Name: visualization of macrophage lytic cell death during mycobacterial infection in zebrafish embryos via intravital microscopy
Uploaded: 2019-01-09T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualization of Macrophage Lytic Cell Death During Mycobacterial Infection in Zebrafish Embryos via Intravital Microscopy at JoVE.com

نشكر الدكتور زيلونغ ون لتقاسم سلالات الزرد ، الدكتور ستيفان اواهلرز والدكتور ديفيد توبين لتقاسم الموارد المتعلقة m. مارنوم ، yuepeng هو للمساعدة في اعداد الرقم. وقد دعم هذا العمل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (81801977) ، وبرنامج تدريب الشباب المتميز للجنة الصحة البلدية في شنغهاي (2018YQ54) (B.Y.) ، وبرنامج شنغهاي للإبحار (18YF1420400) (B.Y.) ، والصندوق المفتوح لمختبر شانغهاي الرئيسي للسل (2018KF02) (B.Y.).

وقد أثيرت في اطار الشروط القياسية zebrafish وفقا للمبادئ التوجيهية الحيوانية مختبر للمراجعة الاخلاقيه لرعاية الماشية (GB/T 35823-2018). تمت الموافقة علي جميع التجارب الزرد في هذه الدراسة (2019-A016) وأجريت في مركز شانغهاي الصحة العامة السريرية ، جامعه fudan.
1. م. مرنوم خليه واحده اعداد ال?...

