram silenciando proteínas supressoras para neutralizar o silenciamento antiviral, e esses RSSs interferem em diferentes etapas da via de silenciamento rna22,23. Vários ensaios de triagem foram desenvolvidos para identificar rsss10.
<p class="jove_conten...

Nas últimas duas décadas, a aceleração no sequenciamento de genomas de microrganismos que causam doenças vegetais levou a uma lacuna de conhecimento cada vez maior entre informações de sequência e as funções biológicas de proteínas codificadas1. Entre as moléculas reveladas por projetos de sequenciamento estão moléculas que suprimem imunidade inata e facilitam a colonização do hospedeiro; esses fatores são secretados por patógenos vegetais destrutivos, incluindo bactérias, nematoides e micróbios feudos. Para responder a essas ameaças, as plantas hospedeiras desenvolveram novos receptores que reconhecem esses efeitos, permitindo a restauração da resposta imune. Assim, os efetivadores estão sujeitos a diversas pressões seletivas, levando à diversificação de processos ou repertórios entre as linhagens patógenas2. Nos últimos anos, os agentes putativos de patógenos vegetais têm mostrado interromper a imunidade inata da planta, impedindo processos celulares hospedeiros para beneficiar os micróbios de várias maneiras, incluindo a disregulação de caminhos de sinalização, transcrição, transporte intracelular, estabilidade do citoesqueleto, tráfico de vesículos e silenciamento de RNA3,4,5. No entanto, a grande maioria dos patógenos, particularmente os de patógenos filamentous, permaneceram enigmáticos.
O silenciamento de RNA é uma máquina de inativação genética mediada por homologia que é conservada entre eupedia. O processo é desencadeado por longoR de dupla cadeia (dsRNA) e tem como alvo o RNA homônimo de uma única cadeia (ssRNA) de forma específica de sequência, e manipula uma ampla gama de processos biológicos, incluindo a defesa antiviral6. Para superar as respostas imunes inatas do hospedeiro, alguns vírus evoluíram para compensar o silenciamento de RNA, incluindo a capacidade de se replicar dentro de compartimentos intracelulares ou escapar do sinal reorganizado silenciante. No entanto, a estratégia mais geral pela qual os vírus protegem seus genomas contra a perda dependente de RNA da função genética é codificar proteínas específicas que suprimem o RNA silenciando7,8. Várias abordagens mecanicamente diferentes foram estabelecidas para tela e caracterizam supressores virais de silenciamento de RNA (VSRs), incluindo a co-infiltração de culturas de tumefaciens Agrobacterium, plantas transgênicas expressando supressores putativos, enxerto e cultura celular9,10,11,12,13.
Cada um desses ensaios tem vantagens e desvantagens, e identifica VSRs de sua maneira distinta. Uma das abordagens mais comuns baseia-se na co-infiltração de culturas individuais a. tmuefaciens que abrigam a proteína viral potencial e um gene repórter (tipicamente proteína fluorescente verde [GFP]) nas plantas nicotiana benthamiana 16c constitutivamente expressando GFP o controle do vírus do mosaico de couve-flor 35S promotor. Na ausência de um supressor viral ativo, o GFP é identificado como exógeno pelas células hospedeiras e é silenciado dentro de 3 dias após a infiltração (dpi). Em contrapartida, se a proteína viral possui atividade de supressão, o nível de expressão do GFP permanece estável além de 3-9 dpi9. Este ensaio de co-infiltração é simples e rápido; no entanto, não é altamente estável nem sensível. No entanto, o ensaio identificou inúmeros VSRs com diversas sequências e estruturas proteicas em muitos vírus RNA7,8.
Recentemente, várias proteínas effectoras que podem inibir a atividade de silenciamento de RNA celular foram caracterizadas a partir de patógenos vegetais bacterianos, oomycete e fúngicos14,15,16. Esses achados implicam que a silenciamento de RNA é uma estratégia comum para facilitar a infecção que é usada por patógenos na maioria dos reinos. Em teoria, muitos, se não todos, dos efetivadores podem codificar supressores de rna silenciando (RSSs); até o momento, porém, apenas alguns foram identificados, principalmente devido à escassez da estratégia de triagem confiável e geral. Além disso, supressores de silenciamento de RNA não foram investigados na grande maioria dos patógenos vegetais17.
Neste relatório, apresentamos um protocolo otimizado e geral para identificar os efeitos de patógenos vegetais que podem suprimir o silenciamento de RNA local e sistêmico usando o ensaio de agroinfiltração. O principal objetivo deste estudo foi enfatizar os aspectos-chave do protocolo e descrever as etapas detalhadas, fornecendo assim um ensaio de triagem adequado para quase todos os efeitos dos patógenos vegetais.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-Morpholinoethanesulfonic Acid (MES)</td>
			<td>Biofroxx</td>
			<td>1086GR500</td>
			<td>Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2xTaq Master Mix</td>
			<td>Vazyme Biotech</td>
			<td>P112-AA</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-(N-morpholino) propanesulfonic acid (MOPS)</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0264C507-1KG</td>
			<td>MOPS Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetosyringone (AS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D134406-5G</td>
			<td>Induction of Agrobacterium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A1296-1KG</td>
			<td>LB medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Biofroxx</td>
			<td>1110GR100</td>
			<td>Electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amersham Hybond -N+</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>RPN303 B</td>
			<td>Nothern blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amersham Imager</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>Amersham Imager 600</td>
			<td>Image</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Tryptone</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>211705</td>
			<td>LB medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Yeast Extraction</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>212750</td>
			<td>LB medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>D5100</td>
			<td>Photography</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChemiDoc MP Imaging System</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemiluminescent detection module component of dafa kits</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>89880</td>
			<td>Luminescence detection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0230-100G</td>
			<td>Antibiotics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ClonExpress II One Step Cloning Kit</td>
			<td>Vazyme Biotech</td>
			<td>C112-01</td>
			<td>Ligation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DIG Easy Hyb</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>11603558001</td>
			<td>Hybridization buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Easypure Plasmid Miniprep kit</td>
			<td>TransGen Biotech</td>
			<td>EM101-02</td>
			<td>Plasmid Extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasyPure Quick Gel Extraction Kit</td>
			<td>TransGen Biotech</td>
			<td>EG101-02</td>
			<td>Gel Extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA disodium salt dihydrate</td>
			<td>Amresco/VWR</td>
			<td>0105-1KG</td>
			<td>MOPS Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophoresis Power Supply</td>
			<td>LiuYi</td>
			<td>DYY6D</td>
			<td>Nucleic acid electrophoresis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FastDigest EcoRV</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>FD0304</td>
			<td>Vector digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Image System</td>
			<td>Tanon</td>
			<td>Tanon3500</td>
			<td>Image</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamycin</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0304-5G</td>
			<td>Antibiotics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin Sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>K1914</td>
			<td>Antibiotics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LR Clonase II enzyme</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11791020</td>
			<td>LR reaction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulose Blotting membrane 0.45um</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>10600002</td>
			<td>Northern</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NORTH2south biotin random prime dna labeling kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17075</td>
			<td>Biotin labeling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR Thermal Cyclers</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>T100</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peat moss</td>
			<td>PINDSTRUP</td>
			<td>Dark Gold + clay</td>
			<td>Plants</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peters Water-Soluble Fertilizer</td>
			<td>ICE</td>
			<td>Peter Professional 20-20-20</td>
			<td>Fertilizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase</td>
			<td>Vazyme Biotech</td>
			<td>P505-d1</td>
			<td>Enzyme</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rifampicin</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>219549005</td>
			<td>Antibiotics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA Gel Loading Dye (2X)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R0641</td>
			<td>RNA Gel Loading Dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Acetate Hydrate</td>
			<td>Amresco/VWR</td>
			<td>0530-1KG</td>
			<td>MOPS Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0241-10KG</td>
			<td>LB medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tri-Sodium citrate</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0101-1KG</td>
			<td>SSC Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizol Reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15596018</td>
			<td>RNA isolation reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV lamp</td>
			<td>Analytik Jena</td>
			<td>UVP B-100AP</td>
			<td>Observation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UVP Hybrilinker Oven</td>
			<td>Analytik Jena</td>
			<td>OV2000</td>
			<td>Northern</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

