Name: visualization of macrophage lytic cell death during mycobacterial infection in zebrafish embryos via intravital microscopy
Uploaded: 2019-01-09T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualization of Macrophage Lytic Cell Death During Mycobacterial Infection in Zebrafish Embryos via Intravital Microscopy at JoVE.com

Vi takker Dr. zilong Wen for at dele Zebra stammer, Dr. Stefan oehlers og Dr. David Tobin for at dele M. Marinum relaterede ressourcer, yuepeng han for assistance i figur forberedelse. Dette arbejde blev støttet af National Natural Science Foundation of China (81801977) (B.Y.), det udestående ungdoms uddannelses program af Shanghai Municipal Health Commission (2018YQ54) (B.Y.), Shanghai Sailing program (18YF1420400) (B.Y.), og åben fond af Shanghai Key Laboratory of tuberkulose (2018KF02) (B.Y.).

Zebrafish blev opdrættet under standardbetingelser i overensstemmelse med laboratoriets dyre retningslinjer for etisk gennemgang af dyrevelfærd (GB/T 35823-2018). Alle Zebra eksperimenter i dette studie blev godkendt (2019-A016-01) og udført på Shanghai Public Health Clinical Center, Fudan University.
1. M. Marinum enkelt celle inoculum præparat (figur 1)
<ol><li>Tø Cerulean-fluorescerende M. Marinum glycerol bestand fra-80 °c og inokule...

