Name: screening and identification of rna silencing suppressors from secreted effectors of plant pathogens
Uploaded: 2020-02-03T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Screening and Identification of RNA Silencing Suppressors from Secreted Effectors of Plant Pathogens at JoVE.com

Bu çalışma Şangay Eğitim Geliştirme Vakfı ve Şangay Belediye Eğitim Komisyonu, Çin Ulusal Anahtar Ar-Ge Programı Ulusal Anahtar Ar-Ge Programı "Shuguang Programı" hibe tarafından desteklenmiştir ( 2018YFD0201500), Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (no. 31571696 ve 31660510), Çin Genç Profesyoneller için Bin Yetenek Programı ve Şangay Belediyesi Bilim ve Teknoloji Komisyonu (18DZ2260500).

NOT: Prosedürün tüm adımları oda sıcaklığında (RT) yapılmalıdır.
DİkKAT: Patojen mikroplar içeren tüm ortamların yanı sıra, tetkikte kullanılan bitki ve bitki dokusunu, atmadan önce uygun atık kaplarına ve otoklava yatırın.
1. Putatif efektörler içeren plazmid yapılarının hazırlanması
<ol><li>RNA dizilimi (RNA-Seq) tarafından ve daha nicel gerçek zamanlı PCR (qRT-PCR) tekniği ile belirlendiği gibi, enfeksiyon sırasında yüksek...