<ol>
	<li>Behar, S. M., Divangahi, M., Remold, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evasion+of+innate+immunity+by+Mycobacterium+tuberculosis:+is+death+an+exit+strategy.">Evasion of innate immunity by Mycobacterium tuberculosis: is death an exit strategy.</a> Nature Reviews Microbiology. 8 (9), 668-674 (2010).</li><li>Lamkanfi, M., Dixit, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manipulation+of+host+cell+death+pathways+during+microbial+infections.">Manipulation of host cell death pathways during microbial infections.</a> Cell Host Microbe. 8 (1), 44-54 (2010).</li><li>Crowley, L. C., Marfell, B. J., Scott, A. P., Waterhouse, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitation+of+Apoptosis+and+Necrosis+by+Annexin+V+Binding,+Propidium+Iodide+Uptake,+and+Flow+Cytometry.">Quantitation of Apoptosis and Necrosis by Annexin V Binding, Propidium Iodide Uptake, and Flow Cytometry.</a> Cold Spring Harbor Protocol. 2016 (11), (2016).</li><li>Crowley, L. C., Marfell, B. J., Waterhouse, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+DNA+Fragmentation+in+Apoptotic+Cells+by+TUNEL.">Detection of DNA Fragmentation in Apoptotic Cells by TUNEL.</a> Cold Spring Harbor Protocol. 2016 (10), (2016).</li><li>Chan, L. L., McCulley, K. J., Kessel, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+Cell+Viability+with+Single-,+Dual-,+and+Multi-Staining+Methods+Using+Image+Cytometry.">Assessment of Cell Viability with Single-, Dual-, and Multi-Staining Methods Using Image Cytometry.</a> Methods in Molecular Biology. 1601, 27-41 (2017).</li><li>Rathkey, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+visualization+of+gasdermin+D-driven+pyroptotic+cell+death.">Live-cell visualization of gasdermin D-driven pyroptotic cell death.</a> Journal of Biological Chemistry. 292 (35), 14649-14658 (2017).</li><li>Henry, K. M., Loynes, C. A., Whyte, M. K., Renshaw, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+as+a+model+for+the+study+of+neutrophil+biology.">Zebrafish as a model for the study of neutrophil biology.</a> Journal of Leukocyte Biology. 94 (4), 633-642 (2013).</li><li>Harvie, E. A., Huttenlocher, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+in+host+defense:+new+insights+from+zebrafish.">Neutrophils in host defense: new insights from zebrafish.</a> Journal of Leukocyte Biology. 98 (4), 523-537 (2015).</li><li>Lesley, R., Ramakrishnan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+early+mycobacterial+pathogenesis+from+the+zebrafish.">Insights into early mycobacterial pathogenesis from the zebrafish.</a> Current Opinion Microbiology. 11 (3), 277-283 (2008).</li><li>Tobin, D. M., Ramakrishnan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+pathogenesis+of+Mycobacterium+marinum+and+Mycobacterium+tuberculosis.">Comparative pathogenesis of Mycobacterium marinum and Mycobacterium tuberculosis.</a> Cellular Microbiology. 10 (5), 1027-1039 (2008).</li><li>Clay, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dichotomous+role+of+the+macrophage+in+early+Mycobacterium+marinum+infection+of+the+zebrafish.">Dichotomous role of the macrophage in early Mycobacterium marinum infection of the zebrafish.</a> Cell Host Microbe. 2 (1), 29-39 (2007).</li><li>Davis, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+visualization+of+mycobacterium-macrophage+interactions+leading+to+initiation+of+granuloma+formation+in+zebrafish+embryos.">Real-time visualization of mycobacterium-macrophage interactions leading to initiation of granuloma formation in zebrafish embryos.</a> Immunity. 17 (6), 693-702 (2002).</li><li>Benard, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infection+of+zebrafish+embryos+with+intracellular+bacterial+pathogens.">Infection of zebrafish embryos with intracellular bacterial pathogens.</a> Journal of Visualized Experiments. (61), e3781 (2012).</li><li>Maglione, P. J., Xu, J., Chan, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cells+moderate+inflammatory+progression+and+enhance+bacterial+containment+upon+pulmonary+challenge+with+Mycobacterium+tuberculosis.">cells moderate inflammatory progression and enhance bacterial containment upon pulmonary challenge with Mycobacterium tuberculosis.</a> Journal of Immunology. 178 (11), 7222-7234 (2007).</li><li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+plays+critical+role+during+Edwardsiella+piscicida+immersion+infection+in+zebrafish+larvae.">Neutrophil plays critical role during Edwardsiella piscicida immersion infection in zebrafish larvae.</a> Fish Shellfish Immunology. 87, 565-572 (2019).</li><li>Wang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nlrc3-like+is+required+for+microglia+maintenance+in+zebrafish.">Nlrc3-like is required for microglia maintenance in zebrafish.</a> Journal of Genetics and Genomics. 46 (6), 291-299 (2019).</li><li>Hall, C., Flores, M. V., Storm, T., Crosier, K., Crosier, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+lysozyme+C+promoter+drives+myeloid-specific+expression+in+transgenic+fish.">The zebrafish lysozyme C promoter drives myeloid-specific expression in transgenic fish.</a> BMC Developmental Biology. 7, 42 (2007).</li><li>Xu, J., Wang, T., Wu, Y., Jin, W., Wen, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+Colonization+of+Developing+Zebrafish+Midbrain+Is+Promoted+by+Apoptotic+Neuron+and+Lysophosphatidylcholine.">Microglia Colonization of Developing Zebrafish Midbrain Is Promoted by Apoptotic Neuron and Lysophosphatidylcholine.</a> Developmental Cell. 38 (2), 214-222 (2016).</li><li>Oehlers, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interception+of+host+angiogenic+signalling+limits+mycobacterial+growth.">Interception of host angiogenic signalling limits mycobacterial growth.</a> Nature. 517 (7536), 612-615 (2015).</li><li>Kulms, D., Schwarz, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+UV-induced+apoptosis.">Molecular mechanisms of UV-induced apoptosis.</a> Photodermatology, Photoimmunology and Photomedicine. 16 (5), 195-201 (2000).</li><li>van Ham, T. J., Mapes, J., Kokel, D., Peterson, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+apoptotic+cells+in+zebrafish.">Live imaging of apoptotic cells in zebrafish.</a> FASEB Journal. 24 (11), 4336-4342 (2010).</li><li>Zhang, Y., Chen, X., Gueydan, C., Han, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+membrane+changes+during+programmed+cell+deaths.">Plasma membrane changes during programmed cell deaths.</a> Cell Research. 28 (1), 9-21 (2018).</li><li>Lu, Z., Zhang, C., Zhai, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleoplasmin+regulates+chromatin+condensation+during+apoptosis.">Nucleoplasmin regulates chromatin condensation during apoptosis.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 102 (8), 2778-2783 (2005).</li><li>Ashida, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+death+and+infection:+a+double-edged+sword+for+host+and+pathogen+survival.">Cell death and infection: a double-edged sword for host and pathogen survival.</a> Journal of Cell Biology. 195 (6), 931-942 (2011).</li><li>Traven, A., Naderer, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+egress:+a+hitchhiker's+guide+to+freedom.">Microbial egress: a hitchhiker's guide to freedom.</a> PLoS Pathogens. 10 (7), 1004201 (2014).</li></ol>

يصف هذا البروتوكول التصور للوفاة الضامة اثناء العدوى المتفطرات. استنادا إلى عوامل مثل سلامه غشاء الخلية ، يمكن تقسيم موت الخلايا مدفوعة العدوى إلى موت الخلايا المبرمج ووفاه الخلية التحللي24،25. الموت الخلية lytic هو أكثر إرهاقا للكائن الحي من المبرمج ، لأنه يح...