<ol>
	<li>Behar, S. M., Divangahi, M., Remold, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evasion+of+innate+immunity+by+Mycobacterium+tuberculosis:+is+death+an+exit+strategy.">Evasion of innate immunity by Mycobacterium tuberculosis: is death an exit strategy.</a> Nature Reviews Microbiology. 8 (9), 668-674 (2010).</li><li>Lamkanfi, M., Dixit, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manipulation+of+host+cell+death+pathways+during+microbial+infections.">Manipulation of host cell death pathways during microbial infections.</a> Cell Host Microbe. 8 (1), 44-54 (2010).</li><li>Crowley, L. C., Marfell, B. J., Scott, A. P., Waterhouse, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitation+of+Apoptosis+and+Necrosis+by+Annexin+V+Binding,+Propidium+Iodide+Uptake,+and+Flow+Cytometry.">Quantitation of Apoptosis and Necrosis by Annexin V Binding, Propidium Iodide Uptake, and Flow Cytometry.</a> Cold Spring Harbor Protocol. 2016 (11), (2016).</li><li>Crowley, L. C., Marfell, B. J., Waterhouse, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+DNA+Fragmentation+in+Apoptotic+Cells+by+TUNEL.">Detection of DNA Fragmentation in Apoptotic Cells by TUNEL.</a> Cold Spring Harbor Protocol. 2016 (10), (2016).</li><li>Chan, L. L., McCulley, K. J., Kessel, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+Cell+Viability+with+Single-,+Dual-,+and+Multi-Staining+Methods+Using+Image+Cytometry.">Assessment of Cell Viability with Single-, Dual-, and Multi-Staining Methods Using Image Cytometry.</a> Methods in Molecular Biology. 1601, 27-41 (2017).</li><li>Rathkey, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+visualization+of+gasdermin+D-driven+pyroptotic+cell+death.">Live-cell visualization of gasdermin D-driven pyroptotic cell death.</a> Journal of Biological Chemistry. 292 (35), 14649-14658 (2017).</li><li>Henry, K. M., Loynes, C. A., Whyte, M. K., Renshaw, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+as+a+model+for+the+study+of+neutrophil+biology.">Zebrafish as a model for the study of neutrophil biology.</a> Journal of Leukocyte Biology. 94 (4), 633-642 (2013).</li><li>Harvie, E. A., Huttenlocher, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+in+host+defense:+new+insights+from+zebrafish.">Neutrophils in host defense: new insights from zebrafish.</a> Journal of Leukocyte Biology. 98 (4), 523-537 (2015).</li><li>Lesley, R., Ramakrishnan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+early+mycobacterial+pathogenesis+from+the+zebrafish.">Insights into early mycobacterial pathogenesis from the zebrafish.</a> Current Opinion Microbiology. 11 (3), 277-283 (2008).</li><li>Tobin, D. M., Ramakrishnan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+pathogenesis+of+Mycobacterium+marinum+and+Mycobacterium+tuberculosis.">Comparative pathogenesis of Mycobacterium marinum and Mycobacterium tuberculosis.</a> Cellular Microbiology. 10 (5), 1027-1039 (2008).</li><li>Clay, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dichotomous+role+of+the+macrophage+in+early+Mycobacterium+marinum+infection+of+the+zebrafish.">Dichotomous role of the macrophage in early Mycobacterium marinum infection of the zebrafish.</a> Cell Host Microbe. 2 (1), 29-39 (2007).</li><li>Davis, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+visualization+of+mycobacterium-macrophage+interactions+leading+to+initiation+of+granuloma+formation+in+zebrafish+embryos.">Real-time visualization of mycobacterium-macrophage interactions leading to initiation of granuloma formation in zebrafish embryos.</a> Immunity. 17 (6), 693-702 (2002).</li><li>Benard, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infection+of+zebrafish+embryos+with+intracellular+bacterial+pathogens.">Infection of zebrafish embryos with intracellular bacterial pathogens.</a> Journal of Visualized Experiments. (61), e3781 (2012).</li><li>Maglione, P. J., Xu, J., Chan, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cells+moderate+inflammatory+progression+and+enhance+bacterial+containment+upon+pulmonary+challenge+with+Mycobacterium+tuberculosis.">cells moderate inflammatory progression and enhance bacterial containment upon pulmonary challenge with Mycobacterium tuberculosis.</a> Journal of Immunology. 178 (11), 7222-7234 (2007).</li><li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+plays+critical+role+during+Edwardsiella+piscicida+immersion+infection+in+zebrafish+larvae.">Neutrophil plays critical role during Edwardsiella piscicida immersion infection in zebrafish larvae.</a> Fish Shellfish Immunology. 87, 565-572 (2019).</li><li>Wang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nlrc3-like+is+required+for+microglia+maintenance+in+zebrafish.">Nlrc3-like is required for microglia maintenance in zebrafish.</a> Journal of Genetics and Genomics. 46 (6), 291-299 (2019).</li><li>Hall, C., Flores, M. V., Storm, T., Crosier, K., Crosier, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+lysozyme+C+promoter+drives+myeloid-specific+expression+in+transgenic+fish.">The zebrafish lysozyme C promoter drives myeloid-specific expression in transgenic fish.</a> BMC Developmental Biology. 7, 42 (2007).</li><li>Xu, J., Wang, T., Wu, Y., Jin, W., Wen, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+Colonization+of+Developing+Zebrafish+Midbrain+Is+Promoted+by+Apoptotic+Neuron+and+Lysophosphatidylcholine.">Microglia Colonization of Developing Zebrafish Midbrain Is Promoted by Apoptotic Neuron and Lysophosphatidylcholine.</a> Developmental Cell. 38 (2), 214-222 (2016).</li><li>Oehlers, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interception+of+host+angiogenic+signalling+limits+mycobacterial+growth.">Interception of host angiogenic signalling limits mycobacterial growth.</a> Nature. 517 (7536), 612-615 (2015).</li><li>Kulms, D., Schwarz, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+UV-induced+apoptosis.">Molecular mechanisms of UV-induced apoptosis.</a> Photodermatology, Photoimmunology and Photomedicine. 16 (5), 195-201 (2000).</li><li>van Ham, T. J., Mapes, J., Kokel, D., Peterson, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+apoptotic+cells+in+zebrafish.">Live imaging of apoptotic cells in zebrafish.</a> FASEB Journal. 24 (11), 4336-4342 (2010).</li><li>Zhang, Y., Chen, X., Gueydan, C., Han, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+membrane+changes+during+programmed+cell+deaths.">Plasma membrane changes during programmed cell deaths.</a> Cell Research. 28 (1), 9-21 (2018).</li><li>Lu, Z., Zhang, C., Zhai, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleoplasmin+regulates+chromatin+condensation+during+apoptosis.">Nucleoplasmin regulates chromatin condensation during apoptosis.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 102 (8), 2778-2783 (2005).</li><li>Ashida, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+death+and+infection:+a+double-edged+sword+for+host+and+pathogen+survival.">Cell death and infection: a double-edged sword for host and pathogen survival.</a> Journal of Cell Biology. 195 (6), 931-942 (2011).</li><li>Traven, A., Naderer, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+egress:+a+hitchhiker's+guide+to+freedom.">Microbial egress: a hitchhiker's guide to freedom.</a> PLoS Pathogens. 10 (7), 1004201 (2014).</li></ol>