screening and identification of rna silencing suppressors from secreted effectors of plant pathogens

O silenciamento de RNA é um mecanismo evolutivamente conservado e específico de regulação genética em eucalinos. Vários patógenos vegetais desenvolveram proteínas com a capacidade de inibir o caminho de silenciamento de RNA da planta hospedeira. Ao contrário das proteínas causadoras de vírus, apenas várias proteínas de efeito ou de efeito secreto mostraram a capacidade de suprimir o silenciamento de RNA em patógenos bacterianos, oomycete e fúngicos, e as funções moleculares da maioria dos efetivadores permanecem em grande parte desconhecidas. Aqui, descrevemos em detalhes uma versão ligeiramente modificada do ensaio de co-infiltração que poderia servir como um método geral para observar o silenciamento de RNA e para caracterizar proteínas ou fetos ou fetos segregados por patógenos vegetais. Os principais passos da abordagem são escolher as folhas saudáveis e totalmente desenvolvidas, ajustar a cultura das bactérias à densidade óptica apropriada (OD) a 600 nm, e observar a fluorescência da proteína fluorescente verde (GFP) no momento ideal no infiltrado sai para evitar omitir efetores com fraca atividade de supressão. Este protocolo melhorado contribuirá para uma triagem rápida, precisa e extensiva de supressores de silenciamento de RNA e servirá como um excelente ponto de partida para investigar as funções moleculares dessas proteínas.