وقد ثبت ان العدوى المتفطرات تسبب وفاه الخلية المناعية المضيف1. علي سبيل المثال ، فان سلاله موهنه تؤدي إلى موت الخلايا المبرمج في الضامة وتحتوي علي العدوى. ومع ذلك ، فان سلاله خبيثه تؤدي إلى موت الخلايا الليتيك ، مما تسبب في نشر البكتيريا1،2. النظر إلى تاثير هذه الأنواع المختلفة من موت الخلايا لديها علي المضيف المضادة للمتفطرات الاستجابة ، وهناك حاجه إلى ملاحظه مفصله من وفاه الخلايا الضامة اثناء العدوى المتفطرات في الجسم المجري.
الطرق التقليدية لقياس موت الخلايا هي لاستخدام البقع الخلية الميتة ، مثل الخامس annnexin ، tunel ، أو اكريدين اورانج/بروبيديوم يوديد تلطيخ3،4،5. ومع ذلك ، هذه الطرق غير قادره علي تسليط الضوء علي عمليه ديناميكية من موت الخلايا في الجسم الحي. وقد تيسرت بالفعل مراقبه موت الخلايا في المختبر عن طريق التصوير الحي6. ومع ذلك ، ما إذا كانت النتائج تحاكي بدقه الظروف الفسيولوجية لا يزال غير واضح.
وكانت zebrafish نموذجا ممتازا لدراسة المضيفين مكافحه المتفطره الاستجابات. لديها جهاز المناعة المحمية للغاية مماثله لتلك التي من البشر ، والجينوم التلاعب بها بسهوله ، والاجنه في وقت مبكر شفافة ، والذي يسمح للتصوير الحي7،8،9. بعد العدوى مع m. مارنوم ، الكبار الزرد شكل نموذجي البنيات الحبيبية ناضجه ، وشكل الزرد الجنينية الحبيبية في وقت مبكر مثلالهياكل 9 ،10. وقد تم استكشاف العملية الديناميكية للخلايا المناعية الفطرية التفاعل البكتيريا في السابق في النموذج العدوى م. مارنوم 11,12. ومع ذلك ، نظرا لارتفاع متطلبات الدقة المكانية والزمانيه ، تظل التفاصيل المحيطة بوفاة الخلايا المناعية الفطرية غير معرفه إلى حد كبير.
هنا نحن وصف كيفيه تصور عمليه الموت الخلية الضامة التي تسببها العدوى المتفطرات في الجسم الميت. ويمكن أيضا تطبيق هذا البروتوكول لتصور السلوك الخلوي في الجسم المجري اثناء التطور والتهاب.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.05% Tween-80</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL syringe</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>YA0552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% OADC</td>
			<td>BD</td>
			<td>211886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-aminobenzoic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E10521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 &#956;m filter</td>
			<td>Mille X</td>
			<td>SLSV025LS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 &#956;l/ml hygromycin</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A600230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7H10</td>
			<td>BD</td>
			<td>262710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7H9</td>
			<td>BD</td>
			<td>262310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A glass bottom 35 mm dish</td>
			<td>In Vitro Scientific</td>
			<td>D35-10-0-N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A60015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>TCS SP5 II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enviromental Chamber</td>
			<td>Pecon</td>
			<td>temp control 37-2 digital</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf microloader</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>No.5242956003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass microscope slide</td>
			<td>Bioland Scientific LLC</td>
			<td>7105P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A100854</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Keelrein</td>
			<td>PH-140(A)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M.marinum</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>ATCC BAA-535</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjection needle</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>IB100F-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjector</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Femtojet</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>NARISHIGE</td>
			<td>MN-151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>msp12:cerulean</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Ref.: PMID 25470057; 27760340</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol red</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3532</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTU</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single concavity glass microscope slide</td>
			<td>Sail Brand</td>
			<td>7103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator</td>
			<td>SCICNTZ</td>
			<td>JY92-IIDN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer (OD600)</td>
			<td>Eppendorf AG</td>
			<td>22331 Hamburg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo Microscope</td>
			<td>OLYMPUS</td>
			<td>SZX10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tg(mfap4:eGFP)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Ref.: PMID 30742890</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tg(coro1a:eGFP;lyzDsRed2)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Ref.: PMID 31278008</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tg(mpeg1:LRLG;lyz:eGFP)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Ref.: PMID 27424497; 17477879</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualization of macrophage lytic cell death during mycobacterial infection in zebrafish embryos via intravital microscopy

