Name: screening and identification of rna silencing suppressors from secreted effectors of plant pathogens
Uploaded: 2020-02-03T14:00:00
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Este trabajo fue apoyado por subvenciones del "Programa Shuguang" de la Fundación para el Desarrollo Educativo de Shanghái y la Comisión Municipal de Educación de Shanghái, el Programa Nacional De Investigación y Desarrollo Clave de China Programa Nacional de I+D Clave de China ( 2018YFD0201500), la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (n.o 31571696 y 31660510), el Programa de Mil Talentos para Jóvenes Profesionales de China, y la Comisión de Ciencia y Tecnología del Municipio de Shanghái (18DZ2260500).

NOTA: Todos los pasos del procedimiento deben realizarse a temperatura ambiente (RT).
ADVERTENCIA: Depositar todos los medios que contengan microbios patógenos, así como las plantas y el tejido vegetal utilizados en el ensayo, en los contenedores de residuos y autoclave apropiados antes de desechar.
1. Preparación de construcciones de plásmidos que contengan efectos putativos
<ol><li>Seleccione los efectores secretos putativos que están altamente expresados d...

<ol>
	<li>Waterfield, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Virulence+Annotation+(RVA):+identification+of+virulence+factors+using+a+bacterial+genome+library+and+multiple+invertebrate+hosts.">Rapid Virulence Annotation (RVA): identification of virulence factors using a bacterial genome library and multiple invertebrate hosts.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (41), 15967-15972 (2008).</li><li>Rovenich, H., Boshoven, J. C., Thomma, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Filamentous+pathogen+effector+functions:+of+pathogens,+hosts+and+microbiomes.">Filamentous pathogen effector functions: of pathogens, hosts and microbiomes.</a> Current Opinion in Plant Biology. 20, 96-103 (2014).</li><li>Varden, F. A., De la Concepcion, J. C., Maidment, J. H., Banfield, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Taking+the+stage:+effectors+in+the+spotlight.">Taking the stage: effectors in the spotlight.</a> Current Opinion in Plant Biology. 38, 25-33 (2017).</li><li>Lee, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+Pseudomonas+syringae+Type+III+Secreted+Effector+Function+via+a+Yeast+Genomic+Screen.">Identifying Pseudomonas syringae Type III Secreted Effector Function via a Yeast Genomic Screen.</a> G3: Genes, Genomes, Genetics. 9 (2), 535-547 (2019).</li><li>Toruno, T. Y., Stergiopoulos, I., Coaker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant-Pathogen+Effectors:+Cellular+Probes+Interfering+with+Plant+Defenses+in+Spatial+and+Temporal+Manners.">Plant-Pathogen Effectors: Cellular Probes Interfering with Plant Defenses in Spatial and Temporal Manners.</a> Annual Review of Phytopathology. 54, 419-441 (2016).</li><li>Baulcombe, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+silencing+in+plants.">RNA silencing in plants.</a> Nature. 431 (7006), 356-363 (2004).</li><li>Pumplin, N., Voinnet, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+silencing+suppression+by+plant+pathogens:+defence,+counter-defence+and+counter-counter-defence.">RNA silencing suppression by plant pathogens: defence, counter-defence and counter-counter-defence.</a> Nature Reviews Microbiology. 11 (11), 745-760 (2013).</li><li>Csorba, T., Kontra, L., Burgyan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+silencing+suppressors:+Tools+forged+to+fine-tune+host-pathogen+coexistence.">Viral silencing suppressors: Tools forged to fine-tune host-pathogen coexistence.</a> Virology. 479-480, 85-103 (2015).</li><li>Johansen, L. 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C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+viral+movement+protein+prevents+spread+of+the+gene+silencing+signal+in+Nicotiana+benthamiana.">A viral movement protein prevents spread of the gene silencing signal in Nicotiana benthamiana.</a> Cell. 103 (1), 157-167 (2000).</li><li>Deleris, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hierarchical+action+and+inhibition+of+plant+Dicer-like+proteins+in+antiviral+defense.">Hierarchical action and inhibition of plant Dicer-like proteins in antiviral defense.