Acima, descrevemos o procedimento passo a passo para um melhor ensaio de triagem para avaliar a atividade RSS dos effectores P. sojae RxLR. Ao todo, o experimento leva de 5 a 6 semanas. Posteriormente, os RSSs identificados pelo ensaio podem ser ainda mais caracterizados em termos de função e mecanismo molecular. Como exemplo de nossa abordagem, usamos o supressor P. sojae RxLR do Silencing RNA 1 (PSR1), que é secretado e entregue em células hospedeiras através da h...

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Screening and Identification of RNA Silencing Suppressors from Secreted Effectors of Plant Pathogens

Aqui, apresentamos um método de triagem modificado que pode ser amplamente usado para triagem rapidamente de supressores de RNA em patógenos vegetais.

Triagem e Identificação de Supressores de Silenciamento de RNA de agentes secretos de patógenos vegetais

RNA silencing is an evolutionarily conserved, sequence-specific gene regulation mechanism in eukaryotes. Several plant pathogens have evolved proteins ...

Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave sobre como rastrear os supressores de silenciamento de RNA secretados por patógenos vegetais. A principal vantagem desta técnica é fornecer um ensaio de triagem rápido, preciso e extensivo para identificação de supressores de silenciamento de RNA. Prepare misturas de solo de vasos compostas por 50% de musgo de turfa, 30% perlite e 20% vermiculite e autoclave a 120 graus Celsius por 20 minutos.Mergulhe as misturas de solo autoclaved com solução de fertilizante vegetal a um grama por litro e subembale-as em potes menores armazenados em uma bandeja maior. Semear uma ou duas sementes de Nicotiana bethamiana 16c na superfície do solo de cada vaso. Cubra a bandeja com uma cúpula de plástico e deixe as sementes germinarem.Coloque a bandeja sob câmaras de crescimento controladas pela luz e temperatura com uma temperatura de 23 a 25 graus Celsius, 50 a 60% de umidade relativa e um longo período de tempo. Depois de três a quatro dias, as sementes germinam. Tire a cúpula de plástico e permita que as mudas cresçam sob as mesmas condições utilizadas para a etapa de germinação.A cada dois ou três dias, adicione uma quantidade apropriada de água mantendo o solo úmido, mas não encharcado. A cada 10 dias, adicione fertilizante para promover um crescimento maior. Mantenha as plantas nicotiana bethamiana 16c em condições normais até que as plantas tenham pelo menos cinco folhas verdadeiras totalmente desenvolvidas sem botões axilares ou florais visíveis e as folhas têm uma aparência verde saudável.Use plantas nicotiana bethamiana de 10 a 14 dias para ensaios de silenciamento de RNA sistêmico e folhas de três a quatro semanas de nicotiana bethamiana 16c para ensaios locais de silenciamento de RNA. Use uma dica para escolher uma colônia positiva da placa LB e inocular as células em um tubo de vidro contendo cinco mililitros de meio LB suplementados com 50 microgramas por mililitro Kanamycin e 50 microgramas por mililitro Rifampicin. Cresça as células a 30 graus Celsius com agitação a 200 RPM por 24 a 48 horas.Transfira 100 microliters da cultura em cinco mililitros de meio LB suplementados com os mesmos antibióticos, 10 mililitros MES no pH 5.6 e 20 micromolar AS. Cresça a bactéria a 30 graus Celsius com tremor a 200 RPM por 16 a 20 horas. Centrifugar as células a 4.000 vezes g por 10 minutos. Descarte o supernascer e resuspenque a pelota em dois mililitros de 10 mililitros de cloroium tampão de cloreto de magnésio.Repita a lavagem para garantir a remoção completa dos antibióticos. Determine a densidade da cultura Agrobacterium medindo a densidade óptica em 600 nanômetros. Ajuste a cultura celular com 10 mililitros de cloreto de magnésio a um OD 600 de 1,5 a 2,0.Adicione 10 milimôlares MES no pH 5.6 e 150 micromolar AS à cultura final de suspensão e incubar as células em temperatura ambiente por pelo menos três horas sem tremer. Misture volumes iguais de uma cultura agrobacterium contendo proteína fluorescente verde 35S com uma cultura agrobacterium contendo supressor de vírus do mosaico de pepino 35S 2b, efeito putativo ou vetor vazio. Usando uma seringa sem agulha de um mililitro, infiltrar-se cuidadosamente e lentamente nas suspensões mistas de Agrobacterium nas laterais abaxial das folhas de Nicotiana bethamiana 16c.Remova a suspensão bacteriana restante das folhas com lenços de tecido mole e circule as margens das manchas infiltradas com uma caneta marcadora. Três