Zebrafish هو كائن نموذجي ممتاز لدراسة سلوك الخلايا المناعية الفطرية نظرا لطبيعته الشفافة والاعتماد فقط علي نظامه المناعي الفطري اثناء التطور المبكر. وقد تم إنشاء نموذج العدوى المتفطره الفطرية من زبراافيش (m. مارنوم) في دراسة الاستجابة المناعية المضيفة ضد العدوى المتفطرات. وقد اقترح ان مختلف أنواع الموت خليه الضامة سوف يؤدي إلى النتائج المتنوعة للعدوى المتفطرات. هنا نحن وصف بروتوكول باستخدام المجهر انترافيتال لمراقبه وفاه الخلية الضامة في الاجنه الزرد بعد العدوى m. مارنوم . الخطوط المحورة وراثيا zebrafish التي تسمي علي وجه التحديد الضامة والعدلات هي المصابة عن طريق الحقن المجهري العضلي من فلوريسسينتلي المسمي m. مارنوم في اما الدماغ الأوسط أو الجذع. وفي وقت لاحق ، يتم تركيب الاجنه المصابة بالزبرد علي ذوبان منخفض ويلاحظها المجهر البؤري في ابعاد X-Y-Z-T. لان التصوير الحي علي المدى الطويل يتطلب استخدام طاقة الليزر المنخفضة لتجنب الرشح الضوئي والسمية الضوئية ، ينصح بشده بالتعبير المعدل وراثيا. يسهل هذا البروتوكول تصور العمليات الديناميكية في الجسم الحي ، بما في ذلك هجره الخلايا المناعية ، وتفاعل الممرض المضيف ، وموت الخلايا.

يمكن ان تؤدي عدوي المتفطره إلى استجابات مختلفه للمضيف استنادا إلى طرق العدوى. في هذا البروتوكول ، يصاب الاجنه الزبرافوش بالحقن المجهري العضلي لفلوريسسينتلي المسمية البكتيريا في الدماغ الوسطي أو الجذع (الشكل 3) والتي يلاحظها التصوير الحي البؤري. العدوى عن طريق هذين المسار?...

Watch this Scientific Journal Video about Visualization of Macrophage Lytic Cell Death During Mycobacterial Infection in Zebrafish Embryos via Intravital Microscopy at JoVE.com

Visualization of Macrophage Lytic Cell Death During Mycobacterial Infection in Zebrafish Embryos via Intravital Microscopy

يصف هذا البروتوكول تقنيه لتصور السلوك الضام والموت في الاجنه الجنينية اثناء العدوى المتفطره المردية . يتم تضمين خطوات لاعداد البكتيريا ، والعدوى من الاجنه ، والمجهر الانترافيتال. ويمكن تطبيق هذه التقنية علي مراقبه السلوك الخلوي والموت في سيناريوهات مماثله تنطوي علي عدوي أو التهاب معقم.

التصور للموت الخلية الليتيك الضامة اثناء العدوى المتفطرات في الاجنه Zebrafish عن طريق المجهر الانترافيتال

Zebrafish is an excellent model organism for studying innate immune cell behavior due to its transparent nature and reliance solely on its innate immune ...