<ol>
	<li>Waterfield, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Virulence+Annotation+(RVA):+identification+of+virulence+factors+using+a+bacterial+genome+library+and+multiple+invertebrate+hosts.">Rapid Virulence Annotation (RVA): identification of virulence factors using a bacterial genome library and multiple invertebrate hosts.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (41), 15967-15972 (2008).</li><li>Rovenich, H., Boshoven, J. C., Thomma, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Filamentous+pathogen+effector+functions:+of+pathogens,+hosts+and+microbiomes.">Filamentous pathogen effector functions: of pathogens, hosts and microbiomes.</a> Current Opinion in Plant Biology. 20, 96-103 (2014).</li><li>Varden, F. A., De la Concepcion, J. C., Maidment, J. H., Banfield, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Taking+the+stage:+effectors+in+the+spotlight.">Taking the stage: effectors in the spotlight.</a> Current Opinion in Plant Biology. 38, 25-33 (2017).</li><li>Lee, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+Pseudomonas+syringae+Type+III+Secreted+Effector+Function+via+a+Yeast+Genomic+Screen.">Identifying Pseudomonas syringae Type III Secreted Effector Function via a Yeast Genomic Screen.</a> G3: Genes, Genomes, Genetics. 9 (2), 535-547 (2019).</li><li>Toruno, T. Y., Stergiopoulos, I., Coaker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant-Pathogen+Effectors:+Cellular+Probes+Interfering+with+Plant+Defenses+in+Spatial+and+Temporal+Manners.">Plant-Pathogen Effectors: Cellular Probes Interfering with Plant Defenses in Spatial and Temporal Manners.</a> Annual Review of Phytopathology. 54, 419-441 (2016).</li><li>Baulcombe, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+silencing+in+plants.">RNA silencing in plants.</a> Nature. 431 (7006), 356-363 (2004).</li><li>Pumplin, N., Voinnet, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+silencing+suppression+by+plant+pathogens:+defence,+counter-defence+and+counter-counter-defence.">RNA silencing suppression by plant pathogens: defence, counter-defence and counter-counter-defence.</a> Nature Reviews Microbiology. 11 (11), 745-760 (2013).</li><li>Csorba, T., Kontra, L., Burgyan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+silencing+suppressors:+Tools+forged+to+fine-tune+host-pathogen+coexistence.">Viral silencing suppressors: Tools forged to fine-tune host-pathogen coexistence.</a> Virology. 479-480, 85-103 (2015).</li><li>Johansen, L. K., Carrington, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silencing+on+the+spot.+Induction+and+suppression+of+RNA+silencing+in+the+Agrobacterium-mediated+transient+expression+system.">Silencing on the spot. Induction and suppression of RNA silencing in the Agrobacterium-mediated transient expression system.</a> Plant Physiology. 126 (3), 930-938 (2001).</li><li>Powers, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+assay+for+the+identification+of+RNA+silencing+suppressors+based+on+complementation+of+viral+movement.">A versatile assay for the identification of RNA silencing suppressors based on complementation of viral movement.</a> Molecular Plant-Microbe Interactions. 21 (7), 879-890 (2008).</li><li>Voinnet, O., Lederer, C., Baulcombe, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+viral+movement+protein+prevents+spread+of+the+gene+silencing+signal+in+Nicotiana+benthamiana.">A viral movement protein prevents spread of the gene silencing signal in Nicotiana benthamiana.</a> Cell. 103 (1), 157-167 (2000).</li><li>Deleris, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hierarchical+action+and+inhibition+of+plant+Dicer-like+proteins+in+antiviral+defense.">Hierarchical action and inhibition of plant Dicer-like proteins in antiviral defense.</a> Science. 313 (5783), 68-71 (2006).</li><li>Li, W. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferon+antagonist+proteins+of+influenza+and+vaccinia+viruses+are+suppressors+of+RNA+silencing.">Interferon antagonist proteins of influenza and vaccinia viruses are suppressors of RNA silencing.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (5), 1350-1355 (2004).</li><li>Navarro, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+plant+miRNA+contributes+to+antibacterial+resistance+by+repressing+auxin+signaling.">A plant miRNA contributes to antibacterial resistance by repressing auxin signaling.</a> Science. 312 (5772), 436-439 (2006).</li><li>Qiao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oomycete+pathogens+encode+RNA+silencing+suppressors.">Oomycete pathogens encode RNA silencing suppressors.</a> Nature Genetics. 45 (3), 330-333 (2013).</li><li>Yin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+fungal+effector+from+Puccinia+graminis+suppressing+RNA+silencing+and+plant+defense+responses.">A novel fungal effector from Puccinia graminis suppressing RNA silencing and plant defense responses.</a> New Phytologist. 222 (3), 1561-1572 (2019).</li><li>Zhang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+WY+domain+in+the+Phytophthora+effector+PSR1+is+required+for+infection+and+RNA+silencing+suppression+activity.">The WY domain in the Phytophthora effector PSR1 is required for infection and RNA silencing suppression activity.</a> New Phytologist. 223 (2), 839-852 (2019).</li><li>Petersen, T. N., Brunak, S., von Heijne, G., Nielsen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SignalP+4.0:+discriminating+signal+peptides+from+transmembrane+regions.">SignalP 4.0: discriminating signal peptides from transmembrane regions.</a> Nature Methods. 8 (10), 785-786 (2011).</li><li>Earley, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gateway-compatible+vectors+for+plant+functional+genomics+and+proteomics.">Gateway-compatible vectors for plant functional genomics and proteomics.</a> Plant Journal. 45 (4), 616-629 (2006).</li><li>Woodman, M. E., Savage, C. R., Arnold, W. K., Stevenson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+PCR+of+Intact+Bacteria+(Colony+PCR).">Direct PCR of Intact Bacteria (Colony PCR).</a> Current Protocols in Microbiology. 42 (1), 1-7 (2016).</li><li>Cao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+an+RNA+silencing+suppressor+from+a+plant+double-stranded+RNA+virus.">Identification of an RNA silencing suppressor from a plant double-stranded RNA virus.</a> Journal of Virology. 79 (20), 13018-13027 (2005).</li><li>Burgyan, J., Havelda, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+suppressors+of+RNA+silencing.">Viral suppressors of RNA silencing.</a> Trends in Plant Science. 16 (5), 265-272 (2011).</li><li>Incarbone, M., Dunoyer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+silencing+and+its+suppression:+novel+insights+from+in+planta+analyses.">RNA silencing and its suppression: novel insights from in planta analyses.</a> Trends in Plant Science. 18 (7), 382-392 (2013).</li><li>Martinez-Priego, L., Donaire, L., Barajas, D., Llave, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silencing+suppressor+activity+of+the+Tobacco+rattle+virus-encoded+16-kDa+protein+and+interference+with+endogenous+small+RNA-guided+regulatory+pathways.">Silencing suppressor activity of the Tobacco rattle virus-encoded 16-kDa protein and interference with endogenous small RNA-guided regulatory pathways.</a> Virology. 376 (2), 346-356 (2008).</li></ol>

RNA susturma viral, bakteriyel, oomycete ve mantar patojenleri ile mücadele için bitkiler tarafından kullanılan önemli bir savunma mekanizmasıdır. Buna karşılık, bu mikroplar antiviral susturma karşı susturucu proteinleri susturma evrimleşmiş, ve bu RSSs RNA susturma yolu farklı adımları ile müdahale22,23. RSSS10'utanımlamak için çeşitli tarama denemeleri geliştirilmiştir.
Burada, P. ...