</a> Science. 313 (5783), 68-71 (2006).</li><li>Li, W. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferon+antagonist+proteins+of+influenza+and+vaccinia+viruses+are+suppressors+of+RNA+silencing.">Interferon antagonist proteins of influenza and vaccinia viruses are suppressors of RNA silencing.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (5), 1350-1355 (2004).</li><li>Navarro, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+plant+miRNA+contributes+to+antibacterial+resistance+by+repressing+auxin+signaling.">A plant miRNA contributes to antibacterial resistance by repressing auxin signaling.</a> Science. 312 (5772), 436-439 (2006).</li><li>Qiao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oomycete+pathogens+encode+RNA+silencing+suppressors.">Oomycete pathogens encode RNA silencing suppressors.</a> Nature Genetics. 45 (3), 330-333 (2013).</li><li>Yin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+fungal+effector+from+Puccinia+graminis+suppressing+RNA+silencing+and+plant+defense+responses.">A novel fungal effector from Puccinia graminis suppressing RNA silencing and plant defense responses.</a> New Phytologist. 222 (3), 1561-1572 (2019).</li><li>Zhang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+WY+domain+in+the+Phytophthora+effector+PSR1+is+required+for+infection+and+RNA+silencing+suppression+activity.">The WY domain in the Phytophthora effector PSR1 is required for infection and RNA silencing suppression activity.</a> New Phytologist. 223 (2), 839-852 (2019).</li><li>Petersen, T. N., Brunak, S., von Heijne, G., Nielsen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SignalP+4.0:+discriminating+signal+peptides+from+transmembrane+regions.">SignalP 4.0: discriminating signal peptides from transmembrane regions.</a> Nature Methods. 8 (10), 785-786 (2011).</li><li>Earley, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gateway-compatible+vectors+for+plant+functional+genomics+and+proteomics.">Gateway-compatible vectors for plant functional genomics and proteomics.</a> Plant Journal. 45 (4), 616-629 (2006).</li><li>Woodman, M. E., Savage, C. R., Arnold, W. K., Stevenson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+PCR+of+Intact+Bacteria+(Colony+PCR).">Direct PCR of Intact Bacteria (Colony PCR).</a> Current Protocols in Microbiology. 42 (1), 1-7 (2016).</li><li>Cao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+an+RNA+silencing+suppressor+from+a+plant+double-stranded+RNA+virus.">Identification of an RNA silencing suppressor from a plant double-stranded RNA virus.</a> Journal of Virology. 79 (20), 13018-13027 (2005).</li><li>Burgyan, J., Havelda, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+suppressors+of+RNA+silencing.">Viral suppressors of RNA silencing.</a> Trends in Plant Science. 16 (5), 265-272 (2011).</li><li>Incarbone, M., Dunoyer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+silencing+and+its+suppression:+novel+insights+from+in+planta+analyses.">RNA silencing and its suppression: novel insights from in planta analyses.</a> Trends in Plant Science. 18 (7), 382-392 (2013).</li><li>Martinez-Priego, L., Donaire, L., Barajas, D., Llave, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silencing+suppressor+activity+of+the+Tobacco+rattle+virus-encoded+16-kDa+protein+and+interference+with+endogenous+small+RNA-guided+regulatory+pathways.">Silencing suppressor activity of the Tobacco rattle virus-encoded 16-kDa protein and interference with endogenous small RNA-guided regulatory pathways.</a> Virology. 376 (2), 346-356 (2008).</li></ol>

El silenciamiento de ARN es un mecanismo de defensa clave empleado por las plantas para combatir patógenos virales, bacterianos, oomycete y hongos. A su vez, estos microbios han evolucionado las proteínas supresoras de silenciamiento para contrarrestar el silenciamiento antiviral, y estos RSS interfieren con diferentes pasos de la vía de silenciamiento del ARN22,23. Se han desarrollado varios ensayos de cribado para identificar los RSS10.</su...