هذا البروتوكول يمكن أن يميز بوضوح أوضاع موت الخلايا الضامة أثناء العدوى الفطرية. من خلال مراقبة الأجنة المتعددة بالتوازي ، فإنه يزيد إلى حد كبير من احتمال التقاط عملية موت الخلايا الضامة بأكملها. ويمكن أيضا أن يطبق هذا البروتوكول على مراقبة موت الخلايا وغيرها من السلوك الخلوي في سيناريوهات مماثلة تنطوي على العدوى أو التهاب معقمة.خلال التصوير الحي الممتد ، من المهم جدًا الحفاظ على شدة الليزر منخفضة قدر الإمكان لتجنب الإضاءة الضوئية والسمية. بعد تلقيح وفقا للمخطوطة، الطرد المركزي في 3000 مرات G مرات لمدة 10 دقائق لجمع مايجنومي البكتيريا كما بيليه. تجاهل جميع ما عدا 300 ميكرولترات من المابير، وإعادة تعليق بيليه.إضافة ثلاثة ملليلتر من 7H9 المتوسطة مع 10٪ الجلسرين إلى مزيد من إعادة تعليق بيليه، ثم sonicate تعليق في حمام مائي في 100 واط، مع 15 ثانية على و 15 ثانية قبالة، لما مجموعه دقيقتين لتحقيق تجانس خلية واحدة. نقل تعليق بكتيرية إلى حقنة 10 ملليلتر، وتمرير من خلال مرشح خمسة ميكرون لإزالة أي كتل بكتيرية. باستخدام مقياس الطيفي، وقياس الكثافة البصرية للتعليق، وتمييع مع وسائل الإعلام 7H9 التي تحتوي على 10٪ الجلسرين إلى OD 600 في واحد.تقسيم التعليق إلى 10 ميكرولتر aliquots، وتخزينها في السلبية 80 درجة مئوية الفريزر لمزيد من الاستخدام. أولاً، قم بسخين الأذانوز في كتلة تدفئة 95 درجة مئوية حتى تذوب تماماً. الحفاظ على agarose في شكل سائل عن طريق وضعه في كتلة التدفئة 45 درجة مئوية.لتركيب للعدوى العضلية في منطقة الجذع، إنشاء طبقة agarose السفلية عن طريق صب 0.5 ملليلتر من وزن 1٪، من قبل حجم agarose بالتساوي على شريحة زجاجية. ضع الشريحة على صندوق الثلج أو سطح بارد لمدة ثلاث دقائق لترسيخ. بعد تخدير أجنة سمك الحمار الوحشي، ضع ما يصل إلى 60 جنيناً من أسماك الحمار الوحشي على طبقة أغاروز السفلية، ووضعها بعناية في صفين.إزالة أي ماء المتبقية على طبقة agarose السفلي مع ورقة الأنسجة، قبل إضافة 0.3 ملليلتر من 0.5٪ الوزن من قبل حجم agarose لإنشاء الطبقة العليا. تأكد من أن الأجنة جزءا لا يتجزأ تماما في agarose. العودة الشريحة الزجاجية إلى icebox مرة أخرى لترسيخ agarose.الحفاظ على الطبقة العليا من agarose رطبة من خلال تغطية السطح مع إضافية E3 البيض الماء. المقبل، وضبط الحقن المجهري وmicromanipulator إلى الوضع المناسب والإعداد للمجهر. نقل ثلاثة microliters من الثقافة البكتيرية المعدة في إبرة المعدة باستخدام microloader.الماصات ببطء وبعناية لتجنب تشكيل فقاعات الهواء. حقن 100 CFU في منطقة الجذع. بعد الحقن المجهري، قم بتدفيق أجنة أسماك الحمار الوحشي بعناية في ماء البيض الطازج مع ماصة بلاستيكية.لتركيب لعدوى منتصف القرن، واستخدام ماصة بلاستيكية لنقل أربعة إلى ستة الأجنة تريكين تخدير في agarose. ضع رأس كل جنين إلى الأعلى بعناية بإبرة من 10 قياس. بمجرد إصلاح جميع أوضاع الأجنة، قم بنقل الشريحة الزجاجية إلى صندوق جليدي أو سطح بارد للسماح للأغاروز بالتوطد.حقن 500 CFU في منتصف الفقر. بعد الحقن المجهري، قم بتدفيق أجنة سمك الحمار الوحشي بعناية في ماء البيض الطازج مع ماصة بلاستيكية. بمجرد أن تتوطد agarose تماما، وتغطي agarose مع طبقة من ماء البيض.بعد إنشاء الغرفة البيئية، ضع طبق القاع الزجاجي 35 ملليمتر مع سمك الحمار الوحشي في الغرفة البيئية. فتح 405 الصمام الثنائي، الأرجون في 20٪ السلطة، وDPSS 561 نانومتر الليزر. قم بإعداد طاقة الليزر المناسبة في إعدادات الطيف.اختر وضع الاكتساب المتسلسل للمسح الضوئي XYZ، ثم قم بتعيين تنسيق الصور إلى 512 بكسل في 512 بكسل. قم بالتبديل إلى وضع البيانات الحية، واستهداف موضع الحمار الوحشي الأول، ووضع علامة على وضعي البداية والنهاية Z. كرر هذه العملية لكل من الأجنة المتبقية.إضافة وقفة في نهاية البرنامج. تعريف حلقة ودورة البرنامج، وحفظ الملف. في هذه الدراسة، استخدمنا coro1a المعدلة وراثيا ذكرت سابقا: eGFP؛ lyzDsRed2، وmpeg1loxP المعدلة وراثيا؛ DsRed:loxPeGFP؛ lyz:eGFP، للتمييز بين الضامة والعدلات في الجسم الحي.أصبح الضامة المنهمكة بشكل كبير مع البكتيريا مستديرة وعرضها انخفاض الحركة ، مع تورم سيتوبلازميك في نهاية المطاف ، وتمزق غشاء الخلية ، والنشر السريع للمحتوى السيتوبلازمي. وأظهرت الضامة الأشعة فوق البنفسجية المشعة نموذجية الأنماط الظاهرية الخلية المبرمج مثل انكماش الخلية، والتجزئة النووية، والتكثيف الكروماتين. ولوحظ أيضا أن الضامة تعمل بنشاط على إنارة وجرى نشرها في M.merinum.ومع ذلك ، كان العدلات محدودة القدرة البلعومية ، وسرعان ما خضعت للوفاة الخلوية دون engorgement البكتيرية واضحة. يمكن لهذا البروتوكول، إلى جانب أدوات تحرير الجينات القوية، توفير منصة فعالة لمزيد من الفهم لتأثير مجموعة متنوعة من العوامل على التفاعل بين المضيف والمسببات في الجسم الحي.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Intravital Microscopy of the Inguinal Lymph Node