Son yirmi yılda, bitki hastalıklarına neden olan mikroorganizmaların genom dizilimindeki ivme, dizi bilgileri ile kodlanmış proteinlerin biyolojik işlevleri arasında giderek artan bir bilgi boşluğuna yol açmıştır1. Sıralama projelerinin ortaya çıkardığı moleküller arasında doğuştan gelen bağışıklığı baskılayan ve konak kolonizasyonunu kolaylaştıran efektör moleküller; bu faktörler bakteriler, nematodlar ve ipliksi mikroplar da dahil olmak üzere yıkıcı bitki patojenleri tarafından salgılanır. Bu tehditlere yanıt vermek için, konak bitkiler bu efektörleri tanıyan yeni reseptörler gelişti, bağışıklık yanıtının restorasyonu sağlayan. Bu nedenle, efektörler çeşitli seçici baskılara tabidir, patojen soyları arasında efektör repertoireçeşitlenmesine yol açan2. Son yıllarda, bitki patojenleri putatif etkileri sinyal yollarının disregülasyonu da dahil olmak üzere çeşitli şekillerde mikroplar yararına konak hücresel süreçleri engelleyerek bitki doğuştan bağışıklık bozmak için gösterilmiştir, transkripsiyon, hücre içi ulaşım, sitoiskelet istikrar, vezikül ticareti, vezikül ticareti, ve RNA silele3,4,5. Ancak, patojen efektörlerin büyük çoğunluğu, özellikle filamentöz patojenler olanlar, esrarengiz kalmıştır.
RNA susturma ökaryotlar arasında korunan homoloji aracılı gen inaktivasyon makinalarıdır. Süreç uzun çift telli RNA (dsRNA) tarafından tetiklenir ve homolog tek iplikçikli RNA (ssRNA) bir dizi özgü bir şekilde hedefler ve antiviralsavunma6 dahil biyolojik süreçlerin geniş bir yelpazede manipüle. Konakçının doğuştan gelen bağışıklık tepkilerini aşmak için, bazı virüsler RNA'nın susturulmasını dengelemek için evrimleşmiştir, hücre içi bölmelerde çoğalma veya susturma yeniden organize edilmiş sinyalden kaçma yeteneği de dahil olmak üzere. Bununla birlikte, virüslerin genomlarını RNA susturma bağımlı gen fonksiyonu kaybına karşı korumaları en genel strateji, RNA'yı susturan spesifik proteinleri kodlamaktır7,8. Çeşitli mekanistik farklı yaklaşımlar ekran ve RNA susturucu viral bastırıcılar karakterize kurulmuştur (VSR), Agrobacterium tumefaciens kültürlerin co-infiltrasyon dahil, putatif bastırıcılar ifade transgenik bitkiler, aşılama ve hücre kültürü9,10,11,12,13.
Bu tahlillerin her biri avantajları ve dezavantajları vardır ve VsR'ları kendi farklı bir şekilde tanımlar. En yaygın yaklaşımlardan biri, Nicotiana benthamiana 16c bitkileri üzerinde potansiyel viral protein ve muhabir gen (genellikle yeşil floresan protein [GFP]) barındıran bireysel A. tmuefaciens kültürlerin eş-infiltrasyon dayanmaktadır eş selabahar mozaik virüs 35S organizatörü kontrolü altında GFP ifade. Aktif bir viral susturucu baskılayıcı yokluğunda, GFP konak hücreleri tarafından eksojen olarak tanımlanır ve 3 gün post-infiltrasyon (dpi) içinde susturulur. Buna karşılık, viral protein bastırma aktivitesi varsa, GFP ifade düzeyi 3−9 dpi9ötesinde sabit kalır. Bu ortak infiltrasyon tsay basit ve hızlı; ancak, ne son derece kararlı ne de hassas. Yine de, titreyen birçok RNA virüsleri çeşitli protein dizileri ve yapıları ile çok sayıda VSR tespit etmiştir7,8.
Son zamanlarda, hücresel RNA susturma aktivitesiinin inhibe edebilirsiniz çeşitli efektör proteinler bakteriyel karakterize edilmiştir, oomisin, ve mantar bitkisi patojenler14,15,16. Bu bulgular, RNA susturma bastırma çoğu krallıkta patojenler tarafından kullanılan enfeksiyonu kolaylaştırmak için ortak bir strateji olduğunu ima eder. Teoride, birçok, hepsi değilse de, efektörlerr rna susturucular (RSSs) kodlamak olabilir; ancak bugüne kadar, özellikle güvenilir ve genel tarama stratejisinin yetersizliği nedeniyle sadece birkaç ı tespit edilmiştir. Ayrıca, Bitki patojenlerinin büyük çoğunluğunda RNA susturucuları araştırılmamıştır17.
Bu raporda, tarımsal infiltrasyon testini kullanarak lokal ve sistemik RNA susturmalarını bastırabilen bitki patojen efektörlerini belirlemek için optimize edilmiş ve genel bir protokol sunacağız. Bu çalışmanın en önemli amacı protokolün temel yönlerini vurgulamak ve adımları ayrıntılı olarak açıklamak, böylece bitki patojenlerinin hemen hemen tüm etkileri için uygun bir tarama testsağlamaktı.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-Morpholinoethanesulfonic Acid (MES)</td>
			<td>Biofroxx</td>
			<td>1086GR500</td>
			<td>Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2xTaq Master Mix</td>
			<td>Vazyme Biotech</td>
			<td>P112-AA</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-(N-morpholino) propanesulfonic acid (MOPS)</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0264C507-1KG</td>
			<td>MOPS Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetosyringone (AS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D134406-5G</td>
			<td>Induction of Agrobacterium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A1296-1KG</td>
			<td>LB medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Biofroxx</td>