En las últimas dos décadas, la aceleración en la secuenciación del genoma de microorganismos que causan enfermedades vegetales ha dado lugar a una brecha de conocimiento cada vez mayor entre la información de secuencia y las funciones biológicas de las proteínas codificadas1. Entre las moléculas reveladas por proyectos de secuenciación se encuentran moléculas efectoras que suprimen la inmunidad innata y facilitan la colonización del huésped; estos factores son secretados por patógenos vegetales destructivos, incluyendo bacterias, nematodos y microbios filamentosos. Para responder a estas amenazas, las plantas anfitrionas han desarrollado nuevos receptores que reconocen a estos efectores, permitiendo la restauración de la respuesta inmune. Por lo tanto, los efectores están sujetos a diversas presiones selectivas, lo que conduce a la diversificación de los repertorios de efectores entre los linajes de patógenos2. En los últimos años, se ha demostrado que los efectores putativos de patógenos vegetales de patógenos vegetales interrumpen la inmunidad innata de las plantas al impedir los procesos celulares del huésped para beneficiar a los microbios de diversas maneras, incluyendo la desregulación de las vías de señalización, transcripción, transporte intracelular, estabilidad del citoesqueleto, tráfico de vesículas y silenciamiento de ARN3,4,5. Sin embargo, la gran mayoría de los efectores patógenos, particularmente los de patógenos filamentosos, han permanecido enigmáticos.
El silenciamiento de ARN es una maquinaria de inactivación genética mediada por homología que se conserva entre los eucariotas. El proceso se desencadena por el ARN de doble cadena (dsRNA) y se dirige al ARN homólogo de una sola cadena (ssRNA) de una manera específica de la secuencia, y manipula una amplia gama de procesos biológicos, incluida la defensa antiviral6. Para superar las respuestas inmunitarias innatas del huésped, algunos virus han evolucionado para compensar el silenciamiento del ARN, incluida la capacidad de replicarse dentro de compartimentos intracelulares o escapar de la señal reorganizada de silenciamiento. Sin embargo, la estrategia más general mediante la cual los virus protegen sus genomas contra la pérdida dependiente del ARN dependiente del silenciamiento de la función génica es codificar proteínas específicas que suprimen el silenciamiento del ARN7,8. Se han establecido varios enfoques mecanicistas diferentes para examinar y caracterizar los supresores virales del silenciamiento de ARN (VSR), incluyendo la coinfiltración de cultivos de Agrobacterium tumefaciens, plantas transgénicas que expresan supresores putativos, injertos y cultivo celular9,10,11,12,13.
Cada uno de estos ensayos tiene ventajas y desventajas, e identifica vsR de su propia manera distinta. Uno de los enfoques más comunes se basa en la co-infiltración de cultivos individuales de A. tmuefaciens que albergan la proteína viral potencial y un gen reportero (típicamente proteína fluorescente verde [GFP]) en las plantas de Nicotiana benthamiana 16c que constituyen la expresión de GFP bajo el control del virus de mosaico de coliflor 35S promotor. En ausencia de un supresor de silenciamiento viral activo, GFP es identificado como exógeno por las células huésped y se silencia dentro de los 3 días después de la infiltración (dpi). Por el contrario, si la proteína viral posee actividad de supresión, el nivel de expresión de GFP se mantiene estable más allá de 3 a 9 ppp9. Este ensayo de co-infiltración es simple y rápido; sin embargo, no es altamente estable ni sensible. No obstante, el ensayo ha identificado numerosos VSR con diversas secuencias y estructuras proteicas en muchos virus de ARN7,8.
Recientemente, varias proteínas efectoras que pueden inhibir la actividad de silenciamiento del ARN celular se han caracterizado por patógenos de plantas bacterianas, oomycete y hongos14,15,16. Estos hallazgos implican que la supresión del silenciamiento del ARN es una estrategia común para facilitar la infección que es utilizada por patógenos en la mayoría de los reinos. En teoría, muchos, si no todos, de los efectores podrían codificar los supresores de silenciamiento de ARN (RSS); hasta la fecha, sin embargo, sólo unos pocos han sido identificados, principalmente debido a la escasez de la estrategia de cribado fiable y general. Además, no se han investigado supresores de silenciamiento de ARN en la gran mayoría de los patógenos vegetales17.
En este informe, presentamos un protocolo optimizado y general para identificar los efectores de patógenos vegetales que pueden suprimir el silenciamiento de ARN local y sistémico utilizando el ensayo de infiltración agroindustrial. El objetivo principal de este estudio fue enfatizar los aspectos clave del protocolo y describir los pasos en detalle, proporcionando así un ensayo de cribado que es adecuado para casi todos los efectores de patógenos vegetales.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-Morpholinoethanesulfonic Acid (MES)</td>
			<td>Biofroxx</td>
			<td>1086GR500</td>
			<td>Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2xTaq Master Mix</td>
			<td>Vazyme Biotech</td>