Intravital الميكروسكوب من العقدة الليمفاوية الأربي

Lymph nodes (LN's), located throughout the body, are an integral component of the immune system. They serve as a site for induction of adaptive immune ...

Intravital Microscopy of the Spleen: Quantitative Analysis of Parasite Mobility and Blood Flow

Intravital الميكروسكوب في الطحال : التحليل الكمي للتنقل الطفيلي وتدفق الدم

The advent of intravital microscopy in experimental rodent malaria models has allowed major advances to the knowledge of parasite-host interactions 1,2. ...

Infection of Zebrafish Embryos with Intracellular Bacterial Pathogens

إصابة الأجنة الزرد مع مسببات الأمراض البكتيرية بين الخلايا

Zebrafish (Danio rerio) embryos are increasingly used as a model for studying the function of the vertebrate innate immune system in host-pathogen ...

Visualization of Bacterial Toxin Induced Responses Using Live Cell Fluorescence Microscopy

تصور الردود السم البكتيري المستحثة عن طريق لايف مضان المجهري الخليوي

Bacterial toxins bind to cholesterol in membranes, forming pores that allow for leakage of cellular contents and influx of materials from the external ...

Highly Resolved Intravital Striped-illumination Microscopy of Germinal Centers

حل غاية intravital المجهري مخطط في الإضاءة مراكز جرمينال

Monitoring cellular communication by intravital deep-tissue multi-photon microscopy is the key for understanding the fate of immune cells within thick ...

Study of Phagolysosome Biogenesis in Live Macrophages

دراسة يحلول يبلوعي النشوء الأحيائي في الضامة لايف

Phagocytic cells play a major role in the innate immune system by removing and eliminating invading microorganisms in their phagosomes. Phagosome ...

Visualizing Non-lytic Exocytosis of Cryptococcus neoformans from Macrophages Using Digital Light Microscopy

Visualizing Non-lytic Exocytosis of Cryptococcus neoformans from Macrophages Using Digital Light Microscopy

تصور الإيماس غير التحللي من<em&gt; الأدعومية المستخفية</em&gt; من الضامة الرقمية الخفيفة عن طريق الميكروسكوب

Many aspects of the infection of macrophages by Cryptococcus neoformans have been extensively studied and well defined. However, one particular ...

Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood

تدفق تحليل Cytometric من القاتل الطبيعي خلية التحللي آخر في الدم الجامع البشري

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and ...

Visualizing Macrophage Extracellular Traps Using Confocal Microscopy

تصور بلعم الفخاخ خارج الخلية باستخدام المجهر [كنفوكل]

A primary method used to define the presence of neutrophil extracellular traps (NETs) is confocal microscopy. We have modified established confocal ...

Saturated Fatty Acids Induce Ceramide-associated Macrophage Cell Death

الأحماض الدهنية المشبعة الحث على موت الخلايا المرتبطة السيراميد بلعم

Macrophages highly express epidermal fatty acid-binding protein and adipose fatty acid-binding protein. They actively uptake saturated and unsaturated ...