Denne protokol beskriver visualisering af makrofag død under mykobakterielle infektion. Baseret på faktorer såsom integriteten af cellemembranen, kan infektion drevet celledød opdeles i apoptose og lytisk celle død24,25. Lytisk celledød er mere stressende for organismen end apoptose, fordi det udløser en stærk inflammatorisk respons 24,25. Observation af lytisk celledød in vivo er vanskelig, på ...

Mycobakteriel infektion er blevet påvist at forårsage Host immuncelle død1. For eksempel vil en svækket stamme udløse apoptose i makrofager og indeholde infektionen. Men en virulente stamme vil udløse lytisk celledød, forårsager bakteriel udbredelse1,2. I betragtning af virkningen disse forskellige typer af celledød har på vært anti-mykobakterielle respons, en detaljeret observation af makrofag celledød under mycobakteriel infektion in vivo er nødvendig.
De konventionelle metoder til måling af celledød er at bruge døde celle pletter, såsom annnexin V, Tunel, eller acridin orange/propidium kaliumiodid farvning3,4,5. Men disse metoder er ude af stand til at kaste lys over den dynamiske proces af celledød in vivo. Observation af celledød in vitro er allerede blevet fremmet af Live imaging6. Det er imidlertid uklart, om resultaterne nøjagtigt efterligner fysiologiske forhold.
Zebrafish har været en glimrende model for at studere Host anti-Mycobacterium svar. Det har et stærkt bevaret immunsystem, der ligner det for mennesker, et let manipulerede genom, og de tidlige embryoner er gennemsigtige, hvilket giver mulighed for levende billeddannelse7,8,9. Efter infektion med M. Marinum, voksne Zebra form typiske modne granulom strukturer, og embryonale Zebra danner tidlige granulom som strukturer9,10. Den dynamiske proces af medfødte immuncelle-bakterier interaktion er blevet udforsket tidligere i Zebra M. Marinum infektion model11,12. Men på grund af høj rumlig-temporale opløsning krav, detaljerne omkring død af de medfødte immunceller forbliver stort set udefineret.
Her beskriver vi, hvordan man visualiserer processen med makrofag lytisk celledød udløst af mycobakteriel infektion in vivo. Denne protokol kan også anvendes til at visualisere cellulære adfærd in vivo under udvikling og inflammation.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.05% Tween-80</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL syringe</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>YA0552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% OADC</td>
			<td>BD</td>
			<td>211886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-aminobenzoic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E10521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 &#956;m filter</td>
			<td>Mille X</td>
			<td>SLSV025LS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 &#956;l/ml hygromycin</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A600230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7H10</td>
			<td>BD</td>
			<td>262710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7H9</td>
			<td>BD</td>
			<td>262310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A glass bottom 35 mm dish</td>
			<td>In Vitro Scientific</td>
			<td>D35-10-0-N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A60015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>TCS SP5 II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enviromental Chamber</td>
			<td>Pecon</td>
			<td>temp control 37-2 digital</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf microloader</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>No.5242956003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass microscope slide</td>
			<td>Bioland Scientific LLC</td>
			<td>7105P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A100854</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Keelrein</td>
			<td>PH-140(A)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M.marinum</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>ATCC BAA-535</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjection needle</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>IB100F-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjector</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Femtojet</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>NARISHIGE</td>
			<td>MN-151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>msp12:cerulean</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Ref.: PMID 25470057; 27760340</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol red</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3532</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTU</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single concavity glass microscope slide</td>
			<td>Sail Brand</td>
			<td>7103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator</td>
			<td>SCICNTZ</td>
			<td>JY92-IIDN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer (OD600)</td>
			<td>Eppendorf AG</td>
			<td>22331 Hamburg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo Microscope</td>
			<td>OLYMPUS</td>
			<td>SZX10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tg(mfap4:eGFP)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Ref.: PMID 30742890</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tg(coro1a:eGFP;lyzDsRed2)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Ref.: PMID 31278008</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tg(mpeg1:LRLG;lyz:eGFP)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Ref.: PMID 27424497; 17477879</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualization of macrophage lytic cell death during mycobacterial infection in zebrafish embryos via intravital microscopy