a quatro dias após a infiltração, use uma lâmpada ultravioleta de ondas longas para detectar visualmente a fluorescência GFP nas manchas infiltradas das folhas. Duas semanas após a infiltração, use a lâmpada para detectar folhas recém-cultivadas de toda a planta para silenciar RNA sistêmico.Para isolar o RNA total do tecido da folha em quatro a sete dias após a infiltração, colete os tecidos da folha das manchas de Nicotiana bethamiana 16c infiltradas em uma argamassa. Coloque nitrogênio líquido na argamassa e triture o tecido em um pó fino com uma vara de moagem e transfira o pó para um tubo estéril de dois mililitros. Adicione imediatamente o reagente de isolamento de RNA ao volume de um mililitro por 100 miligramas de tecido ao tubo de amostra em um capô, vórtice vigorosamente para homogeneizar e incubar à temperatura ambiente por cinco minutos.Adicione clorofórmio ao volume de 200 microliters por um mililitro de reagente de isolamento de RNA a cada tubo no capô, agite vigorosamente por 15 segundos e incubar à temperatura ambiente por cinco minutos. Centrifugar o homogeneizar a 12.000 vezes g por 15 minutos a quatro graus Celsius. Transfira o supernatante para um novo tubo sem RNase e descarte a pelota.Adicione 0,7 volume de isopropanol ao supernasciente, inverta suavemente várias vezes e incubar a mistura à temperatura ambiente por 10 minutos. Precipitar a pelota de RNA por centrifugação a 12.000 vezes g por 15 minutos a quatro graus Celsius. Descarte o supernaspeso.Lave a pelota com 70% de etanol e seque a pelota em um capô. Dissolva o RNA em água tratada com pirocarbonato de dietil incubando em um banho de água de 65 graus Celsius por 10 a 20 minutos. Para realizar a análise de manchas do Norte dos níveis de RNA do mensageiro GFP, prepare um gel de agarose de desnatação de formaldeído de 1,2% em 1X MOPS em execução de buffer.Misture o RNA um-a-um com corante de carregamento de RNA e desnaturar o RNA por incubação a 65 graus Celsius por 10 minutos. Esfrie imediatamente as amostras desnaturadas no gelo por um minuto. Com uma pipeta, carregue as amostras nos poços do gel e eletroforese a 100 volts por 50 minutos até que o RNA esteja bem separado.Enxágüe o gel em 20X tampão de citrato de sódio salino para remover o formaldeído. Realize a transferência capilar durante a noite, configurando 20X tampão de citrato de sódio salino, uma camada de papel toalha, duas camadas de papel Whatman molhado, uma camada de gel, uma camada de membrana de nylon, duas camadas de papel Whatman molhado, duas camadas de papel Whatman seco, uma placa de vidro e um peso. Pela manhã, o RNA no gel é transferido para a membrana de nylon.Mergulhe a membrana em 2X citrato de sódio salino e fixe o RNA na membrana expondo a membrana úmida ao crosslinking UV. Prossiga de acordo com o manuscrito. Folhas totalmente desenvolvidas de três a quatro semanas de plantas Nicotiana bethamiana 16c foram co-infiltradas em remendos com misturas de Agrobacterium que transportavam 35S GFP.Aos quatro dias após a infiltração, a fluorescência GFP da área infiltrada foi imagen sob luz natural e luz UV de ondas longas. A mancha norte revelou que o RNA do mensageiro GFP acumulou maior nas folhas expressando 35S GFP mais 35S CMV2b ou 35S GFP mais 35S PSR1 do que nas folhas expressando 35S GFP mais EV. O ensaio de agroinfiltração foi realizado para avaliar a disseminação do sinal de silenciamento nas folhas das mudas Nicotiana bethamiana 16c de duas semanas. Em 14 dias após a infiltração, mais de 98% do EV não apresentava sinalização óbvia de GFP em folhas sistêmicas.Considerando que tanto o CMV2b quanto o PSR1 inibiram eficientemente a propagação sistêmica do sinal de silenciamento. A fluorescência GFP foi observada em cerca de 80% das plantas co-infiltradas e nos 20% restantes das plantas infiltradas com apenas algumas veias vermelhas apareceram em folhas recém-emergidas. Essa técnica abre caminho para os pesquisadores identificarem novos supressores de silenciamento de RNA secretados por muitos patógenos vegetais.A combinação de plantas e o OD adequado é a coisa mais importante a se lembrar ao tentar este procedimento. Após este procedimento, a caracterização funcional do supressor de silenciamento de RNA pode ser feita para explorar o mecanismo de como esses supressores pressionam o silenciamento do RNA do host e qual é a saída. Por favor, use os óculos de segurança quando você se infiltrar nas plantas e também use as luvas de látex durante todas as etapas do experimento.