			<td>1110GR100</td>
			<td>Electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amersham Hybond -N+</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>RPN303 B</td>
			<td>Nothern blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amersham Imager</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>Amersham Imager 600</td>
			<td>Image</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Tryptone</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>211705</td>
			<td>LB medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Yeast Extraction</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>212750</td>
			<td>LB medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>D5100</td>
			<td>Photography</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChemiDoc MP Imaging System</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemiluminescent detection module component of dafa kits</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>89880</td>
			<td>Luminescence detection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0230-100G</td>
			<td>Antibiotics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ClonExpress II One Step Cloning Kit</td>
			<td>Vazyme Biotech</td>
			<td>C112-01</td>
			<td>Ligation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DIG Easy Hyb</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>11603558001</td>
			<td>Hybridization buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Easypure Plasmid Miniprep kit</td>
			<td>TransGen Biotech</td>
			<td>EM101-02</td>
			<td>Plasmid Extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasyPure Quick Gel Extraction Kit</td>
			<td>TransGen Biotech</td>
			<td>EG101-02</td>
			<td>Gel Extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA disodium salt dihydrate</td>
			<td>Amresco/VWR</td>
			<td>0105-1KG</td>
			<td>MOPS Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophoresis Power Supply</td>
			<td>LiuYi</td>
			<td>DYY6D</td>
			<td>Nucleic acid electrophoresis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FastDigest EcoRV</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>FD0304</td>
			<td>Vector digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Image System</td>
			<td>Tanon</td>
			<td>Tanon3500</td>
			<td>Image</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamycin</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0304-5G</td>
			<td>Antibiotics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin Sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>K1914</td>
			<td>Antibiotics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LR Clonase II enzyme</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11791020</td>
			<td>LR reaction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulose Blotting membrane 0.45um</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>10600002</td>
			<td>Northern</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NORTH2south biotin random prime dna labeling kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17075</td>
			<td>Biotin labeling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR Thermal Cyclers</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>T100</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peat moss</td>
			<td>PINDSTRUP</td>
			<td>Dark Gold + clay</td>
			<td>Plants</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peters Water-Soluble Fertilizer</td>
			<td>ICE</td>
			<td>Peter Professional 20-20-20</td>
			<td>Fertilizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase</td>
			<td>Vazyme Biotech</td>
			<td>P505-d1</td>
			<td>Enzyme</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rifampicin</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>219549005</td>
			<td>Antibiotics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA Gel Loading Dye (2X)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R0641</td>
			<td>RNA Gel Loading Dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Acetate Hydrate</td>
			<td>Amresco/VWR</td>
			<td>0530-1KG</td>
			<td>MOPS Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0241-10KG</td>
			<td>LB medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tri-Sodium citrate</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0101-1KG</td>
			<td>SSC Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizol Reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15596018</td>
			<td>RNA isolation reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV lamp</td>
			<td>Analytik Jena</td>
			<td>UVP B-100AP</td>
			<td>Observation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UVP Hybrilinker Oven</td>
			<td>Analytik Jena</td>
			<td>OV2000</td>
			<td>Northern</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