Zebrafish er en fremragende model organisme til at studere medfødte immuncelle adfærd på grund af sin gennemsigtige karakter og afhængighed udelukkende på dens medfødte immunsystem under tidlig udvikling. Den Zebrafish Mycobacterium Marinum (M. Marinum) infektion model har været veletableret i at studere vært immunrespons mod mycobakteriel infektion. Det er blevet foreslået, at forskellige makrofag celledød typer vil føre til de forskellige resultater af mycobakteriel infektion. Her beskriver vi en protokol ved hjælp af intravital mikroskopi til at observere makrofag celledød i Zebra embryoner efter M. Marinum infektion. Zebrafish transgene linjer, der specifikt mærke makrofager og neutrofiler er inficeret via intramuskulær mikroinjektion af fluorescently mærket M. Marinum i enten midthjernen eller stammen. Inficerede Zebra embryoner er efterfølgende monteret på lav smeltende agopstået og observeret af Konfokal mikroskopi i X-Y-Z-T dimensioner. Da langtids levende billeddannelse kræver brug af lav laser effekt for at undgå foto blegning og fototoksicitet, anbefales det stærkt at udtrykke transgene. Denne protokol letter visualisering af de dynamiske processer in vivo, herunder immuncelle migration, vært patogen interaktion, og celledød.

Mycobacterium infektion kan udløse forskellige vært svar baseret på ruterne af infektion. I denne protokol, er Zebra embryoner inficeret med intramuskulær mikroinjektion af fluorescently mærkede bakterier i midthjernen eller stammen (figur 3) og observeret af konfokale Live imaging. Infektion via disse to ruter vil lokalt begrænse infektionen forårsager medfødte immuncelle rekruttering og efterfølgende celledød.
Visualisering af detaljerne i medfødte im...

Watch this Scientific Journal Video about Visualization of Macrophage Lytic Cell Death During Mycobacterial Infection in Zebrafish Embryos via Intravital Microscopy at JoVE.com

Visualization of Macrophage Lytic Cell Death During Mycobacterial Infection in Zebrafish Embryos via Intravital Microscopy

Denne protokol beskriver en teknik til visualisering af makrofag adfærd og død i embryonale Zebra under Mycobacterium Marinum infektion. Trin til fremstilling af bakterier, infektion af embryoner, og intravital mikroskopi er inkluderet. Denne teknik kan anvendes til observation af cellulære adfærd og død i lignende scenarier, der involverer infektion eller steril inflammation.

Visualisering af makrofag lytisk celledød under mykobakterielle infektioner i Zebrafish-embryoner via Intravital mikroskopi

Zebrafish is an excellent model organism for studying innate immune cell behavior due to its transparent nature and reliance solely on its innate immune ...