			<td>P112-AA</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-(N-morpholino) propanesulfonic acid (MOPS)</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0264C507-1KG</td>
			<td>MOPS Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetosyringone (AS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D134406-5G</td>
			<td>Induction of Agrobacterium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A1296-1KG</td>
			<td>LB medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Biofroxx</td>
			<td>1110GR100</td>
			<td>Electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amersham Hybond -N+</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>RPN303 B</td>
			<td>Nothern blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amersham Imager</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>Amersham Imager 600</td>
			<td>Image</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Tryptone</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>211705</td>
			<td>LB medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Yeast Extraction</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>212750</td>
			<td>LB medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>D5100</td>
			<td>Photography</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChemiDoc MP Imaging System</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemiluminescent detection module component of dafa kits</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>89880</td>
			<td>Luminescence detection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0230-100G</td>
			<td>Antibiotics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ClonExpress II One Step Cloning Kit</td>
			<td>Vazyme Biotech</td>
			<td>C112-01</td>
			<td>Ligation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DIG Easy Hyb</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>11603558001</td>
			<td>Hybridization buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Easypure Plasmid Miniprep kit</td>
			<td>TransGen Biotech</td>
			<td>EM101-02</td>
			<td>Plasmid Extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasyPure Quick Gel Extraction Kit</td>
			<td>TransGen Biotech</td>
			<td>EG101-02</td>
			<td>Gel Extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA disodium salt dihydrate</td>
			<td>Amresco/VWR</td>
			<td>0105-1KG</td>
			<td>MOPS Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophoresis Power Supply</td>
			<td>LiuYi</td>
			<td>DYY6D</td>
			<td>Nucleic acid electrophoresis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FastDigest EcoRV</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>FD0304</td>
			<td>Vector digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Image System</td>
			<td>Tanon</td>
			<td>Tanon3500</td>
			<td>Image</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamycin</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0304-5G</td>
			<td>Antibiotics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin Sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>K1914</td>
			<td>Antibiotics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LR Clonase II enzyme</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11791020</td>
			<td>LR reaction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulose Blotting membrane 0.45um</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>10600002</td>
			<td>Northern</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NORTH2south biotin random prime dna labeling kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17075</td>
			<td>Biotin labeling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR Thermal Cyclers</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>T100</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peat moss</td>
			<td>PINDSTRUP</td>
			<td>Dark Gold + clay</td>
			<td>Plants</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peters Water-Soluble Fertilizer</td>
			<td>ICE</td>
			<td>Peter Professional 20-20-20</td>
			<td>Fertilizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase</td>
			<td>Vazyme Biotech</td>
			<td>P505-d1</td>
			<td>Enzyme</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rifampicin</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>219549005</td>
			<td>Antibiotics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA Gel Loading Dye (2X)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R0641</td>
			<td>RNA Gel Loading Dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Acetate Hydrate</td>
			<td>Amresco/VWR</td>
			<td>0530-1KG</td>
			<td>MOPS Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0241-10KG</td>
			<td>LB medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tri-Sodium citrate</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0101-1KG</td>
			<td>SSC Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizol Reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15596018</td>
			<td>RNA isolation reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV lamp</td>
			<td>Analytik Jena</td>
			<td>UVP B-100AP</td>
			<td>Observation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UVP Hybrilinker Oven</td>
			<td>Analytik Jena</td>
			<td>OV2000</td>
			<td>Northern</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