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetic Manipulation of the Plant Pathogen Ustilago maydis to Study Fungal Biology and Plant Microbe Interactions

Genetic Manipulation of the Plant Pathogen Ustilago maydis to Study Fungal Biology and Plant Microbe Interactions

Manipulação genética do patógeno de planta<em&gt; Ustilago maydis</em&gt; Estudar Biologia fúngicos e vegetais Microbe Interactions

Gene deletion plays an important role in the analysis of gene function. One of the most efficient methods to disrupt genes in a targeted manner is the ...

Genética

Mapping RNA-RNA Interactions Globally Using Biotinylated Psoralen

Mapeando as Interações RNA-ARN Globalmente Usando Psoraleno Biotinilado

Knowing how RNAs interact with themselves and with others is key to understanding RNA based gene regulation in the cell. While examples of RNA-RNA ...

Assessment of DNA Contamination in RNA Samples Based on Ribosomal DNA

Avaliação da contaminação de DNA em amostras de RNA com base no ADN ribossómico

One method extensively used for the quantification of gene expression changes and transcript abundances is reverse-transcription quantitative real-time ...

Purification of High Molecular Weight Genomic DNA from Powdery Mildew for Long-Read Sequencing

Purificação de DNA de alto peso molecular genômico de oídio de longo Read Sequencing

The powdery mildew fungi are a group of economically important fungal plant pathogens. Relatively little is known about the molecular biology and genetics ...

RNA Pull-down Procedure to Identify RNA Targets of a Long Non-coding RNA

Procedimento de Pull-down de RNA para identificar alvos de RNA de um tempo não-codificantes do RNA

Long non-coding RNA (lncRNA), which are sequences of more than 200 nucleotides without a defined reading frame, belong to the regulatory non-coding ...

Exploring the Root Microbiome: Extracting Bacterial Community Data from the Soil, Rhizosphere, and Root Endosphere

Explorando o microbioma da raiz: extraindo dados da comunidade bacteriana do solo

The intimate interaction between plant host and associated microorganisms is crucial in determining plant fitness, and can foster improved tolerance to ...

Generation of Cancer Cell Clones to Visualize Telomeric Repeat-containing RNA TERRA Expressed from a Single Telomere in Living Cells

Geração de Clones de células câncer Visualizar oligospermia Repeat-contendo RNA TERRA expressado de um único dos telômeros em células vivas

Telomeres are transcribed, giving rise to telomeric repeat-containing long noncoding RNAs (TERRA), which have been proposed to play important roles in ...

Identification of Footprints of RNA:Protein Complexes via RNA Immunoprecipitation in Tandem Followed by Sequencing (RIPiT-Seq)

Identification of Footprints of RNA:Protein Complexes via RNA Immunoprecipitation in Tandem Followed by Sequencing RIPiT-Seq

Identificação de pegadas de RNA: complexos proteicos via imunoprecipitação de RNA em tandem seguido de sequenciamento (RIPiT-Seq)

RNA immunoprecipitation in tandem (RIPiT) is a method for enriching RNA footprints of a pair of proteins within an RNA:protein (RNP) complex. RIPiT ...

Identification of Circular RNAs using RNA Sequencing

Identificação de RNAs circulares usando sequenciamento de RNA

Circular RNAs (circRNAs) are a class of non-coding RNAs involved in functions including micro-RNA (miRNA) regulation, mediation of protein-protein ...

A FACS-based Protocol to Isolate RNA from the Secondary Cells of Drosophila Male Accessory Glands

A FACS-based Protocol to Isolate RNA from the Secondary Cells of Drosophila Male Accessory Glands

Um protocolo baseado em FACS para isolar o RNA das células secundárias de glândulas acessórias masculinas de Drosophila

To understand the function of an organ, it is often useful to understand the role of its constituent cell populations. Unfortunately, the rarity of ...