screening and identification of rna silencing suppressors from secreted effectors of plant pathogens

RNA susturma ökaryotlarda evrimsel olarak korunmuş, diziye özgü gen düzenleme mekanizmasıdır. Çeşitli bitki patojenleri konak bitki RNA susturma yolu inhibe yeteneği ile proteinler gelişti. Virüs efektörü proteinlerinin aksine, sadece birkaç salgılanan efektör proteinbakteriyel, oomisel ve mantar patojenlerinde RNA susturma yeteneğini göstermiştir ve çoğu efektörmoleküler fonksiyonları büyük ölçüde bilinmemektedir. Burada, rna susturma gözlemlemek ve bitki patojenleri tarafından salgılanan efektör proteinleri karakterize etmek için genel bir yöntem olarak hizmet verebilecek ortak infiltrasyon tsay'ın biraz değiştirilmiş bir versiyonunu ayrıntılı olarak açıklıyoruz. Yaklaşımın temel adımları sağlıklı ve tam olarak gelişmiş yaprakları seçmek, bakteri kültürünü 600 nm'de uygun optik yoğunluğa (OD) ayarlamak ve sızmış olan da optimum zamanda yeşil floresan proteini (GFP) floresanını gözlemlemektir. zayıf bastırma aktivitesi ile etkileri atlayarak önlemek için bırakır. Bu geliştirilmiş protokol, RNA susturucu baskılayıcıların hızlı, doğru ve kapsamlı taranmasına katkıda bulunacak ve bu proteinlerin moleküler işlevlerini araştırmak için mükemmel bir başlangıç noktası olarak hizmet verecektir.

Yukarıda, P. sojae RxLR efektörlerinin RSS aktivitesini değerlendirmek için geliştirilmiş bir tarama tetkik için adım adım prosedürü açıklıyoruz. Deney toplamda 5−6 hafta sürer. Daha sonra, tetkik ile tanımlanan RSSs daha fonksiyon ve moleküler mekanizma açısından karakterize edilebilir. Yaklaşımımıza örnek olarak, enfeksiyon sırasında haustoria yoluyla salgılanan ve konak hücrelere teslim edilen RNA susturucu 1 'in (PSR1) P. sojae RxLR eff...

Watch this Scientific Journal Video about Screening and Identification of RNA Silencing Suppressors from Secreted Effectors of Plant Pathogens at JoVE.com

Screening and Identification of RNA Silencing Suppressors from Secreted Effectors of Plant Pathogens

Burada, bitki patojenlerinde RNA susturucularını hızlı bir şekilde taramak için yaygın olarak kullanılabilecek değiştirilmiş bir tarama yöntemi salıyoruz.

Bitki Patojenlerinin Gizli Efektörlerinden RNA Susturucu Baskılayıcıların Taranması ve Tanımlanması

RNA silencing is an evolutionarily conserved, sequence-specific gene regulation mechanism in eukaryotes. Several plant pathogens have evolved proteins ...