Denne protokol kan klart skelne makrofag celledød tilstande under mykobakterielle infektion. Ved at observere flere embryoner parallelt, det øger i høj grad sandsynligheden for at fange hele makrofag lytisk celle død proces. Denne protokol kan også anvendes til observation af celledød og anden cellulær adfærd i lignende scenarier, der involverer infektion eller steril inflammation.Under den udvidede levende billedbehandling, er det meget vigtigt at holde intensiteten af laseren så lavt som muligt for at undgå photobleaching og toksicitet. Efter vaccination i henhold til manuskriptet, centrifuge kulturen på 3000 gange G i 10 minutter for at indsamle Mycobacterium marinum som en pellet. Kassér alle, men 300 mikroliter af supernatanten, og re-suspendere pellet.Tilsæt tre milliliter 7H9 medium med 10% glycerol for yderligere at re-suspendere pellet, og derefter sonikere suspensionen i et vandbad ved 100 watt, med 15 sekunder på og 15 sekunder off, i alt to minutter for at opnå en enkelt celle homogenat. Overfør bakteriesuspensionen til en 10 millilitersprøjte, og passere gennem et fem mikronfilter for at fjerne eventuelle bakterieklumper. Ved hjælp af et spektrofotometer måles suspensionens optiske tæthed, og den fortyndes med 7H9-medier, der indeholder 10% glycerol til OD 600 på én.Opdel suspensionen i 10 mikroliter aliquots, og opbevares på negative 80 grader Celsius fryser til videre brug. Først opvarme agarose i en 95 grader Celsius varmeblok, indtil det er helt smeltet. Vedligehold agarose i flydende form ved at placere den i en 45 grader Celsius varmeblok.At montere for intramuskulær infektion i stammen regionen, skabe den nederste agarose lag ved at hælde 0,5 milliliter af 1% vægt i volumen agarose jævnt på et glas dias. Placer rutsjebanen på en isboks eller kold overflade i tre minutter for at størkne. Efter bedøvelse af zebrafisk embryoner, sted op til 60 zebrafisk embryoner på bunden agarose lag, og læg dem ud omhyggeligt i to rækker.Fjern eventuelt resterende vand på det nederste agaroselag med silkepapir, før der tilsættes 0,3 milliliter 0,5 % vægt efter volumen agarose for at skabe det øverste lag. Sørg for, at embryonerne er helt indlejret i agarose. Returner glasrutsjebanen til køleboksen igen for at størkne agarose.Hold det øverste lag af agarose fugtig ved at dække overfladen med ekstra E3 ægvand. Juster derefter mikroinjektoren og mikromanipulatoren til den korrekte position og indstilling til mikroinjektion. Overfør tre mikroliter af forberedt bakteriekultur ind i den forberedte nål ved hjælp af en mikrolæsser.Pipette langsomt og forsigtigt for at undgå at danne luftbobler. Injicer 100 CFU i bagagerummet. Efter mikroinjektion skylles zebrafiskembryonerne forsigtigt ud i ferskvand med en plastikpipette.At montere for midbrain infektion, bruge en plastik pipette til at overføre de fire til seks tricain-bedøvet embryoner i agarose. Placer hovedet af hvert foster opad forsigtigt med en 10-gauge nål. Når alle embryoner positioner er fastgjort, overføre glas dias til en isboks eller kold overflade for at lade agarose størkne.Injicer 500 CFU i midterhjernen. Efter mikroinjektion skylles zebrafiskembryonerne forsigtigt ud i ferskvand med en plastikpipette. Når agarose er helt størknet, dække agarose med et lag af ægvand.Efter opsætning af miljøkammeret skal du placere den 35 millimeter glasbundskål med zebrafisken i miljøkammeret. Åbn 405 diode, argon ved 20% effekt, og DPSS 561 nanometer laser. Konfigurer den relevante lasereffekt i spektrumindstillinger.Vælg XYZ-sekvenseringstilstanden for scanning, og indstil billedformatet til 512 gange 512 pixel. Skift til live datatilstand, målret mod placeringen af den første zebrafisk, og marker start- og slut-Z-positionen. Gentag denne proces for hvert af de resterende embryoner.Tilføj en pause i slutningen af programmet. Definer programmets løkke og cyklus, og gem filen. I denne undersøgelse, vi udnyttede tidligere rapporteret transgene coro1a:eGFP;lyzDsRed2, og transgene mpeg1loxP;DsRed:loxPeGFP;lyz:eGFP, at skelne makrofager og neutrofiler i vivo.En makrofag stærkt engorged med bakterier blev rund og viste reduceret motilitet, med eventuel cytoplasmatisk hævelse, brud på cellemembranen, og hurtig formidling af det cytoplasmatiske indhold. UV-bestrålede makrofager viste typiske apoptotiske celle fænotyper såsom cellesvind, nuklear fragmentering og kromatinkondensation. Det blev også observeret makrofagerne aktivt fagoccytosed og formidles M.merinum.Men neutrofiler havde begrænset fagocytisk evne, og hurtigt gennemgik lytisk celledød uden indlysende bakteriel engorgement. Kombineret med kraftfulde genredigeringsværktøjer kan denne protokol være en effektiv platform for yderligere forståelse af effekten af en række faktorer på værtspatogeninteraktion in vivo.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Intravital Microscopy of the Inguinal Lymph Node