screening and identification of rna silencing suppressors from secreted effectors of plant pathogens

El silenciamiento del ARN es un mecanismo de regulación genética evolutivamente conservado y específico de la secuencia en eucariotas. Varios patógenos vegetales han evolucionado proteínas con la capacidad de inhibir la vía de silenciamiento de ARN de la planta huésped. A diferencia de las proteínas efectoras del virus, sólo varias proteínas efectoras secretas han demostrado la capacidad de suprimir el silenciamiento de ARN en patógenos bacterianos, oomicécetos y fúngicos, y las funciones moleculares de la mayoría de los efectores siguen siendo en gran medida desconocidas. Aquí, describimos en detalle una versión ligeramente modificada del ensayo de coinfiltración que podría servir como un método general para observar el silenciamiento del ARN y para caracterizar las proteínas efectoras secretadas por patógenos vegetales. Los pasos clave del enfoque son elegir las hojas sanas y completamente desarrolladas, ajustar el cultivo de bacterias a la densidad óptica (OD) adecuada a 600 nm, y observar la fluorescencia de la proteína fluorescente verde (GFP) en el momento óptimo en el infiltrado hojas con el fin de evitar la omisión de efectos con una actividad de supresión débil. Este protocolo mejorado contribuirá a un cribado rápido, preciso y extenso de los supresores de silenciamiento de ARN y servirá como un excelente punto de partida para investigar las funciones moleculares de estas proteínas.

Arriba, describimos el procedimiento paso a paso para un ensayo de cribado mejorado para evaluar la actividad RSS de los efectores De P. sojae RxLR. En total, el experimento toma de 5 a 6 semanas. Posteriormente, los RSS identificados por el ensayo pueden caracterizarse aún más en términos de función y mecanismo molecular. Como ejemplo de nuestro enfoque, utilizamos el supresor Phytophthora de P. sojae RxLR effecto de silenciamiento de ARN 1 (PSR1), que se secreta y ...

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Screening and Identification of RNA Silencing Suppressors from Secreted Effectors of Plant Pathogens

Aquí, presentamos un método de cribado modificado que se puede utilizar ampliamente para examinar rápidamente los supresores de silenciamiento de ARN en patógenos vegetales.

Detección e identificación de supresores de silenciamiento de ARN de efectos secretos de patógenos vegetales

RNA silencing is an evolutionarily conserved, sequence-specific gene regulation mechanism in eukaryotes. Several plant pathogens have evolved proteins ...