Bu yöntem, bitki patojenleri tarafından salgılanan RNA susturucuları ekran hakkında anahtar soruları cevaplamak için yardımcı olabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı, RNA susturucuları tanımlaması için hızlı, doğru ve kapsamlı bir tarama testi sağlamaktır. 20 dakika boyunca 120 santigrat derecede %50 turba yosunu, %30 perlit ve %20 vermikülit ve otoklavdan oluşan çömlekçilik toprak karışımlarını hazırlayın.Otoklavlı toprağın litrebaşına bir gram bitki gübresi çözeltisi ile karıştırılması ve daha büyük bir tepside saklanan daha küçük kaplara paketleyin. Her potun toprak yüzeyine Nicotiana bethamiana 16c bir veya iki tohum ekin. Plastik bir kubbe ile tepsi kapağı ve tohumlar çimlenmesağlar.Tepsiyi 23 ila 25 derece sıcaklık, %50 ila %60 bağıl nem ve uzun bir günlük fotoperi ile ışık ve sıcaklık kontrollü büyüme odalarının altına yerleştirin. 3-4 gün sonra tohumlar çimlenir. Plastik kubbeyi çıkarve fidelerin çimlenme adımında kullanılan koşullarda büyümesini bekleyin.Her 2-3 günde bir, uygun miktarda su ekleyin toprağı nemli tutarak ama ıslatmamayı. Her 10 günde bir, daha fazla büyüme teşvik etmek için gübre ekleyin. Bitkiler görünür aksilla veya çiçek tomurcukları ile en az beş tam gelişmiş gerçek yaprakları ve yaprakları sağlıklı bir yeşil görünüme sahip olana kadar normal şartlar altında Nicotiana bethamiana 16c bitkiler koruyun.Sistemik RNA susturma tahlilleri ve yerel RNA susturma tahlilleri için Nicotiana bethamiana 16c'nin 3-4 haftalık yaprakları için 10 ila 14 günlük Nicotiana bethamiana 16c bitkilerini kullanın. LB plaka olumlu bir koloni almak ve mililitre Kanamisin başına 50 mikrogram ve mililitre Rifampicin başına 50 mikrogram ile desteklenen LB orta beş mililitre içeren bir cam tüp içine hücreleri aşılamak için bir ipucu kullanın. 24 ila 48 saat boyunca 200 RPM sallayarak 30 santigrat derecede hücreleri büyütün.Aynı antibiyotikler ile desteklenen LB orta beş mililitre içine kültürün 100 mikrolitre transfer, pH 10 milimolar MES 5.6, ve 20 mikromolar AS. 16 ila 20 saat boyunca 200 RPM sallayarak 30 santigrat derecede bakteri büyümek. Hücreleri 4,000 kez g'de 10 dakika santrifüj edin. Supernatant atın ve 10 milimolar magnezyum klorür tampon iki mililitre pelet resuspend.Antibiyotiklerin tamamen çıkarılmasını sağlamak için yıkamayı tekrarlayın. 600 nanometre optik yoğunluğu ölçerek Agrobacterium kültürünün yoğunluğunu belirleyin. 10 milimolar magnezyum klorür tampon ile hücre kültürünü 1,5 ila 2,0 od 600 ayarlayın.Son süspansiyon kültürüne pH 5.6 ve 150 mikromolar AS'de 10 milimolar MES ekleyin ve hücreleri en az üç saat boyunca sallayarak oda sıcaklığında kuluçkaya yatırın. 35S yeşil floresan protein içeren bir Agrobacterium kültürünün eşit hacimli lerini 35S salatalık mozaik virüs bastırıcı 2b, putatif efektör veya boş vektör içeren bir Agrobacterium kültürü ile karıştırın. Bir mililitre iğnesiz şırınga kullanarak, dikkatle ve yavaş yavaş Nicotiana bethamiana 16c yapraklarının eksenel tarafında karışık Agrobacterium süspansiyonlar sızma.Yumuşak doku mendilleri ile yapraklarıkalan bakteriyel süspansiyon çıkarın ve bir marker kalem ile sızmış yamalar marjları daire. Üç ila dört gün post-infiltrasyon, görsel yaprakların sızmış yamalar GFP floresan tespit etmek için uzun bir dalga ultraviyole lamba kullanın. İki hafta sonra infiltrasyon, sistemik RNA susturma için tüm bitkinin yeni yetişen yaprakları tespit etmek için lamba kullanın.Toplam RNA'yı yaprak dokusundan 4-7 gün sonra infiltrasyondan izole etmek için, sızmış Nicotiana bethamiana 16c yamaları bir harç içine yaprak