Lymph nodes (LN's), located throughout the body, are an integral component of the immune system. They serve as a site for induction of adaptive immune ...

Intravital Microscopy of the Spleen: Quantitative Analysis of Parasite Mobility and Blood Flow

Intravital Mikroskopi af milten: Kvantitativ analyse af Parasite mobilitet og Blood Flow

The advent of intravital microscopy in experimental rodent malaria models has allowed major advances to the knowledge of parasite-host interactions 1,2. ...

Infection of Zebrafish Embryos with Intracellular Bacterial Pathogens

Infektion af zebrafisk embryoner med intracellulære bakterielle patogener

Zebrafish (Danio rerio) embryos are increasingly used as a model for studying the function of the vertebrate innate immune system in host-pathogen ...

Visualization of Bacterial Toxin Induced Responses Using Live Cell Fluorescence Microscopy

Visualisering af bakterielt toksin Inducerede Responses Brug af Live Cell Fluorescence Microscopy

Bacterial toxins bind to cholesterol in membranes, forming pores that allow for leakage of cellular contents and influx of materials from the external ...

Highly Resolved Intravital Striped-illumination Microscopy of Germinal Centers

Stærkt Løst Intravital Striped-belysning mikroskopi af kimcentre

Monitoring cellular communication by intravital deep-tissue multi-photon microscopy is the key for understanding the fate of immune cells within thick ...

Study of Phagolysosome Biogenesis in Live Macrophages

Undersøgelse af fagolysosomet Biogenese i Live makrofager

Phagocytic cells play a major role in the innate immune system by removing and eliminating invading microorganisms in their phagosomes. Phagosome ...

Visualizing Non-lytic Exocytosis of Cryptococcus neoformans from Macrophages Using Digital Light Microscopy

Visualizing Non-lytic Exocytosis of Cryptococcus neoformans from Macrophages Using Digital Light Microscopy

Visualisere Ikke-lytiske exocytose af<em&gt; Cryptococcus neoformans</em&gt; Fra Makrofager hjælp af digitale lysmikroskopi

Many aspects of the infection of macrophages by Cryptococcus neoformans have been extensively studied and well defined. However, one particular ...

Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood

Flowcytometrisk analyse of Natural Killer Cell lytisk aktivitet i humant fuldblod

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and ...

Visualizing Macrophage Extracellular Traps Using Confocal Microscopy

Visualisere makrofag ekstracellulære fælder ved hjælp af konfokalmikroskopi

A primary method used to define the presence of neutrophil extracellular traps (NETs) is confocal microscopy. We have modified established confocal ...

Saturated Fatty Acids Induce Ceramide-associated Macrophage Cell Death

Mættede fedtsyrer fremkalde ceramid-associerede makrofag celledød

Macrophages highly express epidermal fatty acid-binding protein and adipose fatty acid-binding protein. They actively uptake saturated and unsaturated ...