Este método puede ayudar a responder preguntas clave sobre cómo examinar los supresores de silenciamiento de ARN secretados por patógenos vegetales. La principal ventaja de esta técnica es proporcionar un ensayo de cribado rápido, preciso y extenso para la identificación de supresores de silenciamiento de ARN. Preparar mezclas de tierra para macetas que consisten en 50%musgo de turba, 30% de perlita, y 20%vermiculita y autoclave a 120 grados Celsius durante 20 minutos.Remoje las mezclas de suelo autoclaves con la solución de fertilizante vegetal a un gramo por litro y las supaque en macetas más pequeñas almacenadas en una bandeja más grande. Siembre una o dos semillas de Nicotiana bethamiana 16c sobre la superficie del suelo de cada maceta. Cubra la bandeja con una cúpula de plástico y deje que las semillas germinen.Coloque la bandeja bajo cámaras de crecimiento ligeras y controladas por temperatura con una temperatura de 23 a 25 grados centígrados, 50 a 60% de humedad relativa y un fotoperiodo de largo día. Después de tres o cuatro días, las semillas germinan. Quite la cúpula de plástico y deje que las plántulas crezcan en las mismas condiciones utilizadas para el paso de germinación.Cada dos o tres días, añadir una cantidad adecuada de agua manteniendo el suelo húmedo pero no empapado. Cada 10 días, añadir fertilizante para promover un mayor crecimiento. Mantener las plantas de Nicotiana bethamiana 16c en condiciones normales hasta que las plantas tengan al menos cinco hojas verdaderas completamente desarrolladas sin cogollos axilares o florales visibles y las hojas tengan un aspecto verde saludable.Utilice plantas Nicotiana bethamiana 16c de 10 a 14 días de edad para ensayos de silenciamiento de ARN sistémico y hojas de tres a cuatro semanas de edad de Nicotiana bethamiana 16c para ensayos de silenciamiento de ARN local. Utilice una punta para recoger una colonia positiva de la placa LB e inocular las células en un tubo de vidrio que contenga cinco mililitros de medio LB complementado con 50 microgramos por mililitro Kanamicina y 50 microgramos por mililitro Rifampicina. Crecer las células a 30 grados Celsius con temblor a 200 RPM durante 24 a 48 horas.Transfiera 100 microlitros del cultivo a cinco mililitros de medio LB complementados con los mismos antibióticos, 10 MES mililolares a pH 5.6 y 20 micromolarES AS. Cultivar las bacterias a 30 grados celsius con temblores a 200 RPM durante 16 a 20 horas. Centrifugar las células a 4.000 g durante 10 minutos. Deseche el sobrenadante y resuspendir el pellet en dos mililitros de 10 tampones de cloruro de magnesio milimolar.Repita el lavado para garantizar la eliminación completa de los antibióticos. Determinar la densidad del cultivo de Agrobacterium midiendo la densidad óptica a 600 nanómetros. Ajuste el cultivo celular con 10 tampón de cloruro de magnesio mililolar a un OD 600 de 1,5 a 2,0.Añadir 10 MES mililolares a pH 5,6 y 150 micromolarES AS al cultivo de suspensión final e incubar las células a temperatura ambiente durante al menos tres horas sin agitar. Mezclar volúmenes iguales de un cultivo de Agrobacterium que contenga proteína fluorescente verde 35S con un cultivo de Agrobacterium que contenga un supresor de virus de mosaico de pepino 35S 2b, efector putativo o vector vacío. Usando una jeringa sin aguja de un mililitro, infíltrate cuidadosamente y lentamente en las suspensiones mixtas de Agrobacterium en los lados abaxiales de las hojas de Nicotiana bethamiana 16c.Retire la suspensión bacteriana restante de las hojas con toallitas de tejido blando y circule los márgenes de los parches infiltrados con un rotulador. De tres a cuatro días después de la infiltración, utilice una lámpara ultravioleta de onda larga para detectar visualmente la fluorescencia de la GFP en los parches infiltrados de las hojas. Dos semanas después de la infiltración, utilizar la lámpara para detectar hojas recién cultivadas de toda la planta para el silenciamiento sistémico de ARN.Para aislar el ARN total del tejido de la hoja a los cuatro a siete días después de la infiltración, recoja los tejidos de las hojas de los parches de Nicotiana bethamiana 16c infiltrados en un mortero. Coloque nitrógeno líquido en el mortero