dokuları toplamak. Harç içine sıvı nitrojen yerleştirin ve bir taşlama çubuğu ile ince bir toz içine doku eziyet ve steril bir iki mililitretüp için toz aktarın. RNA izolasyon reaktifini 100 miligramlık doku başına bir mililitre hacmine bir başlıktaki örnek tüpe, homojenate girdap ve oda sıcaklığında beş dakika kuluçkaya yatırın.Kaputtaki her tüpe bir mililitre RNA izolasyon reaktifi başına 200 mikrolitre lik hacimde kloroform ekleyin, 15 saniye boyunca şiddetle çalkalayın ve oda sıcaklığında beş dakika kuluçkaya yatın. Homojeni 12,000 kez g'de 15 dakika 4 santigrat derecede santrifüj edin. Supernatant'ı yeni bir RNase-free tüpüne aktarın ve peleti atın.Supernatant için 0,7 hacimli isopropanol ekleyin, yavaşça birkaç kez ters, ve oda sıcaklığında karışımı kuluçka 10 dakika. RNA peletini 12,000 kez g'de 4 santigrat derecede 15 dakika santrifüj ile çökeltin. Supernatant atın.Peleti %70 etanol ile yıkayın ve peleti bir başlıkta hava kurutun. 10 ila 20 dakika boyunca 65 derece santigrat su banyosunda kuluçka yada katarak metil pirokarbonat arıtılmış suda RNA çözün. GFP messenger RNA düzeylerinin Kuzey leke analizini gerçekleştirmek için, 1X MOPS çalışan tampon bir% 1.2 formaldehit denaturing agarose jel hazırlamak.RNA'yı bire bir, RNA yükleme boyasıyla karıştırın ve RNA'yı 65 derecede 10 dakika kuluçkaya yatarak denatüre edin. Denatüre edilmiş örnekleri buzüzerinde bir dakika soğutun. Bir pipet ile, RNA iyi ayrılana kadar 50 dakika boyunca 100 volt jel ve elektroforkuyuiçine örnekleri yükleyin.Formaldehit kaldırmak için 20X tuzlu sodyum sitrat tampon içine jel durulamak. 20X tuzlu sodyum sitrat tampon, kağıt havlu bir tabaka, ıslak Whatman kağıt, jel bir tabaka, naylon membran bir tabaka, ıslak Whatman kağıt iki kat, kuru Whatman kağıt, bir cam plaka ve bir ağırlık iki kat kurarak bir gecede kılcal transfer gerçekleştirin. Sabah, jel RNA naylon membran aktarılır.Membranı 2X tuzlu sodyum sitratta ıslatın ve ıslak membranı UV crosslinking'e maruz bırakarak RNA'yı membrana sabitleyin. El yazmasına göre devam et. Üç ila dört haftalık Nicotiana bethamiana 16c bitkilerin tam gelişmiş yaprakları 35S GFP taşıyan Agrobacterium karışımları ile yamalar halinde co-sızmış edildi.Dört gün sonra infiltrasyon sonrası, sızmış alanın GFP floresan doğal ışık ve uzun dalga UV ışığı altında görüntülendi. Kuzey leke GFP messenger RNA 35S GFP artı 35S CMV2b veya 35S GFP artı 35S PSR1 ifade yaprakları 35S GFP artı EV ifade daha yüksek birikmiş olduğunu ortaya koymuştur. İki haftalık Nicotiana bethamiana 16c fidelerinin yapraklarındaki susturma sinyalinin yayılmasını değerlendirmek için tarımsal filtrasyon analizi yapıldı. 14 gün sonra infiltrasyon sonrası, EV fazla% 98 sistemik yapraklarıbelirgin GFP sinyal gösterdi.CmV2b ve PSR1 ise susturma sinyalinin sistemik yayılmasını etkin bir şekilde inhibe etti. GFP floresansı ortak sızmış bitkilerin yaklaşık %80'inde gözlendi ve yeni ortaya çıkan yapraklarda sadece birkaç kırmızı damar bulunan sızmış bitkilerin geri kalan %20'sinde gözlendi. Bu teknik, araştırmacıların birçok bitki patojeni tarafından salgılanan yeni RNA susturma baskılayıcılarını belirlemelerinin önünü açıyor.Bitkilerin kombinasyonu ve uygun OD bu prosedürü çalışırken hatırlanması gereken en önemli şeydir. Bu yordamı takiben, RNA susturucunun fonksiyonel karakterizasyonu, bu bastırıcıların ana bilgisayar RNA susturucuya nasıl bastığının ve çıktının ne olduğunu araştırmak için yapılabilir. Lütfen bitkilere sızdığınızda güvenlik gözlüklerini takın ve tüm deneme adımları sırasında lateks eldivenleri de giyin.