y muele el tejido en un polvo fino con una varilla de molienda y transfiera el polvo a un tubo estéril de dos mililitros. Añadir inmediatamente el reactivo de aislamiento de ARN al volumen de un mililitro por cada 100 miligramos de tejido al tubo de muestra en una campana, vórtice vigorosamente para homogeneizar, e incubar a temperatura ambiente durante cinco minutos.Añadir cloroformo al volumen de 200 microlitros por mililitro de reactivo de aislamiento de ARN a cada tubo de la campana, agitar vigorosamente durante 15 segundos e incubar a temperatura ambiente durante cinco minutos. Centrifugar el homogeneizar a 12.000 veces g durante 15 minutos a cuatro grados centígrados. Transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo libre de RNase y deseche el pellet.Añadir 0,7 volumen de isopropanol al sobrenadante, invertir suavemente varias veces e incubar la mezcla a temperatura ambiente durante 10 minutos. Precipitar el pellet de ARN por centrifugación a 12.000 veces g durante 15 minutos a cuatro grados centígrados. Deseche el sobrenadante.Lavar el pellet con 70% etanol y secar al aire el pellet en una capucha. Disolver el ARN en agua tratada con pirocarbonato dietil incubando en un baño de agua de 65 grados Celsius durante 10 a 20 minutos. Para realizar el análisis de la mancha del norte de los niveles de ARN mensajero GFP, prepare un gel de agarosa desnaturalización de formaldehído del 1,2%en búfer de funcionamiento 1X MOPS.Mezcle el ARN uno a uno con el tinte de carga de ARN y desnaturalizar el ARN por incubación a 65 grados centígrados durante 10 minutos. Enfríe inmediatamente las muestras desnaturaladas sobre hielo durante un minuto. Con una pipeta, cargue las muestras en los pozos del gel y electroforos a 100 voltios durante 50 minutos hasta que el ARN esté bien separado.Enjuague el gel en un tampón de citrato sódico 20X para eliminar el formaldehído. Realice la transferencia capilar durante la noche mediante la configuración de un tampón de citrato de sodio salino 20X, una capa de toalla de papel, dos capas de papel Whatman húmedo, una capa de gel, una capa de membrana de nylon, dos capas de papel Whatman húmedo, dos capas de papel Whatman seco, una placa de vidrio y un peso. Por la mañana, el ARN del gel se transfiere a la membrana de nylon.Remoje la membrana en citrato de sodio salino 2X y fije el ARN a la membrana exponiendo la membrana húmeda a la reticulación UV. Proceda según el manuscrito. Hojas completamente desarrolladas de tres a cuatro semanas de edad, nicotiana bethamiana 16c, fueron coin infiltradas en parches con mezclas de Agrobacterium que transportaban GFP 35S.A los cuatro días posteriores a la infiltración, la fluorescencia GFP de la zona infiltrada fue imán bajo luz natural y luz UV de onda larga. Northern blot reveló que el ARN mensajero GFP se acumuló más alto en las hojas que expresan 35S GFP más 35S CMV2b o 35S GFP más 35S PSR1 que en las hojas que expresan 35S GFP más EV. Se realizó un ensayo de agroinfiltración para evaluar la propagación de la señal de silenciamiento en las hojas de las plántulas Nicotiana bethamiana 16c de dos semanas de edad. A los 14 días posteriores a la infiltración, más del 98% del EV no exhibió señalización obvia de la GFP en las hojas sistémicas.Mientras que tanto CMV2b como PSR1 inhibió eficientemente la propagación sistémica de la señal de silenciamiento. La fluorescencia de la GFP se observó en aproximadamente el 80% de las plantas coin infiltradas y en el 20% restante de plantas infiltradas con sólo unas pocas venas rojas aparecieron en hojas recién emergidas. Esta técnica allana el camino para que los investigadores identifiquen nuevos supresores de silenciamiento de ARN secretados por muchos patógenos vegetales.La combinación de plantas y la OD adecuada es lo más importante a recordar al intentar este procedimiento. Después de este procedimiento, la caracterización funcional del supresor de silenciamiento de ARN se puede hacer para explorar el mecanismo de cómo estos supresores presionan el silenciamiento del ARN host y cuál es la salida. Por favor, use las gafas de seguridad cuando se infiltre en las plantas y también use los guantes de látex durante todos los pasos del experimento.

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetic Manipulation of the Plant Pathogen Ustilago maydis to Study Fungal Biology and Plant Microbe Interactions

Genetic Manipulation of the Plant Pathogen Ustilago maydis to Study Fungal Biology and Plant Microbe Interactions

La manipulación genética del patógeno de la planta<em&gt; Ustilago maydis</em&gt; Estudiar biología de hongos y plantas Microbe Interactions

Gene deletion plays an important role in the analysis of gene function. One of the most efficient methods to disrupt genes in a targeted manner is the ...

Investigación

Genética

Mapping RNA-RNA Interactions Globally Using Biotinylated Psoralen

Mapeo de las interacciones RNA-ARN a nivel mundial usando Psoralen Biotinilado

Knowing how RNAs interact with themselves and with others is key to understanding RNA based gene regulation in the cell. While examples of RNA-RNA ...

Assessment of DNA Contamination in RNA Samples Based on Ribosomal DNA

Evaluación de la contaminación del ADN en las muestras de RNA basadas en ADN Ribosomal

One method extensively used for the quantification of gene expression changes and transcript abundances is reverse-transcription quantitative real-time ...

Purification of High Molecular Weight Genomic DNA from Powdery Mildew for Long-Read Sequencing

Purificación de ADN de alto peso molecular genómico de oídio para Long-Read Sequencing

The powdery mildew fungi are a group of economically important fungal plant pathogens. Relatively little is known about the molecular biology and genetics ...

RNA Pull-down Procedure to Identify RNA Targets of a Long Non-coding RNA

Procedimiento de ARN Pull-down para identificar dianas de ARN de un ARN largo no codificante

Long non-coding RNA (lncRNA), which are sequences of more than 200 nucleotides without a defined reading frame, belong to the regulatory non-coding ...

Exploring the Root Microbiome: Extracting Bacterial Community Data from the Soil, Rhizosphere, and Root Endosphere

Explorar el microbioma de la raíz: extracción de datos de la comunidad bacteriana del suelo, rizosfera y raíz Endosphere

The intimate interaction between plant host and associated microorganisms is crucial in determining plant fitness, and can foster improved tolerance to ...

Generation of Cancer Cell Clones to Visualize Telomeric Repeat-containing RNA TERRA Expressed from a Single Telomere in Living Cells

Generación de Clones de células de cáncer para visualizar que contiene la repetición telomérica ARN TERRA de un telómero solo en las células vivas

Telomeres are transcribed, giving rise to telomeric repeat-containing long noncoding RNAs (TERRA), which have been proposed to play important roles in ...

Identification of Footprints of RNA:Protein Complexes via RNA Immunoprecipitation in Tandem Followed by Sequencing (RIPiT-Seq)

Identification of Footprints of RNA:Protein Complexes via RNA Immunoprecipitation in Tandem Followed by Sequencing RIPiT-Seq

Identificación de Huellas de ARN:Complejos proteicos a través de la inmunoprecipitación de ARN en tándem seguido de secuenciación (RIPiT-Seq)

RNA immunoprecipitation in tandem (RIPiT) is a method for enriching RNA footprints of a pair of proteins within an RNA:protein (RNP) complex. RIPiT ...

Identification of Circular RNAs using RNA Sequencing

Identificación de ARN circulares mediante secuenciación de ARN

Circular RNAs (circRNAs) are a class of non-coding RNAs involved in functions including micro-RNA (miRNA) regulation, mediation of protein-protein ...

A FACS-based Protocol to Isolate RNA from the Secondary Cells of Drosophila Male Accessory Glands

A FACS-based Protocol to Isolate RNA from the Secondary Cells of Drosophila Male Accessory Glands

Un protocolo basado en FACS para aislar el ARN de las células secundarias de Drosophila Male Accessory Glands

To understand the function of an organ, it is often useful to understand the role of its constituent cell populations. Unfortunately, the rarity of ...