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetic Manipulation of the Plant Pathogen Ustilago maydis to Study Fungal Biology and Plant Microbe Interactions

Genetic Manipulation of the Plant Pathogen Ustilago maydis to Study Fungal Biology and Plant Microbe Interactions

Bitki patojeni olarak genetik manipülasyonu<em&gt; Ustilago maydis</em&gt; Mantar Biyoloji ve Bitki Mikrop Etkileşimleri Eğitim için

Gene deletion plays an important role in the analysis of gene function. One of the most efficient methods to disrupt genes in a targeted manner is the ...

Mapping RNA-RNA Interactions Globally Using Biotinylated Psoralen

RNA-RNA Etkileşmelerini Biyotinlenmiş Psooren Kullanarak Küresel Olarak Haritalama

Knowing how RNAs interact with themselves and with others is key to understanding RNA based gene regulation in the cell. While examples of RNA-RNA ...

Assessment of DNA Contamination in RNA Samples Based on Ribosomal DNA

DNA kirlenme ribozomal DNA tabanlı RNA örneklerinde değerlendirilmesi

One method extensively used for the quantification of gene expression changes and transcript abundances is reverse-transcription quantitative real-time ...

Purification of High Molecular Weight Genomic DNA from Powdery Mildew for Long-Read Sequencing

Uzun Okuma Dizi Yapmak İçin Küllemesi Yüksek Moleküler Ağırlık Genomik DNA saflaştırılması

The powdery mildew fungi are a group of economically important fungal plant pathogens. Relatively little is known about the molecular biology and genetics ...

RNA Pull-down Procedure to Identify RNA Targets of a Long Non-coding RNA

Uzun kodlamayan RNA, RNA hedefleri tanımlamak için RNA Pull-down yordamı

Long non-coding RNA (lncRNA), which are sequences of more than 200 nucleotides without a defined reading frame, belong to the regulatory non-coding ...

Exploring the Root Microbiome: Extracting Bacterial Community Data from the Soil, Rhizosphere, and Root Endosphere

Kök Microbiome keşfetmek: toprak, rizosferde ve kök Endosphere bakteriyel topluluk verileri ayıklama

The intimate interaction between plant host and associated microorganisms is crucial in determining plant fitness, and can foster improved tolerance to ...

Generation of Cancer Cell Clones to Visualize Telomeric Repeat-containing RNA TERRA Expressed from a Single Telomere in Living Cells

Canlı hücreler içinde tek bir telomer üzerinden ifade Telomeric tekrar içeren RNA TERRA görselleştirmek için kanser hücre klonlar nesil

Telomeres are transcribed, giving rise to telomeric repeat-containing long noncoding RNAs (TERRA), which have been proposed to play important roles in ...

Identification of Footprints of RNA:Protein Complexes via RNA Immunoprecipitation in Tandem Followed by Sequencing (RIPiT-Seq)

Identification of Footprints of RNA:Protein Complexes via RNA Immunoprecipitation in Tandem Followed by Sequencing RIPiT-Seq

RNA 'nın ayak Izleri tanımlaması: proteinli kompleksleri RNA Immunoprecipitation ile tandem sonra sıralamayı (RIPiT-seq)

RNA immunoprecipitation in tandem (RIPiT) is a method for enriching RNA footprints of a pair of proteins within an RNA:protein (RNP) complex. RIPiT ...

Identification of Circular RNAs using RNA Sequencing

RNA Sıralaması Kullanılarak Dairesel RNA'ların Tanımlanması

Circular RNAs (circRNAs) are a class of non-coding RNAs involved in functions including micro-RNA (miRNA) regulation, mediation of protein-protein ...

A FACS-based Protocol to Isolate RNA from the Secondary Cells of Drosophila Male Accessory Glands

A FACS-based Protocol to Isolate RNA from the Secondary Cells of Drosophila Male Accessory Glands

Drosophila Erkek Aksesuar Bezlerinin Sekonder Hücrelerinden RNA'yı Izole etmek için FACS tabanlı Protokol

To understand the function of an organ, it is often useful to understand the role of its constituent cell populations. Unfortunately, the rarity of ...